적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

Neuroscience

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Summary

적외선 신경 자극은 청각 시스템과 관련된 포함 신경 유형의 범위 내에서 전기 자극에 대한 대안으로 제시되었다. 이 프로토콜은 기본 청각 신경의 문화 적외선 신경 자극의 메커니즘을 연구 패치 클램프 방법을 설명합니다.

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Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

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Abstract

그것은 펄스, 적외선 레이저 빛이 표적 조직의 추가 수정에 관계없이, 신경 조직에 전기 반응을 유도하는 데 사용할 수 있습니다 최근 몇 년 동안 입증되었습니다. 적외선 신경 자극은 청각 신경의 신경 자극에 표시된 특정 관심, 생체 내 말초 감각 신경 조직의 다양한보고되었다. INS는 이러한 설정에서 작업 표시하고있는 동안 그러나, 적외선 빛은 신경 자극의 원인이되는 메커니즘 (또는 메커니즘)은 현재 잘 이해되지 않습니다. 여기에 제시 프로토콜은 배양 기본 청각 신경에있는 적외선 신경 자극의 조사를 용이하게하기 위해 설계된 전체 세포 패치 클램프 방법을 설명합니다. 철저하게 통제 된 조건 하에서 체외에서 적외선 레이저 조명에 이들 세포의 반응을 특성화함으로써, 기본적인 physica에의 향상된 이해를 얻을 수있을 수 있습니다L, 생화학 적 과정은 적외선 신경 자극을 기본.

Introduction

신경 생리학 및 의학 생체 공학의 분야는 신경 조직에 전기 반응의 제어 자극 할 수 있도록 기술에 크게 의존하고 있습니다. 전기 자극은 신경 자극의 황금 표준 남아있는 동안 신경 반응 및 조직 1 주변에 현재의 확산으로 인해 자극 특이성의 부족을 녹음 할 때, 그것은 이러한 자극 유물의 존재와 같은 단점의 숫자에서 겪고있다.

지난 수십 년간 광학 매개 자극 기술 2의 개발을 보았다. 이러한 기술 중 일부는 특정 분자의 추가 (예 갇힌 분자) 3 연구 설정 밖에서 쉽게 적용 할 수있다 어느 것도 유전자 조작의 일부 형태 (예를 들어 optogenetics 4)를 통해, 표적 조직의 수정이 필요합니다. 특히 관심을 따라서 적외선 신경 자극 (INS), whereb는Y 신경 조직은 펄스 적외선 레이저 빛에 의해 흥분됩니다. INS는 신경 조직 2의 매우 구체적인, 비 접촉 자극을 가능하게하여 전기 자극의 많은 단점을 극복 할 수있는 잠재력이있다. INS가 성공적으로 생체 내에서 다양한 설정에서 설명하고있는 동안 그러나, 여기의 정확한 메커니즘은 불확실 남아있다.

최근 일부 서적은 5-7 INS 뒤에 메커니즘을 폭로으로 진행 상황을 보여 주었다. 물에 의해 레이저 빛의 흡수에 의한 급속한 난방은 중요한 역할을 나타납니다. 그러나이 넘어 합의가 아직 도달 할 수있다. 샤피로 등. 7 빠른 가열 세포막과 이후의 탈분극의 정전 용량의 변화를 선도 세포막에 인접한 하전 입자의 분포에 교란을 일으키는 원인이 그것에 매우 일반적인 메커니즘을 제안한다. 또한, 알버트 등은 5.는 LASE를 주장R 유도 가열은 이온이 세포막을 통과 할 수 있도록 온도에 민감한 이온 채널 (일시적인 수용체 잠재적 인 vanilloid 채널)의 특정 클래스를 활성화합니다. 이 단계에서 그것을 식별 할 수 아직 추가 요소가 있는지 여부를 실제로 이러한 메커니즘을 결합하는 방법 불분명하거나.

출판물의 작은 수 (참조 5,7-9) 체외에서 INS를 조사했지만,이 분야에서 출판 작업의 대부분은 (예를 들어, 참조 1,6,10-18) 생체 내에서 실시되었습니다. 청각 신경의 적외선 자극 인공 와우 10,14-18의 잠재적 인 응용 프로그램 때문에 특별한 관심의 영역이다. 생체 내 실험에서 다양한 설정의 기술, 생체 연구에 의해 여유 컨트롤의 증가 수준 기계화에 대한 자세한 이해로 이어질 것으로 예상된다의 효과를 확인하기 위해 중요하지만INS에 대한 책임 anism. 이 보고서는이 또한 청각 시스템에서 기존 데이터의 큰 바디에 연결하는 동안 기본 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 패치 클램프 수사 배양 나선 신경절 신경 세포의 준비에 대해 설명합니다.

패치 클램프 기술은 단일 세포의 전기적 활동을 기록하는 수단을 제공하고 각각의 기본 전류 (19)의 기여를 공부하고, 전기 생리학 현상의 연구를위한 훌륭한 도구입니다. 이 기술은 같은 양식 나선 신경절과 같은 기본 뉴런의 체외 준비에 안정적으로 적용하면 깊이 신경 활동을 통제하고 조작하는 메커니즘을에서 공부 할 수있는 기회를 제공합니다.

패치 클램프를 통해 나선형 신경절 신경 세포의 전기적 특성에 레이저 자극의 효과를 조사이 작품 개요 방법에 지정된 프로토콜녹음. 접근 방식은 표준 현미경 구성을 수정할 필요없이 안전 운전뿐만 아니라보다 쉽고 반복적 인 정렬을 허용, 오히려 자유 공간 레이저보다 섬유 결합 레이저를 기반으로합니다. 이러한 프로토콜의 기초에, 그것은 더 명확 INS 뒤에 기계 또는 기계 장치를 결정하기 위해 실험의 넓은 범위를 수행 할 수 있어야한다.

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Protocol

1. 나선 신경절 신경 세포의 배양

  1. 오토 클레이브의 작은 원형 (예를 들어 10mm 직경) 유리 coverslips는과 곡선 집게를 소독. 소독 집게를 사용하여 멸균 4-링 35mm 페트리 접시 또는 4 - 웰 플레이트의 각 우물에 살균 coverslips를 전송합니다. 최대 48 시간에 대한 배양기에서 coverslip을과 장소의 표면 (37 ° C)에 폴리-L-오르니 틴 (500 ㎍ / ㎖) 및 마우스 라미닌 (0.01 밀리그램 / ML) 150 μl를 적용합니다. coverslips를이 우물의 바닥에서 멀리 떠하지 않도록 확인하십시오.
  2. 47.5 ML neurobasal, 0.5 ML N 2 보충, 1 ML B27 보충제, 0.5 ML의 L-글루타민, 0.5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 : 각 신경의 문화에 대한 50 ML 멸균 Neurobasal 미디어 (NBM)를 준비합니다. 참고 : 보조 식품을 냉동 할 수 -20 ° C에 저장하고 필요한 날에 미디어에 추가됩니다.
  3. 이전에 20,21 설명 된대로 출생 후 하루 4-7 쥐 새끼에서 나선 신경절 신경 세포를 떼어 놓다, 우리효소 (0.025 % 트립신 0.001 % DNase의 I) 및 기계 기술을 모두 ING. Whitlon 등. 22 비에이라 등. 23을 참조 modiolus 격리 시위 나선 신경절 신경 세포의 문화 나 파커 등. 24 자세한 절차.
  4. coverslips는 남아있는 모든 poly-L-ornithine/laminin 솔루션을 기음과 NBM과 함께 간단히 씻는다.
  5. 인큐베이터 (37 ° C, 10 % CO 2)에 coverslips를 제자리에 해리 나선 신경절 신경 세포 현탁액 150 ~ 200 μl를 추가합니다. 참고 : 최대 20의 coverslips는 8 쥐 새끼의 평균 쓰레기에서 준비 할 수 있습니다.
  6. 네 시간 도금 뉴런 후, 세포 파편을 제거하고 150 ~ 200 ㎕의 예열 신선한 NBM으로 대체 할 솔루션을 대기음. 참고 : 미디어 탈수를 방지하기 위해 매일 보충이 필요할 수 있습니다.
  7. 전기 생리학 녹음에 필요한 때까지 배양기에 coverslips를 반환합니다. 참고 : 해리 나선형신경절 신경 세포 배양 사시간 분리 후 이후 최대 두 개의 일을위한 전기 생리학 실험에 사용할 수 있습니다. 생체 시간은 결과의 분석에서 고려되어야한다. 모든 24-48 시간을 NBM 보충.

2. 패치 클램프 녹음을위한 준비

  1. 솔루션을 준비
    1. 세포 (마이크로 피펫) 해결책 : 115 mM의 K-글루코 네이트, 7 mM의 KCl을, 10 MM의 HEPES, 0.05 mM의 EGTA, 2 개 mm 나 2 ATP, MgATP 2 밀리미터, 0.5 밀리미터 나 2 GTP (KOH로 pH를 7.3로 조정, 295 조정 자당과 mOsmol 원 / kg). 살균 필터 (0.2 μm의)를 통해 솔루션을 전달하고 기록의 날까지 -20 ° C에 저장할 수 200 μL의 aliquots로 나눕니다.
    2. 세포 (목욕) 해결책 : 137 mM의 NaCl을 5 mM의 KCl을, 2 MM의 염화칼슘 2, 1 mM의 MgCl 2, 10 MM의 HEPES, 10 mM의 포도당 (수산화 나트륨으로 pH를 7.4로 조정, 자당과 300-310 mOsmol / kg의 조정) . 이 솔루션은 기록의 날에 이루어집니다.
  2. MΩ 2-6의 저항을 녹음 마이크로 피펫을 준비합니다. 와 붕규산 유리 (1.0 mm 외경, 0.58 mm 내경, 75mm 길이), 우리는 CO 2 레이저 풀러 (서터 악기 P-2000)을 사용합니다.
  3. 레이저를 준비합니다. 이 프로토콜은 OptoTech P / L.에서 같은 1,870 nm의 적외선 신경 자극 등의 섬유 결합 레이저와 함께 사용하기위한 것입니다 우리의 실험에서 빛 전달에 사용되는 광섬유 양단에 수치 0.22의 조리개와 FC​​-PC 커넥터와 220분의 200 μm의 코어 / 클래딩 직경의 실리카 섬유 (AFW 기술 MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). 패치 코드는 두 개의 광섬유 떠꺼머리 (즉, 한 쪽 끝에서 커넥터 처리 및 기타에 죽습) 생산 반으로 잘라되었다. 섬유 중핵 직경과 레이저 유도 온도 변화에 개구의 효과는 톰슨 등으로 자세하게 설명되어있다. 25
    1. 베기 표준 기술을 사용하여 빛을 전달 섬유의 끝그리고 그 결과로 끝이 광학 현미경 (즉, 끝이 섬유 축에 수직 및 육안 검사에 평평하게 나타납니다)과 관찰 고품질 있는지 확인합니다. 커넥터 (예 : THORLABS ADAFC2)를 통해 적절한 사용하여 자극 레이저 섬유 커플 링 출력에 빛을 전달 섬유를 연결합니다.
    2. 적절한 악기 (LM-3 검출기 머리 예를 들어, 일관된 FieldMate)를 사용하여 빛을 전달 섬유의 절단 된 끝에서 출력 레이저 파워를 측정한다. 그것은 레이저 전원에게 빛을 ​​전달 섬유 쪼개거나 중요한 조정 (예를 들어, 하나의 실험실에서 다른 교통 수단) 레이저로 만든 때마다 확인하는 것이 좋습니다.
    3. 섬유 척 또는 이와 동등한 장치 부착 적절한 micropositioner에 척으로 빛을 전달 섬유를 삽입합니다. 그것은 정확하게 광섬유 coverslip을 함께 만드는 θ 각도를 결정하는 것이 중요하다. 이 ANGLE는 실험 배치의 사진을 촬영 각도를 얻기 위해 이미지 처리 소프트웨어 (예를 들어 ImageJ에)를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 특히 현미경 - 각도 θ (또는 가능한 각도 범위)는 기본적으로 실험 배치의 공간적 한계에 의해 제한됩니다. 우리의 실험에서 θ의 전형적인 값 (직립 현미경에 따라) 36 °의 주위에, 그러나 최적의 각도 (거꾸로 현미경을 사용하는 예를 들어) 다른 설정에 대해 상당히 다를 수 있습니다.
    4. 레이저와 그림 2와 같이 패치 클램프 데이터 수집 시스템 (예 : Digidata 1440A, 분자 장치) 사이의 연결을 확인합니다. 패치 클램프 데이터 수집 시스템에서 디지털 출력이 가능한 데이터 수집 시스템의 독립적 인 레이저 펄스 매개 변수를 지정하고, 외부 함수 발생기를 통해 레이저에 연결해야합니다. 또는이 출력에 직접 연결할 수 있습니다레이저 드라이버 (펄스 길이와 반복 속도는 데이터 수집 소프트웨어에 의해 설정 될 필요). 어느 경우 레이저를 트리거하는 데 사용되는 신호는 레이저 펄스의 타이밍과 길이는 전기 생리학 신호를 동시에 기록 할 수 있도록 데이터 수집 시스템의 입력으로 연결되어야합니다.

3. INS의 조사를위한 패치 클램프 녹음

  1. 세포 용액으로 관류 시스템의 적절한 컨테이​​너를 채우고 1-2 ML / 분의 속도로 목욕 관류를 제공하기 위해 유량을 조정합니다. 우리는 솔루션의 신속한 가열 및 흡입에 의해 소비 용액을 제거하기 위해 연동 펌프를 사용하려면 인라인 히터 중력 공급 시스템 (흡인기 병, 핀치 밸브 및 PE 튜브)를 사용합니다.
  2. 직립 현미경의 기록 챔버 (화장실)에 배양 세포로 coverslip을 배치합니다. 높은 배율 물 침지 목표 (E 사용40X. g.) 및 위상 대비 (예를 들어, 미분 간섭 대비 또는 Dodt 그라데이션 대비), 시각 문화 내에서 나선 신경절 뉴런을 찾습니다. 그림 1a와 같이 전형적인 나선 신경절 신경 세포는 저명한 핵을 가진 직경 위상 밝고, 둥근 약 15 μm의 수 있습니다.
  3. 신경 세포가 위치되면, 낮은 배율 목표 (예를 들어, 10X)로 전환 시야 내의 표적 신경 세포를 찾습니다.
  4. 다음 절차를 (또는 이에 상응하는)를 사용하여 위치에 빛을 전달 광섬유로 이동 :
    1. 끝이 수평 및 수직 평면 모두에서 대상 뉴런에 가까운 때까지 출력 섬유를 이동하는 micropositioner를 사용합니다. 섬유 끝의 수직 위치는 목표를 위아래로 이동 (포커스를 스캐닝)하여 확인할 수 있습니다.
    2. 높은 배율의 목표로 전환하고 t 옆에 의도 한 위치에 광섬유의 끝 위치그는 신경 세포 (그림 2 그림 참조). 섬유의 수직 위치를 조정하면, 섬유의 아래쪽 가장자리는 섬유의 위치에 불확실성을 최소화하기 위해 coverslip을 (즉, 그냥 터치)에 휴식하는 것이 중요합니다. 수평면에서 최적의 정렬은 섬유가 coverslip에와 섬유 R의 반경 만드는 θ 각도에 따라 달라집니다. 대상 신경 세포의 중심이 섬유 축 방향으로 놓 이도록 섬유를 배치하기 위해, 섬유의 상부 가장자리와 대상 셀 사이의 수평 거리가 있어야한다
      Δ 대상 = R (cosec θ - 2 죄 θ)
      음의 값을 나타냅니다 곳 광섬유 돌출 셀. 섬유를 정렬 할 때, 섬유의 위쪽 가장자리와 신경 세포의 중심 사이의 Δ 대상의 거리가 약 육안 검사에 의해 달성 될 수있다. 그러나 Δ 대상은하도록 설계단지 일반적인 지침 역할을합니다. 섬유의 상부 가장자리와 신경 세포의 중심 사이의 실제 거리 Δ는 Δ 대상 (그림 1에서와 같이)에서 잴 다릅니다 같은 섬유를 배치하여 중앙에서 모두 반경 변위 (즉, 효과에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 대상 신경 세포에 비해 빔의 빔)과 축 변위 (섬유 축 방향 즉,). 전형적인 멀티 모드 섬유를위한 빔 프로파일을 잘 모자 분포 26, 로컬 흡수 에너지 (온도)의 감소에 의해 근사하기 때문에 - 예를 들어, Δ 설정 ≈ 0은 셀의 주변에있는 지역의 온도가 증가 할 것으로 예상된다 빔의 중심에서 변위로 인해 가까운 셀 섬유의 단면을 움직이는 흡수 에너지의 증가에 비해 최소화됩니다.
      주의가 정확하게 그리고 반복적으로 PO와 같은 섬유의 위치를​​ 이동해야하지만시각적 단서, 대상 뉴런 (예 : Δ)에 비해 섬유 위치의 정확한 측정을 사용하여 ssible은 소정 거리 멀리 위치를보다 더 중요하다. 프로토콜의 단계 3.8.2에 설명 된대로 Δ는 이미지 분석 (± 3 ㎛의 예상 최대 불확실성)를 정의 할 수 있습니다. 일부 실험 5,8에 흰색 빛 소스는 원하는 세포를 표적으로하기 위하여 섬유를 결합되었다. 이 방법은 대상 지역에서 산란되는 빛의 강도가이 얕은 각도 (θ)에서 상대적으로 낮은 때, 직립 현미경 설정에서 효과 것으로 나타났다.
    3. 섬유가 위치에 오면, 마이크로 피펫의 간단한 위치를 사용하려면 알려진만큼 그것을 밖으로 이동합니다. 섬유는 후 신경 녹음이 달성 원래 위치로 반환 할 수 있습니다.
  5. 세포 내 용액을 마이크로 피펫을 기입하고 안전하게 머리에 장소에 적합앰프의 다케 (예 : Multiclamp 700B, 분자 장치). 미세 전극 홀더의 측면에 부착 된 튜브를 사용하여 마이크로 피펫의 막힘을 방지하기 위해 긍정적 인 압력의 작은 금액을 적용합니다.
  6. micromanipulator에 사용, 단지 목표 뉴런 위의 위치에 micropipette를 이동합니다.
  7. 전체 세포 레코딩을위한 프로토콜 :
    1. 증폭기의 전압 클램프 모드에서 10 밀리, +10 MV 구형파 펄스 (예를 들어, 인감 시험)을 적용하고 0 nA의에 기준 신호의 마이크로 피펫 잠재력 (피펫 오프셋)를 조정합니다. 도장 검사는 미세 전극의 저항이 원하는 범위 (- MΩ 6 2) 내에 있는지 여부를 결정하는 데 사용되어야한다.
    2. 저항을 모니터링하면서, 조심스럽게 대상 신경 세포의 표면에 마이크로 피펫의 위치를​​ 미세 조작기의 미세 조정을 사용합니다. 마이크로 피펫은 신경 세포와 접촉 할 때, 저항 (~ 0.5-1 MΩ)에 의해 증가 할 것이다. 나는mmediately 저항 증가에 이어, 긍정적 인 유체 압력을 제거하고 작은 부정 압력을 적용합니다. 일단 저항 10를 통과했다 - 20 MΩ, 지주 레벨 (-60 MV 정도 등)에 대한 잠재적 멤브레인을 고정합니다.
    3. 그것은 1 GΩ을 초과 할 때까지 전극의 저항은 효과적인 밀봉 ( 'gigaseal'라고)가 세포막과 마이크로 피펫 사이에 형성되었음을 의미, 계속 증가한다. 이 시점에서, 마이크로 피펫에서 모든 유체 압력을 제거합니다.
    4. gigaseal가 형성되면, 짧은 전류 펄스 (25-100 마이크로 초, +1 V)를 사용하거나 파열 세포막에 부정적인 유체 압력의 짧은 펄스 및 전체 셀 구성을 얻을 수 있습니다.
    5. 막 커패시턴스, 직렬 저항과 씰 테스트 펄스와 현재에 장착 지수 곡선에서 결정되는 입력 저항을 기록합니다. 다음 switc, 앰프 CpFast 및 CpSlow 컨트롤을 조정하여 용량 과도을 최소화H는 전체 셀 모드로 증폭기, 평면 현재까지 커패시턴스와 저항을 보정은 물개 시험 중에 관찰된다. 평면 테스트 씰 응답을 유지하기 위해 용량과 저항 컨트롤을 조정, 직렬 저항 보상 (70 % 예측 ~ 70 % 보정)를 적용.
    6. 앰프 전류 클램프 모드로 전환합니다. 휴식 막 잠재력 (전류 주입의 부재)을 기록해 두십시오. 원하는 수준 (예 : -60 MV)에서 막 잠재력을 안정 잡고 전류를 설정합니다. 피펫 용량을 중화하고 전압 강하를 균형 다리의 밸런스를 조정합니다.
    7. (; 300 밀리 초 지속 시간 +10 펜실바니아 단계 10-200 PA) 현재의 탈분극과 자극에 의​​해 신경 세포의 발화 특성을 확인합니다.
    1. 신경 옆에 위치에 광섬유를 다시 이동합니다. CCD 카메라에 연결된 이미징 소프트웨어를 사용하여 대상 신경과 관련하여 섬유의 위치의 이미지를 캡처N, 광 섬유 (그림 1 참조)의 상단 가장자리에 다음 초기 신경 세포의 평면에 초점을합니다.
    2. 결과 이미지의 후속 분석 (예를 들어, 그림의 1B1C)에 의해 정확하게 Δ를 (대상 신경 세포의 중심에 광섬유 상대의 위쪽 가장자리의 위치)을 결정 할 수 있습니다. 일단 Δ가 알려져 같은 섬유 단면에서 대상 신경 세포 (섬유 축) Z와 빔 δ의 R의 중심에서 신경 세포의 반경 방향 변위까지의 거리 등의 매개 변수는 간단한 삼각 관계를 사용하여 계산 될 수있다 :
      Z = R 죄 2θ + Δ COS θ
      δ R = ((R COS 2θ - Δ 죄 θ) 2 + ΔY 2) 1 / 2,
      ΔY는 섬유 축 이상에서와 같이 신경 세포의 중심 사이의 거리입니다 (예 : SE전자 그림 1).
      이러한 위치 매개 변수의 정확한 지식이 자극 공정 25의 가능한 차이를 해결해야 할 수 있으므로 분석은 셀에서 셀에 계정 위치 변화를 고려한다.

4. INS 실험

  1. 현재 클램프 또는 전압 클램프 구성 중 하나에있는 전기 생리학 데이터를 기록하는 동안, 원하는 매개 변수 (예 : 전력, 펄스 길이, 반복 속도 등)에 자극 레이저를 실행합니다. 우리의 레이저, 광 파워는 레이저 드라이버로 직접 입력을 통해 제어되며 각 기록하기 전에 수동으로 지정됩니다. 펄스 길이와 반복 속도는 외부 신호 발생기 또는 데이터 수집 소프트웨어 (같은 단계 2.3.4에 설명) 중 하나에 의해 제어 할 수 있습니다. 데이터가 패치 클램프 채널과 레이저 트리거 채널 모두에서 기록되어 있는지 확인합니다.

다양한 길이의 레이저 펄스약 500 마이크로 초에서 15 밀리와 펄스 당 ~ 0.25-5 엠제이의 에너지에서 일반적으로 측정 전기 반응을 얻을 수 있습니다. 그것은이 매개 변수의 영향을 최소화 할 수 있기 때문에 1 또는 50Hz이어야 레이저 펄스의 반복 속도를 설정하면, 초기 실험에 유용 할 수 있습니다. 기록 된 신호의 변화를 보여주는 전형적인 결과는 다음 절에 제시되어있다.

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Representative Results

나선 신경절 신경 세포는 전압 클램프 전류 클램프 녹음 구성 모두에서 반복 파형과 레이저 조명에 응답합니다. 그림 3A는 2.5 밀리, 0.8 mJ의 레이저 펄스 (6 일부터 평균 응답에 대한 응답으로 세포막을 통해 현재의 흐름의 전형적인 변화를 보여줍니다 -70 MV, -60 MV -50 MV에서 개최 막 잠재력을 가진 1 초 간격)으로 반복 레이저 펄스. NET 안쪽으로 전류가 지속적으로 조명 중지 한 후 초기 값으로 반환 레이저 펄스에 대한 응답으로 유발된다. 레이저 유도 전류의 모양은 INS를 기본 프로세스의 완전한 이해를 얻기 위해 개최 가능성의 범위에서 실험을 수행하는 것이 중요 할 수 있음을 나타내는 막 잠재력이 변경 될 때 다양하게 볼 수 있습니다. 이러한 실험은 현재 프로토콜의 사소한 수정을 실시하고 충전 전압과 전통 기술 (QV) 분석을 사용하여 분석 할 수 있습니다 (SE체외에서 INS에서 얻은 QV 곡선의 예)에 대한 전자 참고 7.

그림 3b에 제시된 데이터는 일반적으로 2.5 밀리, 0.8 mJ의 레이저 펄스 (초기 막 잠재력 73mV가 4 Hz의 반복률 제공 16 레이저 펄스를 통해 평균)에 의해 유발 막전위의 변화를 나타내는 수 있습니다. 전류 클램프 녹음 펄스 후 휴식 막 잠재력으로 약 기하 급수적으로 감소 다음에 레이저 펄스의 과정을 통해 지속적으로 막 탈분극을 보여줍니다. 그림 3B의 예는 레이저 펄스에 따라 소정의 추가 막 탈분극을 나타낸다. 샤피로 등은. 7 막 잠재력 레이저에 의한 변화가 밀접하게 온도 로컬 변경 (셀의 바로 근처에서 즉, 온도)에 관련되어 있음을 증명하고있다. 또한, 모델은 톰슨 등으로 설명했다. 27특정 정렬 조건 하에서 조명 영역에서 축 방향 및 반경 방향의 온도 구배에 따른 확산 밀접 그림 3b에서와 같이 막 전위의 변화를 닮은 지역의 온도 변화로 이어질 수 있음을 확인했습니다. 이러한 연구 결과의 결과로, 그것은 빛을 전달 섬유의 끝 얼굴을 기준으로 대상 셀의 위치가 막 전위의 레이저 유발 변화의 시간 코스와 최고 온도를 모두 결정하는 중요한 역할을한다는 것을 생각합니다 셀의 지역에있다.

과도한 에너지 또는 온도의 큰 증가에 노출 조명은 대상 신경 세포가 손상 될 수 있습니다. 이것은 종종 (갑작스러운 정상 수준으로 막 잠재력을 유지하는 데 필요한 전류의 증가 및 / 또는 신호에서 잡음과 불안정성에있는 큰 증가 등) 세포 전기적 특성의 저하를 관찰 할 수있다. 극단적 인 경우에의 세포 죽음은 레이저 노출에 거의 즉시 발생합니다. 그림 4는 25 밀리, 8 엠제이 레이저 펄스에 노출로 인한 나선 신경절 신경 세포의 죽음의 전압 클램프 녹음을 보여줍니다.

그림 1
그림 1. 전형적인 나선 신경절 신경 세포 및 광 자극 실험을하는 동안 광학 섬유와 마이크로 피펫 (위에서 본)의 상대적 위치를 보여주는 위상 콘트라스트 이미지.) 전형적인 나선 신경절 신경 세포. B) 위치에 광 섬유 (이미지 상단에 초점을 맞추고 있습니다 광학 섬유의 가장자리) C) 셀 (주를 기준으로 섬유 위치를 표시하는 오버레이 이미지 :. 섬유의 위쪽 가장자리가 약간 세포 즉, Δ 돌출하다) 음수입니다. 위와 같이 δ y를 & 델에서 볼TA, 섬유 축에서 신경 센터의 반경 방향 변위는 각각 신경 세포의 중앙에 섬유의 위쪽 가장자리 사이의 거리입니다. 화살표는 나선 신경절 신경 세포의 위치를​​ 나타냅니다. 스케일 바 20 μm의.

그림 2
그림 2. 광 자극 실험 실험 장치 (눈금 표시)의 도식 삽입 된 :. 광학 섬유와 대상 셀을 기준으로 미세 전극의 위치입니다. θ, Δ 및 z는 같은 프로토콜 단계 3.4.2과 3.8.2에 정의되어있다.

그림 3
그림 3.) 전압 클램프 (6 레이저 펄스 delive에서 평균 응답1 Hz의 속도로 적색)와 b) 전류 클램프 (4 Hz의 속도로 반복 16 레이저 펄스에서 평균 응답) 기록 막에 레이저 유도 변경 2.5 밀리에 의해 조명에 따라 현재와 막 잠재력을 보여주는 나선 신경절 신경 세포에서 0.8 mJ의 레이저 펄스. 음영 지역은 레이저 노출 시간을 나타냅니다. 인 세트는 자세히 레이저 조명하는 동안 응답을 보여줍니다. 주 : a)에 삽입 -60 MV의 막 잠재력 얻은 추적에 초점을 맞추고있다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4
그림 4. 지나치게 정력 (25 밀리, 8 엠제이) 레이저 펄스에 노출로 인한 세포의 죽음을 보여주는 전압 - 클램프 녹음. 참고의 진폭신호는 nA의에 표시되고 그림 3은 PA 전류보다 훨씬 더 있습니다.

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Discussion

이 문서에 설명 된 프로토콜을 사용하면 추출 문화 나선 신경절 신경 세포 및 전체 세포 패치 클램프 실험을 수행하여 레이저 유발 전기적 활동을 조사 할 수 있습니다. 체외에서 사용할 경우, 패치 클램프 기술은 생체 내에서 달성 할 수없는 실험 매개 변수의 제어 수준을 제공합니다. 같은 파장, 펄스 에너지, 펄스 길이, 펄스 모양과 펄스 반복 시퀀스로 레이저 자극 매개 변수는 재생 환경에서 공부하실 수 있습니다. 또한, 신경이 유지되는 환경 (예 : 용액의 온도, 화학 요소)은 가능한 막 특성을 연구하고, 따라서 적외선 신경 자극을 기본 메커니즘을 만드는 체계적으로 변화 될 수있다. 전기 및 광 자극 양식 사이의 상호 작용은 제어 된 방식으로 조사 할 수 있습니다. 이러한 기초 연구는 층을 도입하여 더욱 고급 수 있습니다uorescent 프로브는 이온 농도 또는 열 충격 단백질의 발현과 같은 추가 매개 변수를 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 다양한 매개 변수의 명확한 이해는 현상의 완전한 이해를 달성 할뿐만 아니라, 프로세스 최적화를 통해보다 효율적으로 자극을 달성하는 유일한 중요하지 않습니다.

INS의 메커니즘 온도에 의해 연주 중요한 역할 5-7, 레이저 조명에 의한 지역화 난방의 정확한 측정이 기계에게 27 정의에 매우 중요합니다. 오픈 패치 피펫을 통해 흐르는 전류를 기록하여 보정 온도 측정을 얻는 자세한 방법은 28. 야오 등으로 설명하고 여러 저자에 의해 고용, 이들의 환경 담당자 레이저 유도 온도 변화의 크기와 시간의 과정을 결정하는 것이 었습니다 체외 (예 : 참고 문헌 7, 8 참조)에서 발견. 제공D 빛을 전달 섬유의 위치를 정확하게 확인할 수 있습니다 (현재 프로토콜을 사용하는 등), 온도 측정이 방법은 일반적인 INS 자극에 의한 온도의 지역 변화의 정확한 매핑을 사용하는 것입니다.

자극적 인 레이저의 파장은 레이저 유도 온도 변화는 (따라서 INS의 기본 메커니즘) 물 7의 파장에 따라 흡수 특성에 의해 중재되기 때문에 (위해 톰슨 등. 25 참조, INS 실험에서 고려되어야 매개 변수 예상되는 파장 효과에 대한 자세한 설명). 이외에도이 프로토콜 (적외선 신경 자극기, Optotech P / L), 파장 및 레이저 다양한 패키지에 사용되는 1,870 nm의 다이오드 레이저에서 다른 저자에 의해 사용되었습니다. 기존의 INS 출판물에 사용되는 레이저의 일반적인 예는 다음과 같습니다 1,840-1,940 nm의 6,7,10,13에 이르기까지 파장 Aculight에서 다이오드 레이저,16-18, 홀뮴 : 레이저 1-2-3 6,11,12,14,15에서 YAG 레이저 (2.12 μm의) 및 나노 8 1,875에서 나노 5.8, 1,470 작동 다이오드 레이저 및 Sheaumann에서 1,535 nm의 8 레이저.

배양 나선 신경절 신경 세포에이 기술을 적용의 잠재적 인 단점은 뉴런 (~ 15 μm의 직경)의 비교적 작은 크기 그 때문에이며, 기록 전극에 직접 레이저로 켜집니다. 그것은 특정 임계 값 이상으로 레이저 조명 기록 회로 (7) (즉, 물개 및 피펫 저항)의 속성을 변경할 수 있다는 것을 제안하고있다. 샤피로 등은 7.는 레이저 출력이 증가로 3 엠제이의 임계 값 펄스 에너지를 찾는 QV 곡선의 역전 가능성의 변화를 모니터링하여이 임계 값을 측정 하였다. 다른 방법으로, 그것은 승 씰 피펫의 결합 저항을 측정하여이 효과의 크기를 결정하는 것이 가능있을 수 있습니다구멍 셀 모드 (10 밀리 초, +10 MV 전압 펄스 전류 응답을 기록하여 예) 세포 용액의 온도를 변화하면서. 완전히 INS의 메커니즘을 이해하기 위해서는, 레이저 유도 저항의 변화를 측정하고 고려하는 것이 중요합니다.

적외선 신경 자극이 생체 내에서 수행 된 관련 실험적인 작업의 대부분을 업데이트합니다. 생체 적외선 자극에 대해보고 방사 노출 임계 값이 다소 다를 수 있지만 (쥐의 좌골 신경 1 2.12 μm의, 예를 들면 0.32 JCM -2 <0.1 햄스터 청각 신경 18 1.855 μm의에서 JCM -2), 그들은을 통해 결정 임계 값보다 훨씬 낮은 체외 연구 (예 : 마우스 망막 신경절 세포와 쥐 전정 신경절 세포 쥐 신생아 cardiomy -2 5.8, 8.3 J의 CM에 대한 1.875 μM에서 약 20 JCM -2에서cytes 9). 이 단계에서 INS 프로세스의 세부 사항은 충분히 잘 이러한 차이의 원인에 대한 추측 이해되지 않습니다, 그러나, 밀접하게 생체 작업에서 이전의 대상과 유사한 청각 신경 세포로 체외 모델에서 사용하여 설명을 찾는 유리할 수있다 .

체외 모델에서 다른 같은 샤피로 등으로 사용 Xenopus의 난자 (~ 1mm 직경)로 큰 세포를 포함하고 있습니다. 7 이러한 세포 구성 요소가 영향 여부를 조사하기 위해 각각의 세포를 통해 INS의 효과의 공간적 변화를 프로빙 유용 할 수 있습니다 자극. 이러한 지질 이중층 소포와 같은 간단한 모델은 체외 실험에서보다 실험 파라미터를 더욱 정밀하게 제어 할 수 있지만 이러한 모델은 다소 범위가 제한되어 있으며 INS의 모든 복잡성을 공개하지 않을 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

이 작품은 연계 프로젝트 부여 LP120100264 아래의 호주 연구위원회에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

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References

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