Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Om de lipide-eiwit interacties in een reductionistische manier bestuderen, is het noodzakelijk om de membraaneiwitten nemen in membranen van goed gedefinieerde lipidensamenstelling. We bestuderen de lipide-afhankelijke gating effecten in een prototype voltage-gated kalium (Kv) kanaal, en de gedetailleerde procedures voor het oplossen van de kanalen zijn uitgewerkt in verschillende membraan systemen. De reconstitutie die rekening houden beide detergent-geïnduceerde fusie van vesicles en het fusie-eiwit / detergens micellen van het lipide / detergens micellen en het van belang is om een ​​evenwichtsverdeling van lipiden bij de eiwit / reinigende / lipiden en detergens / lipide micellen. Onze data suggereerde dat het inbrengen van de kanalen in het lipide vesicles relatief willekeurig oriëntaties en de reconstitutie efficiëntie zo hoog dat er geen detecteerbare eiwitcomplexen werden bij fractionering experimenten. We hebben het reconstrueren benutd kanalen conformationele toestanden van de kanalen te bepalen in verschillende lipiden, opnemen elektrische activiteiten van een klein aantal kanalen opgenomen in vlakke lipide dubbellagen scherm conformatie-specifieke liganden van een faagweergegeven peptidebibliotheek en de groei van kristallen 2D van de kanalen in membranen. De reconstitutie hier beschreven kan worden aangepast voor het bestuderen van andere membraaneiwitten in lipide bilagen, met name voor het onderzoek van de effecten op de lipiden eukaryote voltage-gated ionenkanalen.

Introduction

Cellen wisselen materiaal en informatie met hun omgeving door de functies van specifieke membraaneiwitten 1. Membraaneiwitten in celmembranen functioneren als pompen, kanalen, receptoren, intramembranair enzymen, linkers en structurele supporters over membranen. Mutaties die de membraaneiwitten invloed zijn gerelateerd aan vele menselijke ziekten. In feite, hebben veel membraaneiwitten de primaire drug targets, omdat ze belangrijk zijn en gemakkelijk toegankelijk zijn in celmembranen. Het is daarom erg belangrijk om de structuur en functie van diverse membraaneiwitten in membranen begrijpen, en maken het mogelijk om nieuwe methoden te ontwikkelen om de nadelige gevolgen van de mutante eiwitten in menselijke ziekten te verlichten.

Lipiden surround alle membraaneiwitten geïntegreerd in dubbellagen 2, 3. In eukaryote membranen, worden de verschillende typen lipiden bekende georganiseerd in microdomains 4, 5.Veel membraaneiwitten werden verspreid worden bij deze microdomains en de omvangrijke fase van membranen 3, 6 vloeistof. Het mechanisme dat de organisatie van de microdomeinen en de levering van membraaneiwitten in hen en de fysiologische betekenis van dergelijke uitkeringen zijn uiteraard belangrijk, maar nog slecht begrepen. Een grote technische moeilijkheden bij het ​​bestuderen van de effecten op de lipiden membraaneiwitten is de betrouwbare reconstructie van biochemisch gezuiverde membraaneiwitten in membranen van goed gecontroleerde lipidesamenstelling zodat bijna alle gereconstitueerd eiwitten functioneel zijn 7. In de afgelopen jaren, hebben we het prototype voltage-gated kalium kanaal van A. ontwikkelde methoden te reconstrueren Pernix (KvAP) in verschillende membraan systemen voor structurele en functionele studies 8-10. De gegevens van anderen en ons samen gebleken dat de lipiden waarschijnlijk een determinant in conformationele veranderingen van de spanning-sensingdomeinen van een voltage-gated ionkanalen en kan de vorm van de structuur van sommige van deze kanalen 11. In het volgende zullen we een gedetailleerde beschrijving van onze methoden leveren en biedt kritische technische tips die waarschijnlijk zullen zorgen voor de succesvolle reproductie van onze resultaten, alsook de uitbreiding van onze methoden om de studies van andere membraaneiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Expressie en zuivering van KvAP kanaal (figuur 1)

  1. Voorbereiding Werk - Dag 0
    1. Spoel de glazen kolven voor de bacteriecultuur met gedemineraliseerd water (dih 2 O) en MilliQ H 2 O (MQH 2 O) om spoor van wasmiddel te verwijderen uit algemene afwassen.
    2. Autoclaaf 1000 ml LB-medium in 2.8 L erlenmeyers (totaal twee-liter cultuur als een voorbeeld hier). Lage hardheid van het water bleek belangrijk te zijn voor de succesvolle kweek van de getransformeerde bacteriën.
    3. Autoclaaf 100 ml LB-medium in 500 ml flesjes
    4. Transformeren 60 pi XL1-Blue competente cellen met 200 ng van het plasmide pQE60 dat het gen voor KvAP met een trombine knipplaats en een His6 label zijn C-terminus, de plaat twee bacteriën op LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline en incubeer ze gedurende 14-16 uur in een 37 ° C incubator.
  2. Expressie van KvAP - Dag 1
    1. Controleer de appearance van de bacteriële kolonies op de platen na incubatie overnacht. De koloniën waren meestal slechts ongeveer 0,2-0,5 mm in diameter, en er waren veel van hen. We willen niet de platen die grote kolonies omgeven door veel satelliet kolonies haven.
    2. Voeg 5,0 ml LB-medium aan elk LB-agar plaat gedurende de nacht en schroot uit de koloniën. Overdracht van de bacterie suspensie in 100 ml LB-medium geautoclaveerd in een kolf van 500 ml. Voeg ampicilline tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml, incubeer de kleine cultuur ~ 1 uur bij 37 ° C of totdat OD600 0,60 bereikt.
    3. In de tussentijd, plaats twee flesjes met 1,0 L medium in een 37 ° C incubator schudden om op te warmen het medium, en voor te bereiden 20 ml BaCl 2 (1,0 M; 10 mM eindconcentratie in elke 1.0 L cultuur), 2,0 ml 0,4 M IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) en 2,0 ml van 100 mg / ml ampicilline stock in water.
    4. Zodra de kleine cultuur klaar is, voeg 10 ml BaCl 2, 1,0 ml ampicillin voorraad, en 50 ml van de kleine cultuur van stap 1.2.2 op de voorverwarmde LB media. OD600 moet rond 0,05. Kijk mogelijke bevordering vanwege de hoge hardheid van het water en de tegenionen in LB media. Ba 2 + is bekend te binden aan het porie domein van het kaliumkanaal blokkeert en de ionenstroom en vermindert daardoor de toxiciteit van de hoog-niveau expressie van de kanalen om de bacteriën.
    5. Neem OD600 elk uur tot het bereikt 0.70, en elke vijftien minuten totdat het bereikt 0,8-0,9. In onze set-up, duurt het meestal ~ 5 uur tot 0,8 te bereiken.
    6. Voeg 0,40 mM IPTG aan de geïnduceerde expressie van eiwitten kanaal beginnen en incubeer de cultuur nog eens 4,0 uur bij 37 ° C met 225 rpm schudden.
    7. Oogst bacteriën in 1,0 liter flessen centrifuge door het draaien bij 4000 xg, 4,0 ° C gedurende 15 minuten. Schenk de supernatant zoveel mogelijk in een bekerglas afval, voeg 10 ml 1,0 M Na-fosfaat buffer al Ba 2 + precipiteren, en vervolgens eenkleine hoeveelheid bleekmiddel om bacteriën te doden. Houd de geoogste bacteriën in de centrifuge flessen begraven in het ijs in een 4,0 ° C koude kamer 's nachts.
  3. Zuivering van KvAP eiwit (Dag 2 en 3, figuur 1B)
    1. Resuspendeer de bacteriën pellet in 15 ml van IMAC lysebuffer per 1.0 L cultuur. Voeg -1,0 U DNase I, en drie proteaseremmers van leupeptine, aprotinine en pepstatine A bij 1,0 ug / ml. Het totale volume voor de twee-liter kweek was ~ 35 ml.
    2. Sonificeer de geresuspendeerde bacteriën in een metalen beker begraven in het ijs voor een totaal 10 min van ON-tijd. De microsonde sonicator werd in een 5 sec ON / 10 sec OFF-cyclus met een 40% uitgangsvermogen in een 4,0 ° C koude kamer. De vermogensinstelling afdruk is empirisch bepaald, zodat de meeste van de bacteriën werden gelyseerd zonder veel verwarming in de oplossing.
    3. Voeg 0,50 g n-Decyl-β-D-maltoside (DM Sol-Grade van Anatrace) in droog poeder om de gesoniceerde cellysaat en incuberen van het mengsel gedurende 30,5 uur bij kamertemperatuur (RT) met constante horizontale schudden (-100 rpm) om zoveel kanaalproteïnen extract mogelijk. Het is belangrijk ervoor te zorgen dat het detergens poeder volledig is opgelost gedurende een periode van 30-50 minuten.
    4. Na detergentextractie, celafval te verwijderen uit het lysaat door centrifugatie bij 20.000 xg gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens het wachten op het centrifugeren te voltooien, bereiden een His-tag-gebaseerde LC (lage-druk vloeistofchromatografie) kolom zoals beschreven in box 1.
    5. Laad het supernatant uit stap 1.3.4 op de voorverpakte IMAC (i mmobilized m etal ion een ffinity hromatography c) kolom met een stroomsnelheid van 1-2 ml / min die wordt aangedreven door een peristaltische pomp. Ook de geëxtraheerde His-gemerkt eiwit kan worden geïncubeerd met het IMAC hars ladingsgewijs binden.
    6. Was de IMAC hars door het uitvoeren van 5 bedvolumes IMAC wasbuffer en 10 volumes van IMAC wassen buff bedER plus 20 mM imidazol. Een in-line UV monitor wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat het wasgoed schoon.
    7. Elueer het eiwit door toepassing KvAP IMAC elutiebuffer die 300 mM imidazool. De meeste van de gebonden KvAP wordt geëlueerd 6 ml elutiebuffer door de kolom. Voeg trombine (1,0 U per 2-3 mg eiwit) in de gepoolde elutiefracties en incubeer het eiwit 's nachts op de bank te splitsen van het Zijn 6-tag.
    8. Op de volgende dag, concentreren de trombine-verteerd eiwit-oplossing in een Centricon (MWCO = 30K) omlaag tot 600 ul voor grootte-uitsluiting FPLC (fast proteïne vloeistofchromatografie). Tijdens het centrifugeren, meng het monster om de vijf minuten naar eiwitaggregatie minimaliseren. Omdat het eiwit wordt geconcentreerd, de lokale concentratie van het membraanfilter hoger wordt, en er soms helder witte neerslagen die anders zou kunnen verstoppen het filtermembraan. Ook de hoge concentratie van eiwitten (~ 5-10 mg / ml) aan de onderzijde van de concentrator tot een browafwerking kleuren en het mengen echt helpt om monster verlies te minimaliseren.
    9. Voer de geconcentreerde KvAP door een Superdex 200 kolom die vooraf geëquilibreerd met FPLC equilibratiebuffer. Typisch de piek van de tetramere KvAP kanaal DM elueert met een retentietijd van 12,3 ml. Er is een kleine achterste staart rond 13.6 ml, waarbij een kleine hoeveelheid monomeer KvAP heeft. De leegte van de kolom we gebruikten is op 7,0 ml, en meestal het monster leidt tot een kleine piek in de holte, die zeer weinig KvAP eiwit bevat. De imidazool komt aan het einde van de elutie (~ 24 ml). Voeg de fracties die KvAP tetrameren elkaar en concentreer de eiwitoplossing tot 0,5 ml. Bepaal de concentratie van het monster met een geschatte extinctie coëfficiënt (~ 1.2E-5,0 M -1 cm -1, die werd berekend op basis van het aantal aromatische resten) van KvAP bij 280 nm [ref 12, URL: http:// web.expasy.org / protparam /].
      Bij kamertemperatuur werd het gezuiverde KvAP in DM is stabiel gedurende tenminste een week zonder aanzienlijk verlies van eiwit. Bij 4 ° C, kan het nog langer duren. Bevriezen nooit het eiwit in wasmiddelen. Aanbevolen wordt om het eiwit te slaan in DM bij 4 ° C, en het eiwit in β-OG bij kamertemperatuur. Maar we normaal gesproken niet te wachten, en ga verder met de reconstructie stap direct na de eiwitten zijn klaar.
    10. Assay de monsters in een 12% reducerende SDS-PAGE gel.
      De monsters van elke stap hierboven beschreven werden bereid door de 20 microliter monsters van de 5x SDS-monsterbuffer (Tabel 3 voor de buffers) aangevuld met 1,0% β-ME. De monsters werden niet gekookt. Na gels klaar waren, de monsters meestal in de SDS-buffer al meer dan 10 min bij kamertemperatuur. Nadat de gel werd gerund en gekleurd met Coomassie blauw, het wild-type KvAP kwam als een enkele band bij ongeveer 26 kDa (Figuur 1B

2. Ion Channel Wedersamenstelling

2.1. Liposoompreparaat en detergent-geïnduceerde fusie van vesicles

Voorafgaand aan de lipide voorbereiding, was een 14 ml wegwerp glazen reageerbuis, een schroef bedekte glazen buis, en een 250 ul glazen injectiespuit met chloroform. Giet ~ 10 ml chloroform in de testtube.

  1. Bereiding van palmitoyl-oleoyl-fosfatidylethanolamine (POPE) en palmitoyl-oleoyl-fosfatidyl-glycerol (POPG) liposomen.
    1. Overdracht van 3.75 mg PAUS en 1,25 mg POPG (PAUS: POPG = 03:01 gewichtsverhouding) in chloroform in de pre-gereinigde schroef bedekte glazen buis en droog de lipiden onder een continue stroom van argon gas. Als er geen zichtbare chloroform overblijft, drogen lipide verder onder vacuum ruimte een uur.
    2. Voeg 440 ul van laag zout-buffer (10 mM HEPES, pH 7,4) Of water in de droge lipide en vortex de buis te hydrateren de lipiden. De lipidesuspensie ziet er wittig en troebel.
    3. Ultrasone trillingen het lipide suspensie in een ijskoud badsonicator totdat het blaasje oplossing wordt doorschijnend (OD410 <0.2).
      Typisch voor de 10 mg / ml PAUS / POPG oplossing in water of een buffer met laag zoutgehalte, we bedienen de sonicator met 30 sec ON en 30 sec OFF (op ijs) voor een totaal van 15-20 minuten. Vanwege de warmte die tijdens sonicatie, is het raadzaam om 1,0 mM DTT toe te voegen in de lipide oplossing om lipide oxidatie te minimaliseren, en het bassin van de sonificator afkoelen tot 10 ° C of lager. De uiteindelijke OD410 is lipide-afhankelijk. Voor bepaalde lipiden kan het heel moeilijk zijn om zulke lage OD bereiken. Als dat gebeurt, we meestal gebruik van reinigingsmiddelen om volledig oplosbaar de lipiden en laten de lange incubatietijd om goede verdeling van lipiden bereiken rond het eiwit bevattende micellen (zie volgende).
      Een hoge-capaciteit badsonificeerinrichting belangrijk in ordER te bereiken OD410 <0.2. We zijn met behulp van een systeem gemaakt door Laboratory Supplies Co, Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY). De sleutel voor de goede sonicatie van de vesicles is ervoor te zorgen dat de resonante centrum in het midden van de buis sterke trillingen. De trilling is afhankelijk van de hoeveelheid water en dus kan worden aangepast. Ook is empirisch vastgesteld dat verhoogde viscositeit van het water door toevoeging van een kleine hoeveelheid glycerol de werkzaamheid van de ultrasoonapparaat kan verbeteren.
      Als alternatief hebben we gevonden dat het gebruik van een microprobe sonicator in contact met de lipide suspensie in een plastic of metalen buis dezelfde resultaten kan produceren. De microsonde moet worden schoongemaakt en slechts het topje is onderdompelen in de lipide-oplossing. Omdat de lipidendeeltjes worden in stukken gebroken op het oppervlak van de microprobe, is het zeer belangrijk het monster gekoeld te houden, en hebben een aantal reductiemiddelen om de oxidatie van de onverzadigde lipiden voorkomen.
      Onder cryo-electron microscopy, de meerderheid van de gesonificeerde unilamellaire vesicles 30-50 nm in diameter (gegevens niet getoond). De kromming van de kleine SUV is zo hoog dat een kleine verstoring is bij de levendige fusie van deze blaasjes induceren tot grotere die 80-200 nm in diameter (zie volgende).
    4. Voeg 50 ul van 3,0 M KCl en 10 ui 0,50 M DM aan het mengsel zodat het uiteindelijke lipide suspensie 300 mM KCl en 10 mM DM. Incubeer de oplossing met horizontale rotatie gedurende 2 uur bij RT lipide / detergent gemengde micellen. Na de incubatie moet de suspensie een beetje troebel (figuur 2A), die door de detergens-geïnduceerde fusie van de kleine unilamellaire vesicles worden.
    5. Wanneer het eiwit wordt geconcentreerd tot meer dan 2,0 mg / ml en 0,50 mg eiwit KvAP, 50 pl 3,0 M KCl, 16 pl 0,50 M DM stock in water en 10 mM HEPES, pH 7,4 aan de lipide / detergens mengsel maak 1 ml eindvolume. De uiteindelijke lipide-eiwit gewichtsverhouding 10:01en de eindconcentratie van DM 18 mM (Figuur 2A). Incubeer de eiwit / lipide / detergens mengsel in de glazen buis met horizontale rotatie gedurende 2 uur.
      De keuze van het detergens concentratie wordt geleid door de detergens-geïnduceerde vesikel fusie en vesicle oplosbaar 13. Wanneer de vesicles worden gevormd door sterke sonicatie, de gemiddelde diameter in het traject van 30-50 nm, EM. Deze blaasjes hebben een zeer lage verstrooiing bij 410 nm. Bij lage concentraties, zijn wasmiddelen eerst ingebracht in de vesicles, destabiliseren de vesicles, en induceren de fusie van detergens-verzadigde vesicles (OD410 omhoog gaat, zie figuur 2A). Vesikel fusie leidt tot de toename van de OD410 nm. Voor 10 mg / ml PAUS / POPG blaasjes, de OD410 pieken op ongeveer 15 mM DM. Wanneer meer wasmiddelen worden geïntroduceerd, de blaasjes beginnen te breken in stukken en de lipiden raken verdeeld in detergent / lipide gemengde micellen. Dit laatste gaat gepaard met hetafname van OD410 beneden tot een definitieve laag niveau (<0,1).
      Door de actieve celfusie in de stijgende fase van de optische dichtheid vanwege de detergens-geïnduceerde fusie van kleine blaasjes, is het zeer waarschijnlijk dat het eiwit / detergens-micellen actief worden gefuseerd met het wasmiddel-verzadigde lipide vesicles. Dat is de reden voor de keuze van 18 mM DM bij de bereiding van de eiwit / lipide / wasmiddelmengsel. Als het detergens wordt geconcentreerd met meer dan 4 vouwen, de hoeveelheid DM behoeften worden aangepast zodat de uiteindelijke concentratie nog ongeveer 18-20 mM. Wanneer het eiwit opbrengst erg laag is, is het moeilijk te beoordelen hoeveel geconcentreerde detergentia zijn in het monster, zouden we in plaats daarvan het eiwit te mengen met volledig oplosbaar lipiden en gebruik de volledig uitgebalanceerde samenstelling voor reconstitutie. In onze handen, als er niet voldoende tijd liet een goede evenwichtsverdeling van de lipiden tussen eiwithoudende en eiwitvrij micellen, de reconstitut bereikenion-efficiëntie aanzienlijk gedaald. We testen meestal de reconstitutie efficiëntie door twee experimenten: 1) onderzoekt de co-migratie van het eiwit met het blaasje fractie in een sucrose-dichtheidsgradiëntcentrifugatie; 2) halen de eiwitten uit de gereconstitueerde blaasjes, en fractioneren ze in een gel- filtratiekolom te vinden hoe veel eiwit (KvAP in ons geval) nog worden tetramerische. Minimale incubatietijd van de eiwit / lipide / detergentia een paar uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 graden.
      Voor een nieuw membraaneiwit dat stabiel is in een ander detergens, de eerste stap is het vinden van de eigenschap solubilisatie van lipiden door een dergelijke detergens, vergelijkbaar met wat wordt getoond in figuur 2A. Vervolgens is het wenselijk te beginnen met de PC extracten, zoals E. coli polaire extract PC, de soja PC extract etc, zodat als de protein heeft bepaalde fosfolipiden voor zijn functie, kan het reeds in de winningted lipidemengsel.
  2. Bereiding van de KvAP gemengd met detergens gesolubiliseerde 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propaan (DOTAP) of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-succinaat (DOGS) --- een voorbeeld van volledige solubilisatie lipide voor reconstitutie
    1. Het lipidepreparaat is hetzelfde als voor POPE / POPG vesicles. De ultrasoonapparaat van gehydrateerde lipiden in kleine unilamellaire blaasjes heeft langere tijd (meestal 45-60 min) dan PAUS / POPG lipiden (gewoonlijk 5-10 min). De HONDEN blaasjes kan langzaam versmelten met elkaar en vormen kleine oliedruppels.
      Omdat het moeilijk is in het maken van hoge kwaliteit SUV's uit DOTAP en DOGS reproduceerbaar, we meestal oplosbaar deze twee lipiden volledig vóór het mengen met de eiwitten.
    2. Om de DOTAP of DOGS volledig oplosbaar, worden de gesonificeerde vesicles gemengd met 10 mM DM en 40 mM n-octyl-β-D-glucoside (β-OG). De lipide / detergens wordt een nacht geïncubeerd (> 15 uur)bij kamertemperatuur, en het mengsel mag geen kleine deeltjes of druppeltjes. Maar het is vrij duidelijk. Het niet volledig evenwicht te bereiken in deze stap leidt tot de vorming van een significante fractie van multilamellaire vesicles.
    3. Meng de KvAP eiwit met het detergens oplosbaar gemaakte DOTAP of DOGS in een eiwit: lipide-verhouding die kleiner is dan of gelijk aan 01:10. De eiwit / detergens / lipide mengsel geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 2-3 uur met eind-over-eind rotatie.

2.2. Verwijdering van de wasmiddelen tot proteoliposomen vormen

  1. Dialyse --- langzame verwijdering van de detergentia, zoals DM en β-OG, dat relatief hoge kritische micel-concentratie (CMC ≥ 1,0 mM) hebben
    Bereid 2-liter dialyse buffer (tabel 3) per 1,0 ml mengsel.
    Knip een geschikte lengte van dialyseslang (MWCO = 10K; 0.70 cm breed), en was het met DI-water. Het is belangrijk om te controleren enervoor dat er geen lekken in de slang. Voor gevoelige monsters, kan de buis eerst worden behandeld met een buffer van 10 mM Tris-HCl pH 8,0 en 2,0 mM EDTA, en vervolgens in kokend water gereinigd worden gedurende 3-5 minuten. De buis wordt dan ingeklemd aan een uiteinde en gespoeld met de buffer dialyse.
    Laad de eiwit-lipide-detergens mengsel in een dialysebuis. Klem beide uiteinden van de buis met minimale ruimte linksboven de oplossing. Zet de geladen slang in de dialyse buffer, en gebruik een roerend plaat zodat de slang draait langzaam in oplossing. Wijzig de dialyse buffer om de 8 uur. Na de eerste buffer veranderen, moet de oplossing troebel worden als de eiwit-lipide-detergensmengsel was volkomen duidelijk. Als de dialyse te snel, kunnen er witte vaste precipitaten onderaan de dialysebuizen. Aanbevolen wordt ten tijde van buffer te veranderen, de slang moet ingewreven en omgekeerd meerdere keren. Na vijf stel dialyse buffer, de vesicles meestal klaar.
    Wij controleren de resterende hoeveelheid detergenten door schieten de blaasjes op de lipidebilaag. Als er nog steeds aanzienlijke hoeveelheid detergenten verlaten, de dubbellaag wordt bijna onmiddellijk verbroken. Het is ook mogelijk om de zeepresten meten met colorimetrische methode of het meten van de oppervlaktespanning van de vesicle suspensie.
  2. Het gebruik van polystyreen parels te helpen wasmiddelen die lage CMC hebben verwijderen
    In veel gevallen moeten we lage CMC detergentia, zoals DDM (CMC ~ 0.17 mM in water) gebruikt. Kralen met kleine hydrofobe poriën worden gebruikt om deze reinigingsmiddelen verwijderen 14.
    1. Bereiding van de kralen. Gewicht uit 0,5 g droog kralen en leg ze in een ml Corning buis 50, voeg 20 ml methanol, ultrasone trillingen de oplossing in een badsonicator gedurende 5 minuten om ingesloten luchtbellen te verwijderen, spin down de kralen bij 5000 rpm gedurende 5 minuten, en daarna decanteren meeste methanol. Herhaal het wassen met ethanol en MilliQ water. De gewassen korrels worden opgeslagen in 20% ethanol bij 4 ° C, enmoeten worden veranderd in een detergens-vrije buffer vóór gebruik.
    2. Inschatten dat de reinigingsmiddelen in de eiwit / lipide / detergens te behandelen mengsel en berekent de hoeveelheid korrels nodig detergentia te verwijderen. Voor DDM en DM, de bindingscapaciteit ongeveer 100 mg korrels voor 10 mg detergentia. De natte korrels zonder overtollige water worden afgewogen, en direct toegevoegd aan het eiwitmengsel. Minstens 15-20 minuten is nodig voor de korrels volledig effectief te zijn en de daling van detergensconcentratie een gelijkmatig 14-16 bereikt. 8,7 mg DDM (dodecyl-maltoside) in 1,0 ml oplossing, overeenkomend met ~ 18 mM, in totaal 87 mg polystyreen kralen, zoals Bio-Beads SM2 verwijderen, wordt in vijf gelijke hoeveelheden. Meng de eiwit / lipide / detergensmengsel met elke fractie gedurende 20-30 min met een constante end-over-end rotatie bij kamertemperatuur spin down de kralen, dragen de supernatant van de volgende fractie van kralen, en herhaal tot het einde.
      Wanneer het wasmiddel concentratie zijn CMC bereikt, hebben we het de tijdsperiode verlengen die een uur, zodat de kleine hoeveelheid detergentia in de oplossing de fusie van kleine blaasjes in grote bedrijven vergemakkelijkt.
    3. Om het spoorhoeveelheid wasmiddelen na de laatste stap te verwijderen, voeg 35 mg Bio-Rad SM2 kralen en incubeer met de blaasjes voor 4 uur.
      Bij de wijze van detergensverwijdering hierboven beschreven worden toegepast op een nieuw eiwit, het algemeen raadzaam om te beginnen met het eiwit / lipide-verhouding (gew / gew) van ~ 01:10. De lipide / detergens mengsel zorgvuldig moet worden voorbereid, zodat er voldoende detergentia toegevoegd lipiden (figuur 2A) volledig oplosbaar. Het is belangrijk om de lipide-detergens mengsel geïncubeerd gedurende meer dan 2 uur bij kamertemperatuur (met 1-2 mM DTT) onder constant schudden (400 rpm) of end-over-end rotatie. Wanneer het eiwit wordt gemengd met lipiden, moet de eiwit / lipide / detergens mengsel geïncubeerd lang genoeg (overnight indien het eiwit stable) bij hetzij kamertemperatuur of in een koude kamer, zodat de verdeling van detergentia en lipiden tussen de eiwit-bevattende micellen en eiwitvrij micellen relatief gelijk. Bovendien, als snelle verwijdering van detergentia met BioBeads wordt gebruikt, is het belangrijk om te weten de detergent-bindingscapaciteit van de korrels. De langzame verwijdering van detergentia waarschijnlijk ervoor dat de eiwitten voldoende lipiden zullen hun integriteit behouden en worden ingebracht in relatief omvangrijke vesicles.

2.3. Opslag van de proteoliposome en de kwaliteitscontrole

  1. Zodra de blaasjes zijn klaar, bereiden ze in 50 ul fracties en flash-bevriezing van de monsters door direct storten in vloeibare stikstof. De bevroren vesicles worden dan opgeslagen in een -80 ° C vriezer. Voor biochemische assays, gebruiken we geen bevroren blaasjes omdat de vries-dooi cyclus soms werd gevonden om artefacten te introduceren in onze cys-specifieke reactie. Voor elektrische opnames, we alleen vesicles die zijn opgeslagen in -80 ° C gedurende minder dan 6 maanden.
  2. Flotatie van de vesicles in een dichtheidsgradiënt (figuur 2B)
    1. Plaats 50 gl van de vesicle suspensie bovenop de lagen van sucrose gradiënt met 0,3 ml elk van 10, 35 en 55% sucrose in 10 mM HEPES en spin bij 200.000 g gedurende 4 uur bij 4 ° C. Langzaam versnellen en vertragen de verstoring van het grensvlak tussen de lagen te vermijden.
    2. Verzamel 100 pi fracties van boven naar beneden en lopen ze op niet-reducerende SDS-PAGE (Figuur 2B). De KvAP goed gekleurd met Coomassie blue zodat een band van 0,5-1,0 microgram eiwit duidelijk zichtbaar. De KvAP eiwit moeten worden gevonden op het raakvlak tussen de 10 en 35% sucrose. Geen zware aggregaten van eiwitten worden gezien bij de hoge dichtheid bereik, wat aangeeft dat vrijwel alle eiwitten in de membranen.
  3. Controleer de juiste conformatie van de KvAP kanaal in blaasjes. <Br /> vastgestelde Onze eerdere gegevens die een cysteïne mutant (L125C/C247S) KvAP bij correcte integratie in dubbellagen, volledig begraven in membranen, en kan niet worden geopend door cysteine-specifieke reagentia 8. De reconstitutie procedures werden getest met deze mutant kanaal, en gecontroleerd door een Cys-specifiek reagens, MTS-PEG5000. De modificatie bij L125C met 1,0 uM MTS reagens op kamertemperatuur introduceert een 5 kDa verschuiving naar de KvAP band in een niet-reducerende SDS-PAGE gel. Succesvolle implementatie van onze reconstitutie procedures moeten leiden tot geen waarneembare reactie voor de L125C mutante kanalen in fosfolipidenmembranen, suggereert bijna volledig inbrengen van alle kanalen in dubbellagen. Als een positieve controle van de reactie is 5,0 mM DM ingevoerd om vrijwel alle L125C residuen in de mutant kanalen toegankelijk voor de MTS reagens maken.
    Alternatief poriëngrootte bindende toxine, zoals chrybdotoxin kan worden gebruikt om de tetramere kanalen tellen. Een antilichaam-gebaseerde bindendzeggen (zie Kader 2, waar Fv wordt bereid als een conformatie-specifiek ligand voor KvAP) kan worden gebruikt om de beschikbare bindingsplaatsen in het gereconstitueerde blaasjes kwantificeren. Deze bindingstests kan dan worden vergeleken met een kwantitatieve test meet de totale hoeveelheid eiwit in om te achterhalen welk deel van de gereconstitueerde kanalen zijn tetramers en welke fractie van het eiwit heeft de voltage-sensor peddel (S3/S4 van de spanning sensor) goed gevouwen.
    Voor andere eiwitten worden aangemaakt, is het raadzaam om een ​​kwantitatieve methode te evalueren welke fractie van de opgeloste eiwitten correct gevouwen voeren. Zorgvuldige functieonderzoek is dus een voorwaarde voor de ontwikkeling van goede kwaliteitscontrole voor succesvolle reconstitutie.

3. Toepassingen van de gereconstitueerde Channel-bevattende blaasjes

3.1. Functioneel onderzoek van het ionkanaal activiteiten zwarte lipidemembranen.

Bereiding van needed materialen.

  1. Lipidepreparaat
    1. Reinig een glazen proefbuis, een amberkleurige flacon met Teflon-opgedoken schroefdop, en een set van glazen spuiten met chloroform. Droog de amberkleurige flesje onder een stroom van argongas.
    2. Transfer 0,75 mg PAUS en 0,25 mg POPG in chloroform in het bruin flesje en verdampen van het chloroform met argon gas.
    3. Was de gedroogde lipiden met 0,20 ml pentaan, en droog volledig om de resterende chloroform te verwijderen. Eindelijk oplossen van de lipiden in 50 ul decaan. De lipiden in decaan (20 mg / ml) wordt gebruikt voor het schilderen van een lipide bilaag in een 150-250 micron gat (Figuur 3B) geboord in het verdunde gedeelte aan een zijde van een experimentele bilaag kop (figuur 3A).
  2. Oplossing voorbereiding
    1. Intracellulaire oplossing (trans): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 15 mM KCl
    2. Extracellulaire oplossing (cis): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 150 mM KCl
    3. Zoutbrug: Bend glas haarvatenin U-vormige bruggen, en vul ze met 1,0% gesmolten agar opgelost in extracellulaire oplossing.
      De osmotische gradiënt tussen de trans-en cis-oplossingen werd gevonden om de belangrijkste drijvende kracht voor de vesikel fusie op de lipidedubbellaag 17 zijn. Voor negatief geladen lipiden, 15 mM CaCl 2 of positief geladen poly-Arginine peptiden bleken kunnen celfusie induceren. Fusogene lipiden, zoals DOTAP en DOGS, etc, kunnen worden ingevoerd in de lipide vesikels zodat de kans op celfusie hoger.

Elektrische opnames van KvAP kanalen in lipidedubbellagen

  1. Pre-verf de ronde gaten (diameter -0,25 mm) die wordt geboord cilindrische oppervlak van de bilaag kop (figuur 3B). De lipiden worden overgebracht met een capillaire stamper die in het lab. De ronde kop van de capillaire stamper is gepolijst en heeft geen krassen op het oppervlak van de beker. The kleine hoeveelheid lipiden met capillaire stamper uitgevoerd is verspreid rond het gat in de bilaag beker en lucht gedroogd.
  2. Wacht tot 1-2 min, zodat de decaan volledig zal verdampen. Zorg moet worden genomen om de lipideoplossing vermijden om in het gat.
  3. Plaats de beker in de opname kamer, en zet in de zoute bruggen en verbind de elektroden met de twee kanten van de opname kop (figuur 4A). Voeg de cis-en trans-oplossing die voor beide zijden van het gat. Een osmotische gradiënt wordt gevestigd op de fusie van blaasjes in de lipide bilaag vergemakkelijken.
  4. Stel de mogelijke verschuiving tussen twee zijden van de beker ~ 0 (gewoonlijk <2 millivolt). Gebruik de capillaire stamper om een ​​kleine hoeveelheid van lipidemengsel in decaan overdragen, en verf de lipide over het gat totdat een bilaagmembraan vormen. De vorming van de dubbellaag wordt gedetecteerd door het opnemen van de ic in de levering van een helling puls.
  5. Wacht tot het membraandunner en wordt relatief stabiel. We wachten tot er geen verandering in de membraancapaciteit voor 3-5 minuten.
    De algemene gedachte over vlakke dubbellaag gevormd over een groot gat is dat het middengedeelte van het membraan dicht worden ~ 4,0 nm dik als een gewone bilaag en het membraan dikker wanneer het wordt dicht bij de rand van het gat, wanneer er een annulus rond en de meeste decaan oplosmiddel 18, 19. Het is onvermijdelijk dat er resterende decaan links in het centrale gedeelte van de bilaag membraan. Past raming van de volumeverhouding van n-decaan versus PC was 0,35-0,45 na de verdunning van de dubbellaag 18, 20-22. EM onderzoek van de verdunde bilaag bleek dat er lenzen decaan ingeklemd tussen de twee bladen van een dubbellaag 22. Deze gegevens suggereerden dat de membraaneiwitten ingebracht in de lipide bilaag membranen bestaan ​​naast kleine eilandjes (maximaal 50 nm in diameter) decaan. De overblijvende decaan in de dubbellaag vermindert ook het elektrisch vermogen constant 0,4-0,5 uF / cm 2, die kan worden gebruikt om een ruwe schatting van de omvang van de verdunde bilaag basis van de gemeten capaciteit te verkrijgen. Een dubbellaag van 100 pF condensator komt uit een cirkelvormige dubbellaag membraan van ~ 180 urn in diameter.
    Voor KvAP, heeft de resterende decaan geen afbreuk doen aan de voltage-afhankelijke gating, ook al is het kanaal functie niet zorgvuldig is in een oplosmiddel-vrije dubbellaag onderzocht. Hetzelfde bleek te gelden voor de NaChBac kanalen en Kv1.2 kanaal ingebracht in de BLMs 23. Het is nog onduidelijk of het een aanzienlijke links-shift van de GV-curve gemeten vanaf de Kv1.2 kanalen in de decaan-lipidendubbellaag opzichte van kanalen in eicellen heeft iets te maken met de resterende decaan 23. Afhankelijk van de lipiden in het vormen van de bilagen, kan de hoeveelheid resterende decaan in de bilaag variëren. Bijvoorbeeld werd gemeld dat de vorming van vlakke lipide membranes van MGDG (mono-galactosyl-diacylglycerol) vereist decaan, mogelijk als gevolg van de spleten tussen de conische MGDG gevuld met decaan moleculen. Of de resterende decaan heeft effecten op de eiwitten te bestuderen is puur empirisch, en de experimentele test is nodig om te zeggen of het effect significant is of niet.
  6. Zodra het membraan stabiel, schiet 0,5-1,0 pl channel-bevattende vesicles door het zo smalle punt van een P2-pipetpunt recht boven het gat. De vesicles vallen in het gat aan de onderzijde van de cup.
    Tijdens dit proces, verschillende vesicles worden gehecht aan het membraan in het gat. Voldoende tijd, sommige versmolten in de bilaag gedeelte om een ​​klein aantal KvAP kanalen correct zijn aangebracht in de vlakke bilaag in het midden van het membraan. Zowel osmotische gradiënt en elektrostatische interacties zijn belangrijk in de fusie van de blaasjes in de lipide bilagen 17, 24.
  7. Om te testende KvAP kanalen in de dubbellaag, wordt een korte puls van 80 mV verlost van de holding potentieel van -80 mV. Door de snelle inactivatie en langzame herstel van inactivatie, een lang interval (~ 120 sec voor kanalen in PE / PG membranen) wordt gegeven tussen twee pulsen. Een typische huidige opname van de kanalen in een PAUS / POPG membraan wordt getoond in figuur 3C. Als de huidige is klein en schieten meer blaasjes. Zodra de stroom er goed in grootte, de balans van de ionenconcentraties in de oplossingen aan beide zijden van het membraan. De kanalen zijn klaar voor elektrofysiologische experimenten.

3.2. Screening voor exterieur-specifieke liganden tegen kanalen in blaasjes

  1. Introductie van de faag-display bibliotheek.
    De faag-display 20-mer peptide bibliotheek aanwezig op de N-terminus van de vijf kopieën van pIII eiwitten aan een uiteinde van de filamenteuze bacteriofaag fd-tet 25. De bibliotheek presenteert ca. 1 x 10 8 verschiltlende vormen van willekeurige 20-meer peptide sequenties, en werd vriendelijk om ons verschaft door het laboratorium van Dr Kathlynn Brown's aan de UT Southwestern Medical Center 26. De faag infectie in de E. coli K91 maakt de bacteriën resistent tegen 12 ug / ml tetracycline.
    Een gedetailleerde procedure voor de bacteriecultuur, is de versterking en titreren van de fagen en de volgorde van de faag kolonies werden beschreven door McGuire, et al.. 26 We zullen een korte beschrijving van de basisbewerkingen in de volgende paragraaf geven. De lezers kunnen meer details in de McGuire papier vinden. Wij zullen in plaats daarvan gericht op de isolatie van klonen die specifiek binden stevig ionenkanalen gereconstitueerd in vesicles (figuur 4A).
    Het basisidee achter ons scherm is dat de fagen gebonden aan het opgeloste kanalen specifiek naar beneden met de blaasjes kan worden getrokken. De gebonden faag worden geamplificeerd en getoetst aan de kanalen in lipide membranen. Onze studiede conformationele verandering van KvAP spanning sensoren in verschillende lipidemembranen 8 gebleken dat het mogelijk is om de spanning in beide sensors "geactiveerd" of "rust" land houden door het schakelen van de lipiden van reguliere fosfolipiden die zonder fosfaten in de kopgroep gebieden bevatten (DOTAP en DOGS in onze experimenten). Deze twee lipide bepaalde conformaties worden gebruikt in onze screening van conformatie-specifieke liganden. De faagbank wordt eerst verzadigd door de kanalen in de fosfolipide vesicula (negatieve selectie) voor hernieuwde geselecteerd strak bindmiddelen om de kanalen in DOTAP en DOGS membranen (positieve selectie).
  2. Basic procedures achter de faagselectie
    Groei K91 bacteriën in LB medium: De verdubbelingstijd van de bacterie is ongeveer 20 minuten bij 37 ° C met 200 rpm schudden.
    Versterking van de bibliotheek: Meng de faagoplossing met de bacteriën K91 op OD0.4. Na 15 min incubatie bij 37° C, het mengsel gelijkmatig uitgespreid op -9,5 x 9,5 cm 2 agarplaten die 12 ug / ml tetracycline, het gebruik van grote platen voorkomt dominantie van de cultuur door bacteriën die hogere groeisnelheid hebben. Wanneer de diversiteit van de bibliotheek kleiner zijn 10-cm Petrischalen voor het selecteren en kleinschalige amplificatie.
    Grootschalige amplificatie van afzonderlijke klonen: Inoculeer een kleine hoeveelheid van fagen (~ 100 miljoen) in 250 ml LB plus 5 mM MgSO 4 en 12 ug / ml tetracycline, Grow nacht bij 37 ° C. Verzamel cellen door centrifugeren 6.000 rpm gedurende 10 minuten. Verzamel de bovenstaande vloeistof en voeg dan in 0,2 vol / vol de precipitatie buffer (2,5 M NaCl, 20% PEG8000). Na incubatie op ijs gedurende 1,0 uur werd de oplossing gecentrifugeerd bij 17.000 xg gedurende 30 min om pellet alle fagen. Verwijder alle supernatant, voeg 1,0 ml PBS, incubeer op ijs gedurende 30 min voorzichtig resuspendeer de pellet (geen vortexen). Spoel de suspensie naar een nieuwe buis en centrifugeer bij 14,000 rpm gedurende 2 minuten. Breng de supernatant andere buis en incubeer bij 65 ° C waterbad gedurende 15 minuten om alle bacteriën te doden. Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 13.000 rpm. Gooi de pellet, hoeveelheid en bewaar de faag-oplossing bij -80 ° C.
  3. Panning van de fagen tegen KvAP kanalen in lipide blaasjes.
    1. De peptide-weergave fagen moeten worden geamplificeerd en getitreerd voor onze experimenten waardoor het aantal fagen per volume-eenheid bekend. KvAP werd opgelost in PAUS / POPG (03:01) plus 0,50% biotine-DOPE blaasjes als negatieve controle, en in DOGS: biotine-DOPE (199:1; Hetzelfde werd gedaan voor DOTAP blaasjes) wordt gebruikt als de selectie doelwit. De eindconcentratie van KvAP in vesicles 0,50 mg / ml, en de lipiden 5,0 mg / ml. De panning buffer bevatte 500 mM KCl, 100 mM HEPES / KOH pH 7,4 en 0,10 mg / ml BSA.
      Voor de eerste run, werden ~ 10 10 fagen (100 exemplaren voor elk type) verdund tot 0,050 ml LB-medium. Voor de daaropvolgende panning stappen, de starting faag werd ingesteld op binnen 10 juni-10 augustus.
    2. Negatieve selectie:
      Incubeer de verdunde fagen in 50 pi LB met 100 ul neutravidine agarose kralen (kan binden 1-2 mg gebiotinyleerd BSA per ml hars, Pierce) in 1,0 ml buffer panning. Na 10 min incubatie, scheidt de kralen door het draaien ze bij 100 xg gedurende 1,0 minuten. Herhaal deze stap tweemaal om alle fagen die direct binden aan de kralen te verwijderen.
      Meng de overgebleven fagen uit de vorige stap met 50 ul lege blaasjes (PAUS / POPG plus 0,5% biotine-DOPE) dat er geen eiwitten bevatten. Voeg 100 ul neutravidine kralen die zijn gewassen met de buffer panning het faag-mengsel vesicle. Na het roteren van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, verwijder de kralen met 100 x g centrifugeren gedurende 30 sec. Deze stap wordt herhaald voor lege vesicles DOGS: biotine-DOPE (199:1) en voor KvAP kanalen in POPE / POPG vesicles (met 0,5% biotine-DOPE). De bovenstaande vloeistof na deze behandelingen containersns het volledig ontruimd fagen. Na de eerste twee cycli scherm, kon de preclearance alleen worden uitgevoerd tegen KvAP in PAUS / POPG blaasjes.
    3. Positieve selectie
      Incubeer de volledig gewist fagen met KvAP kanalen DOGS: biotine-DOPE (199:1) vesicles (hetzelfde voor de DOTAP vesicles) in aanwezigheid van 100 ul neutravidine korrels bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng het volume van het mengsel tot 15 ml met de panning buffer vóór centrifugatie bij 100 xg gedurende 10 minuten. Verzamel de kralen, en was ze drie maal met 45 ml panning buffer.
    4. Resuspendeer de kralen in 500 pi LB-medium dat 5,0 ug / ml biotine, en incuberen van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende twee uur om een ​​aantal van de gebonden fagen van neutravidine die lagere affiniteit dan de natuurlijke biotine is vrij. Scheid de kralen met 100 xg draaien gedurende een minuut. Verzamel de bovenstaande vloeistof en de kralen in twee verschillende buizen voor het titreren.
    5. Om de geselecteerde fagen, m versterkenix 200 pl van het supernatant of het geresuspendeerde kralen in de laatste stap met 500 ul K91 bacteriecultuur (OD600 ~ 0.4-0.6, gekweekte ~ 4 uur vóór gebruik). Na incubatie bij 37 ° C gedurende 15 min, plaat 50 pi van elke op tetracycline platen overnacht cultuur.
      Tijdens de eerste twee cycli scherm (figuur 4A), verzamel alle 500 pi supernatant en de kralen uit de laatste stap, meng ze met de 5 ml bacteriecultuur, en plaat ze in 9,5 inch vierkante platen om te herstellen en te versterken alle faag kolonies . Deze stap is belangrijk voor het herstellen van de fagen die maken de bacteriën langzamer groeien dan andere.
    6. De kolonies van de platen geamplificeerd en getitreerd voor de volgende cyclus van panning en selectie (zie McGuire, et al.., 26).
    7. Onderzoekt de activiteiten van de positief geselecteerde fagen op de kanalen.
      Na 10-12 cycli van selectie, test de totale versterkte fagen op de KvAP kanalen in lipide bilayers gemaakt van PAUS / POPG. Indien er een significante fractie van positieve klonen, dienen de geselecteerde fagen bij 100-500 nm een aanzienlijk deel van de kanalen te blokkeren in de bilaag (figuur 4B) aangezien we selecteren tegen kanalen gestabiliseerd in de rusttoestand. De positieve gegevens suggereren dat er klonen die sterke binding zal tonen om de kanalen in de rusttoestand. Na 16 cycli van selectie, kies 50 positieve kolonies voor single-kolonie sequencing. De geïdentificeerde overheersende faag klonen worden gekozen uit de sequenties te vergelijken, en worden versterkt en getoetst kanalen bilagen. Zodra de positieve klonen worden bevestigd, synthetiseren de peptiden door de sterke positieve klonen uitgevoerd en test ze op de kanalen en hun conformatie-specifieke activiteiten te bevestigen.

3.3. Kristallisatie van KvAP kanalen in membranen voor structuurbepaling 27-29

  1. Om de conformatie van stabiliserenhet kanaal, een conformatie-specifieke binder van het kanaal, 33H1 Fv proteïne, wordt gebruikt om de KvAP / Fv complex. De voorbereiding van de Fv proteïne wordt gedetailleerd beschreven in box 2. Zuiver het complex in een Superdex 200 kolom. Het complex elueert bij ongeveer 11,4 ml in ons systeem.
  2. Voor het eerste scherm, meng het eiwit met DMPC of POPC die volledig is opgelost in DM of β-OG. De eiwit / lipide / detergens mengsel gemengd gedurende meer dan 15 uur om een ​​thermodynamisch evenwicht in de verdeling van de drie componenten van de gemengde micellen bereiken. Meestal hebben we eerst drie verschillende lipide / eiwit-ratio's (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) en drie verschillende pH-niveaus (6.0, 7.0, en 8.0) te testen. De dialyse-buffer bevat 20 mM K-fosfaatbuffer, 100 mM KCl en 3,0 mM NaN3. De dialyse buffer wordt elke 2-3 dagen vervangen. Een kleine hoeveelheid van de kristallen worden uit elke 2-3 dagen tot de vorming van vesicles en de mogelijke verschijning van kristalrooster onderzoeken.
    Een tabloid lijstvan LPR vs pH gebruikt om het gedrag van het eiwit in de twee verschillende typen lipiden te bepalen. We willen relatief grote afmetingen (meer dan 150 nm) blaasjes of membraan vellen te verkrijgen wanneer de dialyse monsters worden onderzocht door negatieve vlek EM. Een kleine regelmatig patroon in membranen suggereert een hit en wordt gebruikt voor verdere optimalisatie leiden.
    Negatieve kleuring EM: Koper roosters bedekt met carbon films (~ 3-5 nm dik) zijn glow-geloosd in de lucht om de koolstof oppervlak hydrofiel te maken. Een kleine hoeveelheid (2-3 microliter) van de kristallen suspensie wordt aangebracht op het koolstofoppervlak en gedurende 0,5-1,0 minuten. Dep de roosters van de kant met een gescheurde rand van een stuk Whatman # 4 filterpapier. Draai het rooster en incubeer het voor ~ 15 seconden op de bovenkant van een druppel 150 microliter kleurstofoplossing (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 in water plus 0,5% trehalose, of 6,0% ammoniummolybdaat / KOH, pH6.3-6.5 , in het water plus 0.5-1.0% trehalose). Blot zo veel mogelijk oplossing uit tHij rooster oppervlak, en laat het net te drogen voordat u hem in een TEM voor onderzoek. Afbeeldingen van blaasjes worden onder lage dosis toestand genomen om de schade van een kristallijne verpakking door de elektronen te voorkomen.
  3. Het scherm wordt dan uitgebreid naar kleinere stappen van LPR onderzoeken om een ​​correcte LPR bereiken. Als de eiwitten zijn geschikt voor kristallisatie kan een kleine rooster van eiwitten in membranen zichtbaar. Rond deze beginwaarden, verder optimaliseren van de kristallisatie door het variëren van het zout types en concentraties, de temperatuur, de snelheid en de methoden van detergensverwijdering tweewaardige kationen, wasmiddelen gebruikt om de eiwitten te bereiden, neerslagmiddelen, lipiden samenstelling etc.
    De geoptimaliseerde 2D kristallen KvAPΔ36/Fv complex groeien tot grote vellen die variëren van enkele microns tot 20-30 micron (figuur 5A). Onder cryoEM omstandigheden, de kristallen vertonen duidelijke vierkant rooster met duidelijke viervoudige symmetrie zoals verwacht van de viervoudige symmetrische chankanalen (figuur 5B en C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De algemene stroom van de experimenten voor het zuiveren van de KvAP kanaal in biochemische homogeniteit wordt beschreven in figuur 1A. Typische monsters tijdens de expressie en zuivering van het eiwit wordt getoond in de SDS-PAGE gel in Figuur 1B. Het eiwit na de IMAC zuivering relatief zuiver. De opbrengst van de KvAP kanaal ongeveer 1,0 mg / liter kweek.

Oplosbaarheid van lipide blaasjes met reinigingsmiddelen dient te worden uitgewerkt voor elk paar van lipide versus detergent. De oplosbaarheid van kleine unilamellaire vesicles POPE / POPE van DM wordt getoond in Figuur 2A, de resultaten van de vesicles flotatie meestal vrij eenvoudig. Typische resultaten in de SDS-PAGE analyse van de fracties uit de gradiënten worden getoond in figuur 2B. In de sucrose dichtheidsgradiënt, de kanaal-bevattende POPE / POPG vesicles meestal geconcentreerd op het grensvlak tussen de 10% laag eend de 35% lagen. De KvAP bevattende DOTAP of DOGS vesicles zijn lichter en meestal op het raakvlak tussen 5% en 10% (licht doorgedrongen in de 10% laag). Indien er een significante fractie van multilamellaire vesicles, ze meestal witachtig en geconcentreerd onder de 10-35% interface. We vonden dat dit gebeurt meestal wanneer het eiwit-detergent-lipidemengsel niet lang genoeg om een ​​goede verdeling van de lipiden te bereiken werd geïncubeerd.

Elektrische opnamen van KvAP kanalen opgenomen in vlakke lipide bilagen worden getoond in Figuur 3. De typische huidige trace laat zien dat bij -80 mV, de kanalen zijn rustig. Overschakelen naar +80 mV leidt tot een snelle capaciteit piek (de scherpe men op het moment van spanningsomschakeling). Een langzaam toenemende fase van de stroom suggereert dat de kanalen actief worden en kunnen naar buiten kalium stroom te geleiden. Na de piek van de stijgende fase, de stroom begint te dalen, een stap genaamd inactivering. De inactivatiOp neemt een paar honderd milliseconden in beslag. Wanneer de elektrische spanning naar -80 mV, er een terugkerende proces na de neerwaartse capaciteit piek, die het sluiten van de open kanalen weerspiegelt en het deactiveren (figuur 3C) genoemd.

In het midden van het scherm faag, testten we de werking van de geamplificeerde fagen op KvAP kanalen in de bilagen van POPE / POPG. Na 12 selectie cycli, de versterkte fagen remde de channel activiteiten (figuur 4B, geselecteerd faag). Maar het uitgangspunt faagweergegeven bibliotheek hadden geen effect zien op de kanalen (figuur 4B, controle faag). Alhoewel de activiteiten van de geselecteerde fagen waren niet erg hoog omdat slechts een lage concentratie van de positieve fagen werden rond de heldere, reproduceerbare effecten gesuggereerd dat er actieve, positieve klonen die een hoge bindingsaffiniteit, selectief moet worden verrijkt tijdens de resterende screening cykelen en eenmaal verrijkt, waarschijnlijk sterk remmende activiteiten op de kanalen in membranen.

In het vroege stadium van de screening 2D kristallen zagen kleine roosters in vele kleine blaasjes. Met optimalisatie, een aantal grote platen kwamen met veel kleine blaasjes rond (figuur 5A). De cryoEM afbeeldingen van deze kristallen altijd toonde veel locale defecten (figuur 5B), wat suggereert dat verdere optimalisering nodig is om betere kristallen. Zodra de kristallen goed werden geoptimaliseerd, ze tentoongesteld scherpe randen, en verscheen als losse vellen. Bij een hoge vergrotingsfactor, de afzonderlijke eenheden zijn duidelijk veel beter besteld (figuur 5C).

Naam van de Reagens / Materiaal Vennootschap Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp T60060
Gistextract RPI Corp Y20020
NaCl Visser S271-3
Tris Base RPI Corp T60040
Kaliumchloride Visser BP366-500
n-Dodecyl-β-D-maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinine RPI Corp A20550-0.05
Leupeptine RPI Corp L22035-0.025
Pepstatine A RPI Corp P30100-0.025
PMSF P7626
DNase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp H75030
PAUS Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
HONDEN Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotine-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
Neutravidine agarose kralen Piercenet 29200
Dialyse Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentaan Visser R399-1
Decaan TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Chemicals M266501

Tabel 1. Lijst van reagentia en materialen.

  • Bacteriecultuur schudincubator
  • Spectrofotometer
  • Micro-probe ultrasoonapparaat
  • Schommelstoel
  • Vloer-model centrifuge voor het verzamelen van bacteriën cultuur en voor het concentreren van monsters
  • Lege kolommen
  • Superdex 200 kolom verbonden met een FPLC systeem

Tabel 2. Apparatuur die nodig is.

Naam Buffer Inhoud
IMAC Lysis buffer 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl
IMAC wasbuffer 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl en 5,0 mM DM
IMAC Elution buffer 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5,0 mM DM en 300 mM imidazool
SDS-sample buffer (5x) (reducerende) 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glycerol, 2,0% SDS, 0,10% broomfenolblauw. (1.0% 2-mercaptoethanol toegevoegd aan de reducerende buffer maken).
Stacking gel buffer voor SDS-PAGE (4X) 0,50 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,40% SDS
Resolutie gel buffer voor SDS-PAGE (4X) 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,40% SDS
FPLC evenwichtsvochtgehalterantsoen 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCl en 5,0 mM DM
Liposoom dialyse 10 mM HEPES, 100 mM KCl

Tabel 3. Naam en de inhoud van de buffer.

Figuur 1
Figuur 1. Voorbereiding van KvAP voor reconstitutie. A. Algemeen workflow eiwit expressie, zuivering en reconstitutie. B. Biochemische zuivering van het eiwit. Geïnduceerde kweek van E. coli XL1-blauwe uiten KvAP werd verwerkt en KvAP gezuiverd. Twintig microliter van celculturen voor (laan 1) en na (laan 2) inductie, het detergens extract (laan 3), doorstroom uit IMAC-chromatografie (laan 4), twee wasstappen (lanen 5,6), en 5,0 ug totaal eiwit na de300 mM imidazool elutie (laan 7) en 5,0 ug van de KvAP tetrameer uit de size exclusion FPLC (laan 8) werden onderworpen aan niet-reducerende 12% SDS-PAGE en Coomassie blue kleuring.

Figuur 2
Figuur 2. Reconstructie van KvAP in PAUS / POPG blaasjes. A. Blaasjes fusie en solubilisatie in functie van detergens concentraties. De absorptie bij 410 nm werd gebruikt om de lichtverstrooiing van vesicles (basislijn afgetrokken geen detergent fractie) volgen. Lipids (POPE / POPG 03:01) was 10 mg / ml. De unilamellaire vesicles bedwelmende sonicatie wordt monodisperse en heeft zwakke verstrooiing vanwege hun grootte van 30-50 nm in diameter. Toen de wasmiddelen werden geïntroduceerd, ze verdeeld tussen oplossing fase en het lipide membraan fase. Door de sterke kromming van de kleine unilamellaire vesicles, de geïntroduceerde detergentia trekker vesikel fusie en de vrijlating van de kromming (dus de lage oppervlakte potentiële energie). De gefuseerde blaasjes zijn groter in omvang en vertonen een sterkere verstrooiing bij 410 nm. De stijgende fase van de piek (grijs gekleurd gebied) weerspiegelt dus de detergent-geïnduceerde fusie, een goede regeling voor eiwitten micel fusie aan de blaasjes. De concentratie van het detergens (DM als voorbeeld) direct aan de absorptiepiek inderdaad gekozen onze reconstrueringsproces. B. Vijftig microliter van gereconstitueerde KvAP vesicles (KvAP 0,5 mg / ml) werd door sucrose dichtheidsgradiënt. Monsters van 100 gl fracties van boven naar beneden (1 ~ 9) sucrose gradiënt werd getest in een 12% reducerende SDS-PAGE. De gel was Coomassieblauw gekleurd. Laan 3 bevatte ~ 2 ug KvAP.

/ Files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
Figuur 3. Elektrische activiteit van KvAP kanaal in gereconstitueerde dubbellagen. A. Opname set-up in een kooi van Faraday, 1, twee elektroden, 2, trans zijde 3, cis zijde 4;. Zoutbrug B. vergroot gedeelte van het verdunde gedeelte aan een zijde van de bilaag beker met een gat 5 , die wordt gebruikt voor het maken van membranen. C. Elektrische activiteit van KvAP kanalen die versmolten de zwarte lipide membraan is opgenomen. Terwijl wordt gehouden op -80 mV, werd de membraanpotentiaal gepulseerd 80 mV gedurende 150 msec en vervolgens terug veranderd naar de holding potentiaal. De ionische stroom is opgenomen in de voltage-clamp modus gebruikt een Axopatch 200B versterker.

Figuur 4
Figuur 4. Screening voor conformation-specifieke liganden van een faag-display bibliotheek. Een. Scheme achter de screening tegen ionkanalen gereconstitueerd in blaasjes. De blaasjes worden gedoteerd met biotine-DOPE en kunnen de oplossing worden getrokken door neutravidine kralen. De conformatie van het KvAP kanaal wordt bestuurd door specifieke lipiden. Negatieve selectie tegen kralen, lege vesicles en blaasjes met kanalen in een andere conformatie worden gedaan voordat de fagen geïncubeerd met de kanalen in het doel conformationele toestand (in DOTAP of DOGS als voorbeeld). De geselecteerde fagen worden geamplificeerd en getoetst kanalen bilagen. B. Testen van de geselecteerde fagen in het midden van het scherm. Elektrische activiteit van KvAP in de bilaag op verschillende tijdstippen na het toevoegen van de geselecteerde fagen: black trace - vóór de toevoeging, geel trace - 2 minuten na, rode trace - 10 minuten na de toevoeging Top: De faagbibliotheek start (totaal. ~ 10 10 fagen toegevoegdde bilaag) werd getest op de kanalen in bilaag en bleek geen detecteerbare activiteit omdat elke faagkloon slechts ongeveer 100 exemplaren Onderkant. Na 12 doorloopt, de fagen nog een mengsel van verschillende klonen. Toevoegen van ongeveer 10 10 fagen om de kanalen in de bilaag leiden tot de duidelijke remming van kanaalactiviteit, suggereert dat er positieve klonen die een hoge affiniteit moeten hebben. hier grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5
Figuur 5. Tweedimensionale kristallisatie van KvAP in membranen. A. Afbeelding van negatief gekleurde enkellaags 2D kristallen in het midden van kristal optimalisatie. De kristallen werden gekleurd met 6,0% ammoniummolybdaat, pH 6,4 plus 0,50% trehalose. Vanwege de suiker, soms gestapeld met elkaar. De zwarte vierkante doos een gebied af dat aanleiding geeft tot het diffractiepatroon getoond aan de rechterzijde met diffractie spots naar ~ 20 Â. B. cryoEM beeld van een 2D kristal uit een monster gelijk aan die in (A). Het monster werd gemengd met 3% trehalose en bevroren door directe kelderen, en afgebeeld onder een cryoEM. Het beeld werd verkregen op 50.000 x. Het C. cryoEM beeld van een verder geoptimaliseerde kristal was duidelijk dat er waren lokale defecten in het kristal verpakking.. Het monster werd ingebed in 0,75% tannine en 10% trehalose en het beeld werd genomen bij 50.000 X. De rechte lijnen en de strakke verpakking gesuggereerd dat de media vormen werden besteld in dergelijke kristallen. De twee zwarte pijlen geven de vierkant rooster.

Boxes:

Box 1. Bereiding van IMAC kolom

  1. Resuspendeer de IMAC hars grondig.
  2. Onmiddellijk over de benodigde hoeveelheid hars in suspensie naar een 50 ml buis. We gebruiken 2 ml bedvolume hars voor de zuivering van KvAP van 2 L cultuur.
  3. Centrifugeer het buisje bij 700 xg gedurende twee minuten om pellet langs de hars.
  4. Verwijder de bovenstaande vloeistof en gooi.
  5. Voeg 10 volumes MQH 2 O bed en meng kort om de hars te spoelen.
  6. Recentrifuge bij 700 xg gedurende 2 minuten tot pellet door het hars. Verwijder het supernatant.
  7. Voeg 10 volumes MQH 2 O bed en giet het in lege kolom.
  8. Wacht tot hars rust komt, en sluit de kolom met een stroom adapter voor lage-druk-vloeistofchromatografie.
  9. Run 5 bedvolumes MQH 2 O en 5 bedvolumes equilibreerbuffer door de kolom.

Box 2. Zuivering van Fv

Fv Transformation - Dag 1

  1. Transformeren100 ng van het plasmide dat Fv-His 6-60 gl JM83 competente cellen, bacteriën op de plaat vier LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline en incubeer overnacht in een 37 ° C incubator.
  2. Bereid 6 X 1 L LB voor bacteriële cultuur.

Expressie van Fv - Dag 2

  1. Schroot alle kolonies van de platen in LB medium. Voeg deze suspensie bacteriën tot 6 x 1 L LB in de aanwezigheid van ampicilline (100 mg / L) en incubeer tot OD600 0,5 bereikt.
  2. Wanneer OD 0,5 bereikt, verlaag de temperatuur tot 20 ° C en 115 RPM. Wanneer de temperatuur dalen tot ~ 20 ° C, voeg anhydrotetracycline (100 gl 1mg/ml in DMF tot 1 L) voor het initiëren van de inductie van eiwitexpressie en incubeer nog 5 uur bij 20 ° C bij normale schudden.
  3. Oogst bacteriën in 1 L fles centrifuge bij 4000 xg gedurende 15 minuten. Giet het supernatant zo veel mogelijk. Houd de geoogste bacteriën op het ijs ineen 4 ° C koude kamer 's nachts.

Het loslaten van de Fv-moleculen van de bacterie - Dag 3

  1. Resuspendeer bacteriën in 150 ml Fv-vrij buffer (50 mM Tris pH 8,0, 20% sucrose, 1,0 mM EDTA).
  2. Onder roeren met een magnetische roerstaaf, voeg lysozym tot 0,1 mg / ml en houdt de bacteriën op ijs gedurende 30 minuten. Daarna voeg MgCl 2-2,0 mM en blijf op ijs nog 10-15 minuten.
  3. Centrifugeer de behandelde bacteriën bij 20.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. De bacteriële spheroblasts moeten alle beneden de pellet en de meeste Fv moleculen vrijkomen in het supernatant.
  4. Dialyseer het supernatant tegen 4,0 L wasbuffer (20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl) in koude kamer ten minste 4 uur. Aan het eind van de dag, veranderen naar verse dialysebuffer en dialyseren overnacht. Door de sucrose in de oplossing, zal het volume van het dialysaat met ongeveer 50%. Overmaat van dialysebuiswerk worden gebruikt.

IMAC zuivering en FPLC - Dag 4

  1. Equilibreer 10 ml bed volume van IMAC zuivering hars (zie kader 1) met de dialyse buffer in 50 ml buis.
  2. Breng het dialysaat uit de buis, voeg MgCl 2 tot 10 mM en het volume tot 200 ml. Meng de vooraf geëquilibreerd hars en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
  3. Pak de lege kolom met de bebroede hars, en was de hars met 5 bedvolumes wassen buffer, gevolgd door 5 bedvolumes wassen buffer met 10 mM imidazol en 30 mM imidazol elk.
  4. Elueer de gebonden eiwit met 20 ml wasbuffer plus 300 mM imidazool.
  5. Voer de geconcentreerde Fv door Superdex 200 kolom vooraf in evenwicht met wasbuffer. Zwembad de fracties die Fv (typische pieken opduikt op 17.6 ml retentievolume) samen en concentreer het. Bepaal de concentratie van het monster met behulp van de extinctiecoëfficiënt van Fv bij 280 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De reconstitutie van de KvAP kanalen in verschillende membranen is gebruikt in verscheidene studies 8-10. Na het idee voor de distributie van lipiden tussen detergens / lipide micellen en de eiwit / reinigende / lipide micellen, kunnen wij nagenoeg volledig oplossen van de KvAP bereiken in membranen gemaakt van zeer verschillende lipiden. Elke tetrameric KvAP kanaal moet ~ 100 vetmoleculen om volledig te dekken zijn transmembraan domein. De belangrijkste voorwaarde is om genoeg vetmoleculen te smelten in de eiwit / lipide / detergent micellen voordat de wasmiddelen worden verwijderd. Onze standaard condities (0,5 mg eiwit en 5,0 mg lipiden) ervoor zorgen dat er gemiddeld ~ 1000 lipide moleculen per eiwitmolecuul. Onze floatation experiment en biochemische experimenten bevestigden dat de reconstructie is bijna voltooid. Elektrische opnames van kanalen ingebracht in zwarte lipide membranen, de screening van de gereconstitueerde kanalen eengainst een faagweergegeven peptidebibliotheek en de groei van 2D kristallen van de kanalen in membranen die aantonen dat succesvolle toepassingen van membraan reconstitutie voor verschillende doeleinden.

De lipide-afhankelijke vormveranderingen van de KvAP kanalen en de screening tegen een faagweergegeven peptidenbibliotheek vitrine een nieuwe weg voor het screenen op kanaal blokkers of channel openers door biochemische methoden in plaats van te vertrouwen op elektrofysiologie om de kanalen in specifieke conformaties 8 te houden. Het succes in onze scherm conformatie-specifieke binders suggereert dat dezelfde strategie kan worden toegepast op specifieke binders gevonden in de geactiveerde conformatie. Het is te verwachten dat de gereconstitueerde kanalen in vesicles kan worden gebruikt tegen een enkele keten Fv bibliotheken, Fab databanken, enz. Ook kunnen andere membraaneiwitten lopen door deze operaties en zet hun strakke bindmiddelen die bruikbaar zijn voor verschillende doeleinden. Wij geloven dat deze new methode zal meer algemene toepassingen in de toekomst zien.

Gereconstitueerde membraan systemen zal de opheldering van de chemische details achter de lipide effecten op membraaneiwitten 11 toelaten. Lipide-eiwitinteractie is bekend belangrijk voor veel membraaneiwitten, en is onderworpen aan meerdere studies in de laatste 3. In de cel-gebaseerde onderzoeken, kunnen manipulaties worden uitgevoerd om de specifieke bestanddelen membranen veranderen en vervolgens de functionele veranderingen in het membraan eiwitten zijn geassocieerd met de structurele en compositionele veranderingen in de membranen. Dergelijke verbindingen en indirect kunnen voortvloeien uit verschillende factoren in de celmembranen die niet goed gekarakteriseerd. In een gereconstitueerde homogene membraan, is het definitief maken van verbindingen tussen de structurele en functionele veranderingen van de membraaneiwitten en de veranderingen in lipide membraan samenstelling en eigenschappen. Uiteindelijk begrijpen tHij chemische principes achter de lipide-eiwit interacties, moeten we de verdeling van lipiden in het transmembraan domein af te bakenen, en de dynamische veranderingen van deze lipiden naast de eiwitten begrijpen. Een gereconstitueerde systeem blijkt een betrouwbare manier naar zo'n begrip.

Reconstitutie van membraaneiwitten vereist de gecontroleerde verwijdering van wasmiddelen van het eiwit / lipide / detergent gemengde micellen, en de fusie van de gemengde micellen in grote degenen die uiteindelijk om te zetten in blaasjes 30. Drie verschillende methoden worden gebruikt voor het verwijderen detergenten, dialyse, kralen en cyclodextrine 14, 31, 32. Maar het blijft moeilijk om een goed gecontroleerde, geleidelijke verwijdering van detergentia bereiken van een klein volume 33, 34. Een ideale methode voor detergensverwijdering zou detergentia gelijkmatig uit te maken van de waterfase in het hele volume op een controleerbare snelheid en mag geen sterke storing on de reconstitutie van bilaag membranen. Een dergelijke werkwijze zou kunnen de snelheid en efficiëntie van reconstitutie veranderen, en zal waarschijnlijk in staat de reconstitutie in een klein volume. Een combinatie van trage verdunning en een van de drie gebruikelijke werkwijzen voor detergensverwijdering kan dit doel benaderen. Slow verdunning door invoering kleine hoeveelheid water in de eiwit / detergens / lipide mengsel een controleerbaar gelijkmatig verlagen detergens concentratie tot de CMC. De detergensverwijdering achteraf minder kritisch voor de vesicles, hoewel nog steeds belangrijk voor de fusie van kleine blaasjes in grote bedrijven. Andere manieren om gecontroleerde verwijdering detergent te bereiken moeten nog worden bedacht en ontwikkeld.

Onze oplosprocedure draait behandeling van lipide verdeling gemengde micellen en detergent-geïnduceerde fusie van vesicles en de gemengde micellen. Het succes baant de weg die leidt tot een breder spectrum van toepassingen van de reconstituted vesicles, veel meer dan de drie richtingen we gepresenteerd. De aanpassing van onze procedure om andere membraaneiwitten moet belangrijke technische limiet niet tegenkomen. Hoewel veel membraaneiwitten zijn opgelost een of andere manier is het moeilijk te bereiken vrijwel volledige reconstitutie en de functionaliteit van de eiwitten van meerdere verschillende hoeken te analyseren zijn. Onze inspanningen in de KvAP reconstitutie suggereren dat onze methodes volledige reconstructie kunnen toestaan ​​en geschikt voor deze doeleinden zullen zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De studies over KvAP in de Jiang lab hebben aanzienlijke hulp verkregen van het laboratorium van Dr Roderick MacKinnon's aan de Rockefeller University. Speciale dank gaat uit naar Dr Kathlynn Brown en Michael McQuire voor hun advies en hulp op onze faag-scherm experimenten. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (GM088745 en GM093271 naar Q-XJ) en AHA (12IRG9400019 naar Q-XJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
  3. Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
  4. Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
  5. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
  6. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
  7. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
  8. Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
  9. Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
  10. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
  11. Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. 3408884 (2012).
  12. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
  13. Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
  14. Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
  15. Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
  16. Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
  17. Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
  18. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
  19. Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. Sattelle, D. B. Academic Press, Inc. San Diego. 133 (1993).
  20. Tien, H. T. Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).
  21. Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
  22. Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
  23. Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
  24. Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
  25. Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
  26. McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
  27. Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
  28. Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
  29. Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
  30. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
  31. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121, (2), 142 (1998).
  32. Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
  33. Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
  34. Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics