Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge

Neuroscience

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Summary

La stimulation du nerf infrarouge a été proposé comme alternative à une stimulation électrique dans une gamme de types nerveuses, y compris ceux qui sont associés avec le système auditif. Ce protocole décrit une méthode de patch-clamp pour l'étude du mécanisme de la stimulation du nerf infrarouge dans une culture de neurones auditifs primaires.

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Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

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Abstract

Il a été démontré ces dernières années que la lumière laser pulsée, infrarouge peut être utilisé pour obtenir des réponses électriques dans le tissu neural, indépendante de toute autre modification du tissu cible. Stimulation neurale infrarouge a été rapporté dans une variété de tissu nerveux périphérique et sensorielle in vivo, avec un intérêt particulier représenté sur la stimulation de neurones dans le nerf auditif. Cependant, alors que l'INS a été montré à travailler dans ces milieux, le mécanisme (ou mécanismes) par lequel la lumière infrarouge provoque une excitation neuronale n'est actuellement pas bien compris. Le protocole présenté ici décrit une méthode de patch-clamp de la cellule entière conçue pour faciliter l'enquête de stimulation neurale infrarouge dans des cultures de neurones auditifs primaires. En caractérisant parfaitement la réponse de ces cellules à illumination laser infrarouge in vitro dans des conditions contrôlées, il peut être possible d'obtenir une meilleure compréhension de la physica fondamentalel et processus biochimiques sous-jacents stimulation neurale infrarouge.

Introduction

Les domaines de la neurophysiologie et la bionique s'appuient fortement sur les techniques qui permettent une stimulation contrôlable des réponses électriques dans le tissu neural. Alors que la stimulation électrique reste l'étalon-or en excitation nerveuse, elle souffre d'un certain nombre d'inconvénients tels que la présence d'artefacts de stimulation lors de l'enregistrement des réponses neuronales, et un manque de spécificité de la stimulation due à la propagation du courant dans les tissus environnants 1.

Les deux dernières décennies ont vu le développement des techniques de stimulation optiquement médiation 2. Plusieurs de ces techniques nécessitent la modification du tissu cible, soit par l'ajout d'une molécule particulière (molécules par exemple en cage) 3 ou une certaine forme de manipulation génétique (par exemple optogenetics) 4, qui ne sont faciles à appliquer en dehors d'un contexte de recherche. Un intérêt particulier est donc stimulation neurale infrarouge (INS), wherebY tissu neural est excité par une lumière laser infrarouge pulsé. INS a le potentiel pour surmonter bon nombre des lacunes de la stimulation électrique en permettant, stimulation sans contact très spécifique du tissu neural 2. Cependant, alors que l'INS a été démontrée avec succès dans une variété de paramètres in vivo, le mécanisme précis de l'excitation reste incertain.

Quelques publications récentes ont montré les progrès vers la découverte du mécanisme derrière INS 5-7. Chauffage rapide due à l'absorption de la lumière laser par l'eau semble jouer un rôle clé. Cependant, au-delà de ce consensus n'a pas encore été atteint. Shapiro et al. 7 proposer un mécanisme très général selon lequel le chauffage rapide provoque une perturbation de la distribution des particules chargées adjacentes à la membrane de la cellule, ce qui conduit à un changement de la capacitance de la membrane cellulaire et la dépolarisation ultérieure. En outre, Albert et al. 5 affirment que laser chauffage induite active une classe spécifique de température des canaux ioniques sensibles (récepteur transitoire des canaux vanilloïde potentiels), ce qui permet aux ions de passer à travers la membrane cellulaire. A ce stade, il est difficile de savoir comment ces mécanismes se combinent, ou bien si il ya d'autres facteurs qui n'ont pas encore été identifiés.

Bien qu'un petit nombre de publications (références 5,7-9) ont étudié INS in vitro, la grande majorité des travaux publiés dans ce domaine a été réalisée in vivo (par exemple, les références 1,6,10-18). Stimulation infrarouge de neurones auditifs a été un domaine d'intérêt particulier, en raison des applications potentielles dans les implants cochléaires 10,14-18. Bien que des expériences in vivo sont importantes pour vérifier l'efficacité de la technique dans divers milieux, l'augmentation du niveau de contrôle offert par des études in vitro devrait conduire à une compréhension plus détaillée de la mécaniquenisme responsable de l'INS. Ce rapport décrit la préparation de cultures de neurones du ganglion spiral pour les enquêtes de patch-clamp, car ils peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes fondamentaux tout en reliant à la grande quantité de données existantes du système auditif.

La technique de patch-clamp est un excellent outil pour les enquêtes sur les phénomènes électrophysiologiques, en fournissant un moyen d'enregistrer l'activité électrique des cellules individuelles et d'étudier la contribution des courants sous-jacents individuels 19. Lorsque cette technique est appliquée à une écurie préparation in vitro de neurones primaires, telles que les neurones du ganglion spiral culture, il offre la possibilité d'étudier en profondeur les mécanismes par lesquels l'activité neuronale est contrôlée et manipulée.

Les protocoles définis dans cette oeuvre les méthodes de contour pour étudier l'effet de la stimulation laser sur les propriétés électriques des neurones du ganglion spiral par patch clampenregistrements. L'approche est basée sur un laser à fibre couplée au lieu d'un laser en espace libre, ce qui permet le fonctionnement sûr et plus facile et plus reproductible alignement sans avoir à modifier la configuration du microscope standard. Sur la base de ces protocoles, il devrait être possible de procéder à un large éventail d'expériences afin de déterminer plus clairement le ou les mécanismes derrière INS.

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Protocol

1. Culture des neurones du ganglion spiral

  1. Stériliser petit tour (par exemple 10 mm de diamètre) des lamelles de verre et pinces courbes dans un autoclave. Transférer les lamelles stérilisés dans des puits individuels d'un 4 anneaux 35 mm boîte de Pétri stérile ou plaque 4 puits, à l'aide des pinces stérilisées. Appliquer 150 pi de poly-L-ornithine (500 pg / ml) et la laminine de souris (0,01 mg / ml) à la surface supérieure de la lamelle et la placer dans un incubateur (37 ° C) pendant 48 h. Veiller à ce que les lamelles ne flottent pas loin du fond du puits.
  2. Préparer 50 ml de milieu Neurobasal stériles (NBM) pour chaque culture de neurones: 47,5 ml neurobasal A, 0,5 ml de N 2 supplément, 1 ml de supplément B27, 0,5 ml de L-glutamine, et de 0,5 ml de pénicilline-streptomycine. Note: Les suppléments peuvent être congelés, conservés à -20 ° C et ajoutés aux médias le jour exigé.
  3. Dissocier les neurones du ganglion spiral de post-natales jour chiots 4-7 de rat comme décrit précédemment 20,21, noustion à la fois enzymatique (trypsine à 0,025% et 0,001% DNase I) et les techniques mécaniques. Reportez-vous à Whitlon et al. 22 et Vieira et al. 23 pour les procédures détaillées de ganglion spiral culture de neurones, ou Parker et al. 24 pour une démonstration de l'isolement columelle.
  4. Aspirer une solution de poly-L-ornithine/laminin restant des lamelles et laver rapidement avec NBM.
  5. Ajouter 150-200 ul de la spirale suspension des neurones du ganglion dissocié les lamelles et les placer dans un incubateur (37 ° C, 10% de CO 2). Note: jusqu'à 20 lamelles peuvent être préparés à partir d'une portée moyenne de 8 ratons.
  6. Quatre heures après neurones de placage, aspirer la solution pour éliminer les débris cellulaires et les remplacer par 150-200 ul réchauffé NBM frais. Note: les médias peuvent exiger ravitaillement quotidien pour éviter la déshydratation.
  7. Retour lamelles à l'incubateur jusqu'à ce que nécessaire pour les enregistrements électrophysiologiques. Note: spirale dissociédes cultures de neurones ganglionnaires peuvent être utilisés pour des expériences électrophysiologiques quatre heures après la dissociation et jusqu'à deux jours après. Temps in vitro doit être pris en compte lors de l'analyse des résultats. Reconstituer NBM toutes les 24-48 heures.

2. Préparation pour les enregistrements de patch-clamp

  1. Préparer des solutions
    1. Solution intracellulaire (micropipette): 115 mM de K-gluconate, 7 mM de KCl, 10 mM HEPES, 0.05 mM EGTA, 2 mM de Na 2 ATP 2 mM MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP (ajuster le pH à 7,3 avec KOH; ajuster à 295 mOsmol / kg avec du saccharose). Faire passer la solution à travers un filtre stérile (0,2 um) et diviser en portions de 200 ul à être stockés à -20 ° C jusqu'au jour de l'enregistrement.
    2. (Baignoire) solution extracellulaire: NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 10 mM, 10 mM de glucose (ajuster le pH à 7,4 avec NaOH; ajuster à 300-310 mOsmol / kg de saccharose) . Cette solution est faite le jour de l'enregistrement.
  2. Préparer Pipette d'enregistrement avec une résistance de 2-6 MQ. On utilise un laser CO 2 extracteur (P-2000; Sutter Instruments) et de verre au borosilicate (diamètre extérieur de 1,0 mm, 0,58 mm de diamètre intérieur, longueur 75 mm).
  3. Préparer le laser. Ce protocole est destiné à être utilisé avec un laser à fibre couplée, comme l'infrarouge nm Nerve Stimulator 1,870 de OptoTech P / L. La fibre optique utilisée pour la livraison de la lumière dans nos expériences est une fibre en silice de diamètre noyau / gaine 200/220 um avec une ouverture numérique de 0,22 et connecteurs FC-PC aux deux extrémités (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Les cordons de raccordement ont été coupés en deux pour produire deux nattes de fibres (c.-à-connectorisé à une extrémité, et coupé à l'autre). Les effets du diamètre du noyau de la fibre et ouverture numérique laser changements de température induits ont été examinées en détail par Thompson et al. 25
    1. Cliver l'extrémité de la fibre de distribution de lumière en utilisant des techniques standardset de veiller à ce que la pointe qui en résulte est d'une grande qualité de l'observation avec un microscope optique (la pointe doit être perpendiculaire à l'axe de la fibre et apparaissent à plat lors de l'inspection visuelle). Connecter la fibre de distribution de lumière pour la sortie de la fibre à couplage du laser de stimulation à l'aide d'un connecteur approprié travers (par exemple Thorlabs ADAFC2).
    2. Mesurer la puissance de sortie du laser à partir de la pointe clivée de la fibre de distribution de lumière à l'aide d'un instrument approprié (par exemple FieldMate cohérent avec LM-3 tête de détection). Il est recommandé de vérifier la puissance du laser à chaque fois que la fibre de livraison lumière est clivé ou un ajustement significatif est faite au laser (par exemple, le transport d'un laboratoire à l'autre).
    3. Insérez la fibre de livraison de la lumière dans un mandrin de fibres ou un dispositif équivalent et fixer le mandrin à la micropositionneur approprié. Il est important de pouvoir déterminer avec précision l'angle θ que la fibre optique permet à la lamelle. Cette angle peut être mesurée par la prise d'une photographie du dispositif expérimental et en utilisant un logiciel de traitement d'image (par exemple ImageJ) pour obtenir l'angle. L'angle θ (ou plage d'angles possibles) est principalement contraint par les limites spatiales du dispositif expérimental - en particulier le microscope. Les valeurs typiques de θ dans nos expériences (basé sur un microscope droit) sont autour de 36 °, mais l'angle optimal peut varier de manière significative pour les configurations alternatives (par exemple ceux utilisant un microscope inversé).
    4. Établir des liens entre le laser et le système d'acquisition de données de patch-clamp (par exemple Digidata 1440A, Molecular Devices) comme le montre la figure 2. La sortie numérique du système d'acquisition de données de patch-clamp doit être connecté au laser par l'intermédiaire d'un générateur de fonction externe, ce qui permet de spécifier des paramètres d'impulsions laser indépendants du système d'acquisition de données. En variante, cette sortie peut être connectée directement àl'émetteur laser (nécessitant la longueur d'impulsion et de taux de répétition pour être définis par le logiciel d'acquisition de données). Dans les deux cas, le signal utilisé pour déclencher le laser doit être connecté sur une entrée du système d'acquisition de données pour assurer que la synchronisation et la durée des impulsions laser peuvent être enregistrées en même temps que le signal électrophysiologique.

3. Patch enregistrements de serrage pour l'enquête de l'INS

  1. Remplir le récipient approprié du système de perfusion avec une solution extracellulaire et régler le débit de perfusion pour fournir du bain à un débit de 2.1 ml / min. On utilise un système alimenté par gravité (bouteille d'aspiration, vanne à manchon, et la tuyauterie PE) avec un dispositif de chauffage en ligne pour permettre le chauffage rapide de la solution, et une pompe péristaltique pour retirer solution usée par aspiration.
  2. Placer une lamelle couvre-objet avec des cellules cultivées dans la chambre d'enregistrement (bain) d'un microscope droit. L'utilisation d'un objectif à l'eau d'immersion fort grossissement (e. G. 40X) et à contraste de phase (par exemple le contraste d'interférence différentiel ou le contraste de gradient Dodt), de localiser visuellement les neurones du ganglion spiral au sein de la culture. Un neurone de ganglion spiral est typique de phase lumineuse, ronde et environ 15 um de diamètre avec un noyau de premier plan, comme représenté sur la figure 1a.
  3. Une fois qu'un neurone a été localisé, passer à un objectif de plus faible grossissement (par exemple 10X) et de localiser le neurone cible dans le champ visuel.
  4. Déplacer la fibre optique de distribution de lumière en position en utilisant la procédure suivante (ou équivalent):
    1. Utilisation du micropositionneur pour déplacer la fibre de sortie jusqu'à ce que la pointe se trouve à proximité du neurone cible dans les plans horizontal et vertical. La position verticale de l'extrémité de la fibre peut être contrôlée par le déplacement de l'objectif vers le haut et vers le bas (du point de balayage).
    2. Revenez à l'objectif à fort grossissement et positionner la pointe de la fibre optique dans sa position prévue à côté de til neurone (voir Figure 2 en médaillon). Lors du réglage de la position verticale de la fibre, il est important que le bord inférieur de la fibre repose sur (ie juste toucher) la lamelle, afin de minimiser l'incertitude dans la localisation de la fibre. L'alignement optimal dans le plan horizontal dépend de l'angle θ que fait la fibre avec la lamelle couvre-objet et le rayon r de la fibre. Pour positionner la fibre de telle sorte que le centre du neurone cible est situé le long de l'axe de la fibre, la distance horizontale entre le bord supérieur de la fibre et de la cellule cible soit
      Δ target = r (COSEC θ - 2 sin θ),
      où les valeurs négatives semblent indiquer que les surplombs de fibres optiques de la cellule. Lors de l'alignement de la fibre, une distance de cible Δ entre le bord supérieur de la fibre et le centre du neurone peut être approximativement par inspection visuelle. Cependant Δ cible est conçu pourservir de guide approximatif. Le positionnement de la fibre de telle sorte que la distance réelle Δ entre le bord supérieur de la fibre et le centre du neurone diffère de façon mesurable de Δ cible (comme sur la figure 1) peut donner un aperçu de l'effet à la fois de déplacement radial (c'est à dire du centre de l' faisceau) et déplacement axial (à savoir le long de l'axe des fibres) de la poutre par rapport au neurone cible. Par exemple, la mise en Δ on s'attendrait ≈ 0 pour augmenter la température locale au voisinage de la cellule - c'est à dire depuis le profil de faisceau de fibres multimodes typiques est bien approximée par une distribution de chapeau supérieur 26, la diminution de l'énergie absorbée localement (température) en raison du déplacement du centre de la poutre est minime par rapport à l'augmentation de l'énergie absorbée à partir de déplacement de la face d'extrémité de fibre plus près de la cellule.
      Alors il faut prendre soin de positionner la fibre le plus précisément et de manière répétée que possible utilisant des signaux visuels, la mesure précise de l'emplacement de la fibre par rapport au neurone cible (par exemple Δ) est plus important que le positionner à une distance prédéterminée. Δ peut être déterminée (avec une incertitude maximale estimée de ± 3 microns) par analyse d'image comme décrit dans l'étape 3.8.2 du protocole. Dans certaines expériences 5,8, sources de lumière blanche ont été couplés à travers la fibre afin de cibler la cellule souhaitée. Cette approche s'est avérée inefficace dans la configuration du microscope droit, comme l'intensité de la lumière diffusée à partir de la région cible était relativement faible à ces angles peu profonds (θ).
    3. Une fois que la fibre est en position, déplacez-le par une quantité connue de permettre un positionnement simple de la micropipette. La fibre peut ensuite être ramené à la position d'origine lors d'un enregistrement neuronal est obtenue.
  5. Remplissez le micropipette avec une solution intracellulaire et s'insérer solidement en place sur les têtestage de l'amplificateur (par exemple Multiclamp 700B, Molecular Devices). Utilisation de tubes fixé sur le côté du support de micro-électrodes, appliquer une petite quantité d'une pression positive pour éviter le colmatage de la micropipette.
  6. L'utilisation d'un micromanipulateur, déplacez le micro-pipette en position juste au-dessus du neurone cible.
  7. Protocole pour les enregistrements de cellules entières:
    1. Appliquer une 10 ms, +10 mV impulsion d'onde carrée (par exemple test d'étanchéité) en mode voltage-clamp de l'amplificateur et ajuster le potentiel de micropipette (pipette offset) du signal de référence à 0 nA. Le test d'étanchéité doit également être utilisée pour déterminer si la résistance de la microélectrode est dans la plage souhaitée (par exemple, 2-6 MQ).
    2. Tout en surveillant la résistance, en utilisant des réglages fins de la micromanipulateur pour positionner doucement la micropipette sur la surface du neurone cible. Lorsque la micropipette est en contact avec le neurone, la résistance va augmenter (par ~ 0,5 à 1 MQ). Jemmédiatement suite à l'augmentation de la résistance à supprimer la pression de fluide positive et à appliquer une faible pression négative. Une fois que la résistance a passé 10 - 20 MQ, fixer le potentiel de membrane à un niveau de maintien (par exemple autour de -60 mV).
    3. La résistance de l'électrode devrait continuer à augmenter jusqu'à dépasser 1 VA, ce qui signifie que un joint efficace (appelé «gigaseal ') a été formé entre la membrane cellulaire et micro-pipette. À ce stade, retirez toute la pression du fluide à partir de la micropipette.
    4. Une fois que le gigaseal a été formée, en utilisant des impulsions de courant de courte durée (25 à 100 microsecondes; 1 V) ou de brèves impulsions de pression de fluide négative pour rompre la membrane cellulaire et d'atteindre la configuration de la cellule entière.
    5. Enregistrer la capacité de la membrane, la résistance série et une résistance d'entrée tel que déterminé à partir de la courbe exponentielle ajustée pour le courant pendant l'impulsion de test d'étanchéité. Minimiser les transitoires de capacité en réglant les commandes CpFast et CpSlow sur l'amplificateur, puis switch l'amplificateur en mode de cellule entière, et compenser la capacitance et la résistance jusqu'à ce que un courant plat est observé pendant le test d'étanchéité. Appliquer une compensation de la résistance série (~ correction de 70%, 70% prédiction), en ajustant capacitance et la résistance de contrôle pour maintenir une réponse de test d'étanchéité plat.
    6. Passez en mode courant-clamp dans l'amplificateur. Prenez note du potentiel de membrane au repos (en l'absence d'injection de courant). Définir un courant de maintien pour stabiliser le potentiel de membrane au niveau désiré (par exemple 60 mV). Neutraliser la capacité de la pipette et régler la balance de pont pour équilibrer la chute de tension.
    7. Vérifiez les propriétés de cuisson du neurone en stimulant avec dépolarisants actuel (10 à 200 pA à 10 étapes Pa; 300 msec).
    1. Déplacer le retour de la fibre optique dans sa position à côté du neurone. Grâce à un logiciel de formation d'image couplé à une caméra CCD, de capturer des images de la position de la fibre par rapport à la neuro-ciblen, en se concentrant sur ​​le plan du neurone d'abord, puis sur le bord supérieur de la fibre optique (voir Figure 1).
    2. Par analyse ultérieure des images résultantes (par exemple, les figures 1b et 1c), il est possible de déterminer avec précision Δ (la position du bord supérieur de la fibre optique par rapport au centre du neurone cible). Une fois que Δ est connu, des paramètres tels que la distance de la face d'extrémité de fibre au neurone cible (le long de l'axe de la fibre) z et le déplacement radial du neurone du centre de la poutre δ r peuvent être calculées à l'aide des relations trigonométriques simples:
      z = r sin 2θ + Δ cos θ
      δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + Ay 2) 1/2,
      Ay où est la distance entre l'axe de la fibre et le centre du neurone en vue de dessus (par exemple SEe Figure 1).
      L'analyse doit prendre en compte les variations de position de cellule en cellule, que la connaissance précise de ces paramètres de localisation peut être nécessaire pour résoudre les différences possibles entre les processus de stimulation 25.

4. Les expériences de l'INS

  1. Lors de l'enregistrement des données électrophysiologiques dans les deux pince de courant ou des configurations de serrage de tension, exécutez le laser de stimulation dans les paramètres souhaités (par exemple la puissance, durée d'impulsion, taux de redoublement, etc.) Avec notre laser, la puissance optique est commandée par une entrée directe de l'émetteur laser et est spécifiée manuellement avant chaque enregistrement. Durée de l'impulsion et le taux de répétition peuvent être commandés soit par un générateur de signal externe, ou le logiciel d'acquisition de données (tel que décrit dans l'étape 2.3.4). S'assurer que les données sont enregistrées à la fois du canal de patch-clamp, et le canal de déclenchement de laser.

Des impulsions laser avec des longueurs allantd'environ 500 microsecondes à 15 msec et les énergies de ~ 0,25-5 mJ par impulsion céder généralement réponses électriques mesurables. Réglage de la fréquence de répétition des impulsions laser à 1 Hz ou moins peut être utile pour les premières expériences, car il permettra de minimiser les effets de ce paramètre. Les résultats typiques montrant la variation du signal enregistré sont présentés dans la section suivante.

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Representative Results

des neurones du ganglion spiral réagissent à une illumination laser avec répétable formes d'onde en tant voltage-clamp et des configurations d'enregistrement courant-clamp. figure 3a montre l'évolution typique de la circulation du courant à travers une membrane cellulaire en réponse à un 2,5 ms, 0,8 mJ impulsion laser (réponse moyenne à partir de 6 impulsions laser, répétée à intervalle de 1 sec) avec le potentiel de membrane maintenue à -70 mV, -60 mV et -50 mV. Courants entrants nets sont régulièrement évoqués en réponse à des impulsions laser, retour aux valeurs initiales après l'illumination a cessé. La forme des courants induits laser peut être vu à varier le potentiel de membrane est modifié, ce qui indique qu'il peut être important de mener des expériences sur une gamme de potentiels titulaires afin d'acquérir une compréhension complète des processus sous-jacents INS. Ces expériences peuvent être réalisées avec des modifications mineures du protocole actuel et analysés en utilisant des techniques établies telles que la charge-tension (QV) analyse (SEe Référence 7 pour des exemples de courbes obtenues à partir de QV INS in vitro).

Les données présentées dans la Figure 3b sont révélateurs de l'évolution du potentiel de membrane généralement évoqué par un 2.5 msec, soit 0,8 mJ impulsion laser (membrane initiale potentiel 73mV, en moyenne plus de 16 impulsions laser remis à un taux de répétition de 4 Hz). Cette enregistrements-clamp montrent une dépolarisation de la membrane stable au cours de l'impulsion laser suivie d'une diminution approximativement exponentielle vers le potentiel de repos de la membrane après l'impulsion. L'exemple de la figure 3b montre aussi une petite dépolarisation de la membrane supplémentaire à la suite de l'impulsion laser. Shapiro et al. 7 ont montré que les variations induites par laser dans le potentiel de membrane sont étroitement liées à des modifications locales de la température (par exemple la température dans le voisinage immédiat de la cellule). En outre, le modèle décrit par Thompson et al 27.a établi que, sous certaines conditions d'alignement, la diffusion résultant de gradients de température axiaux et radiaux dans la région éclairée peut conduire à des variations de température locales ressemblant étroitement les variations de potentiel de membrane présentés dans la figure 3b. À la suite de ces résultats, on pense que la position de la cellule cible par rapport à la face d'extrémité de la fibre de livraison lumière joue un rôle important dans la détermination à la fois l'évolution temporelle des variations laser évoqués dans le potentiel de membrane et la température maximale dans la région de la cellule.

Illuminant avec une énergie excessive ou l'exposition à de fortes augmentations de température peut endommager le neurone cible. Cela peut souvent être observé à travers la détérioration des propriétés électriques cellule (par exemple une augmentation brusque de courant nécessaire pour maintenir le potentiel de membrane à un niveau stable, et / ou une grande augmentation du bruit et de l'instabilité dans le signal). Dans le cas extrêmes la mort cellulaire se produit presque instantanément lors de l'exposition au laser. figure 4 montre un enregistrement voltage-clamp de la mort d'un neurone du ganglion spiral résultant de l'exposition à un 25 ms, 8 MJ impulsion laser.

Figure 1
Figure 1. images de contraste de phase montrant un neurone de ganglion spiral typique et les positions relatives des fibres optiques et micro-pipette (comme vu ci-dessus) au cours des expériences de stimulation optique. a) spirale typique des neurones du ganglion. b) La fibre optique en position (image est focalisée sur le dessus bord de la fibre optique) c) images superposées montrant la position fibre par rapport à la cellule (note:. le bord supérieur de la fibre est légèrement en surplomb de la cellule ie Δ est négatif). Comme on le voit ci-dessus, y δ et Del &TA; sont le déplacement radial du centre de neurone à l'axe de la fibre et la distance à partir du bord supérieur de la fibre vers le centre du neurone respectivement. Les flèches indiquent la position du ganglion neurone en spirale. barres d'échelle 20 um.

Figure 2
Figure 2. Schéma du dispositif expérimental pour des expériences de stimulation optique (pas à l'échelle) Encart:. Position de la fibre optique et micro-électrodes par rapport à la cellule cible. θ, Δ et z sont tels que définis dans les étapes de protocole 3.4.2 et 3.8.2.

Figure 3
Figure 3. A) Voltage-clamp (réponse moyenne de 6 impulsions laser deliverouge à une fréquence de 1 Hz) et b) de courant-clamp (réponse moyenne de 16 impulsions laser répétée à un taux de 4 Hz) des enregistrements de spirale neurones ganglionnaires indiquant laser modifications induites dans la membrane des potentiels de courant et de la membrane lors de l'illumination par un 2,5 msec , 0,8 mJ impulsion laser. Les zones ombrées indiquent le moment de l'exposition au laser. Encarts montrent des réponses pendant l'illumination laser plus en détail. Remarque: le médaillon en a) se concentre sur le tracé obtenu avec un potentiel de membrane de -60 mV. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4
Figure 4. Enregistrement Voltage-clamp montrant la mort cellulaire résultant de l'exposition à un (25 ms, 8 MJ) impulsions laser extrêmement énergique. Notez que l'amplitudele signal est représenté en nA et est nettement plus grande que les courants de pA illustrés à la figure 3.

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Discussion

En utilisant les protocoles décrits dans le présent document, il est possible d'extraire et de la culture des neurones du ganglion spiral et d'enquêter sur l'activité électrique au laser évoqué en effectuant ensemble des expériences de patch-clamp de la cellule. Lorsqu'ils sont utilisés in vitro, la technique de patch-clamp offre un niveau de contrôle sur les paramètres expérimentaux qui n'est pas réalisable in vivo. les paramètres de stimulation de laser tels que la longueur d'onde, l'énergie d'impulsion, durée d'impulsion, la forme d'impulsion, et des séquences de répétition des impulsions peuvent être étudiés dans un cadre reproductible. En outre, l'environnement dans lequel les neurones sont maintenus (par exemple la température de la solution, les facteurs chimiques) peut être systématiquement variées, ce qui permet d'étudier les propriétés de la membrane et donc les mécanismes sous-jacents stimulation neurale infrarouge. L'interaction entre les modalités de stimulation électrique et optique peut aussi être effectué de manière contrôlée. Ces études fondamentales peuvent être plus avancée en introduisant fluorescentes sondes pour surveiller des paramètres supplémentaires tels que les concentrations ioniques ou l'expression de protéines de choc thermique. Une bonne compréhension de ces différents paramètres est non seulement essentielle pour parvenir à une compréhension complète du phénomène, mais aussi pour obtenir une stimulation plus efficace grâce à l'optimisation des processus.

En raison du rôle important joué par la température dans le mécanisme de l'INS 5-7, mesure précise de la chaleur localisée due à l'éclairage laser est d'une importance primordiale dans la définition de ce mécanisme 27. Procédé détaillée de l'obtention de mesures de température calibrées en enregistrant le courant circulant à travers une pipette de patch ouvert a été décrite par Yao et al. 28 et occupée par de nombreux auteurs, pour déterminer l'amplitude et l'évolution temporelle de laser changements de température induits dans des milieux représentatifs de ceux observée in vitro (par exemple, voir les références 7, 8). FournirD la position de la fibre de distribution de lumière peut être déterminée de façon précise (par exemple en utilisant le protocole actuel), cette méthode de mesure de température est susceptible de permettre la cartographie précise de la variation locale de la température due à des stimuli de l'INS typiques.

La longueur d'onde du laser stimulant est un paramètre qui doit être pris en compte dans les expériences de l'INS, depuis laser changements de température induits (et donc les mécanismes sous-jacents INS) sont médiés par les longueurs d'onde caractéristiques d'absorption dépendent de l'eau 7 (voir Thompson et al. 25 pour une discussion détaillée des effets de longueur d'onde attendus). Mis à part le nm laser à diode 1,870 utilisé dans ce protocole (Infrared Nerve Stimulator, Optotech P / L), une variété de longueurs d'onde et des forfaits de laser ont été utilisées par d'autres auteurs. Quelques exemples communs des lasers utilisés dans les publications de l'INS existants sont: des diodes lasers de Aculight avec des longueurs d'onde allant de 1,840-1,940 nm 6,7,10,13,16-18; Holmium: YAG (2,12 um) du Laser 1-2-3 6,11,12,14,15, et des diodes laser fonctionnant à 1875 nm 5,8, 1,470 nm 8 et 1,535 nm 8 de Sheaumann laser.

Un inconvénient potentiel de l'application de cette technique à des neurones du ganglion spiral culture est qu'en raison de la taille relativement petite des neurones (~ 10-15 um de diamètre), l'électrode d'enregistrement est directement éclairé par le laser. Il a été suggéré que l'illumination laser au-delà d'un certain seuil peut modifier les propriétés du circuit d'enregistrement 7 (c.-joint et de résistance pipette). Shapiro et al. 7 de ce seuil mesurée en surveillant la variation du potentiel d'inversion des courbes QV que la puissance du laser est augmentée, la recherche d'une énergie d'impulsion de seuil de 3 mJ. Comme une approche alternative, il peut être possible de déterminer l'ampleur de cet effet en mesurant la résistance combinée du joint et pipette dans wMode de cellules de trou (par exemple en enregistrant la réponse en cours à un 10 msec, 10 mV impulsion de tension) tout en faisant varier la température de la solution extracellulaire. Afin de bien comprendre les mécanismes de l'INS, il est essentiel que le laser changements de résistance induites être évalués et pris en compte.

À ce jour, la majorité des travaux expérimentaux concernant stimulation neurale infrarouge a été réalisée in vivo. Alors que les seuils d'exposition au rayonnement infrarouge rapportés pour la stimulation in vivo varient quelque peu (par exemple 0,32 Jcm -2 à 2,12 um pour rat nerfs sciatiques 1, <0,1 Jcm -2 à 1.855 um pour les nerfs auditifs gerbille 18), ils sont nettement inférieurs aux seuils déterminés par études in vitro (par exemple environ 20 Jcm -2 à 1,875 um pour les cellules ganglionnaires de la rétine de souris et des cellules ganglionnaires vestibulaires de rat 5,8, 8,3 J cm -2 pour rat cardiomyocytes néonatauxcytes 9). A ce stade, les détails du processus de l'INS ne sont pas suffisamment bien comprises pour spéculer sur la cause de cette différence, toutefois, en utilisant des modèles in vitro telles que les neurones auditifs qui ressemblent étroitement aux objectifs du précédent dans le travail vivo peut être avantageux de trouver une explication .

Certains autres modèles in vitro impliquent des cellules plus grandes telles que les ovocytes de Xenopus (~ 1 mm de diamètre) utilisés par Shapiro et al. 7 Ceux-ci peuvent être utiles pour sonder les variations spatiales de l'efficacité de l'INS dans des cellules individuelles afin de déterminer si les composants cellulaires sont influencées par stimulation. Des modèles plus simples telles que des vésicules bicouches lipidiques peuvent permettre un contrôle encore plus précis de paramètres expérimentaux que dans les expériences in vitro, cependant ces modèles sont un peu limitées dans leur portée et ne peuvent révéler toute la complexité de l'INS.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Conseil australien de la recherche sous Linkage subvention projet LP120100264.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

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References

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