Подготовка Mgm101 рекомбинации белка на основе МВР тегов стратегии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Митохондриальных белков дрожжей нуклеоидом, Mgm101, является Rad52 типа рекомбинации белок, который образует крупные олигомерные кольцами. Протокол описан подготовить растворимых рекомбинантных Mgm101 использованием белок, связывающий мальтозу (МВР)-тегов стратегия в сочетании с катионообменной хроматографии и гель.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ген MGM101 был определен 20 лет назад за его роль в поддержании митохондриальной ДНК. Исследования, проведенные в нескольких группах показали, что белок Mgm101 участвует в рекомбинационной репарации митохондриальной ДНК. Недавние исследования показали, что Mgm101 связана с Rad52 типа белка семейства рекомбинации. Эти белки образуют крупные олигомерные кольца и содействие отжига гомологичных одноцепочечной молекулы ДНК. Тем не менее, характеристика Mgm101 было затруднено из-за сложности в производстве рекомбинантного белка. Здесь надежный способ получения рекомбинантного Mgm101 описано. Белок, связывающий мальтозу (МВР) с метками Mgm101 впервые экспрессируется в E. coli. Слитый белок сначала очищали аффинной хроматографией амилозы. После освобождения путем протеолитического расщепления, Mgm101 отделена от MBP с помощью хроматографии катионного обмена. Монодисперсные Mgm101 затем получаютпо размеру хроматографии. Выход ~ 0,87 мг Mgm101 на литр бактериальной культуры может быть получена регулярно. Рекомбинантный Mgm101 имеет минимальное загрязнение ДНК. Подготовленные образцы успешно используются для биохимических, структурных и одна частица изображений анализы Mgm101. Этот протокол может также использоваться для получения других больших олигомерные ДНК-связывающих белков, которые могут быть неправильно свернутых и токсичными для бактериальных клеток.

Introduction

Гомологичной рекомбинации важных для ремонта разрывов двойной нити (ДР) и interstrand поперечные связи, а для повторной инициации репликации ДНК из-под разрушенных вилки репликации 1. В обычной гомологичной рекомбинации, центральный реакция катализируется АТФ-зависимый рекомбиназы включая RecA у прокариот и Rad51 и Dmc1 у эукариот 1-3. Эти рекомбиназ образуют нуклеопротеином нитей на одноцепочечной ДНК, которые необходимы для начала поиска гомологии и прядь вторжения в дуплекс ДНК-матриц (рис. 1, слева) 4-7. В дополнение к обычной схеме, гомологичной рекомбинации также может иметь место в RecA/Rad51-independent образом (рис. 1, справа). Например, дрожжи Rad52 и Rad59 белки могут непосредственно катализировать отжига комплементарных нитей оцДНК, которые подвергаются по резекции разрывов двухцепочечной ДНК. Этот процесс рекомбинации, известный как петьLe прядь отжига, как правило, не связаны с гомологичными сопряжения с шаблонами двухцепочечной ДНК. После отжига гетерологичных хвосты удаляются экзонуклеазами и ники лигируют к восстановлению 8-10 геном непрерывности. Ремонт по одной пряди механизмом отжига часто сопровождается делеции геномных последовательностей между непосредственно повторяется регионах.

Rad52 принадлежит разнообразная группа белков, которые рекомбинации широко распространены среди бактериофагов 11. Эти белки также известны как Одноместный Strand отжига Белки (SSAPs), основанный на их деятельности в продвижении отжига гомологичных одноцепочечной молекулы ДНК. Лучше всего характеризует SSAPs бактериофага Redβ и Erf от бактериофагов λ и Р22, прямоугольный от профаге RAC и белок от Сак lactococcal ul36 фага. SSAPs структурно характеризуется типичным β-β-β-α раза, хотя сходство практически undetectсостоянии в их первичных последовательностей. Все они образуют большие гомо-олигомерных кольца из 10 - 14 кратной симметрии в пробирке 12-14. Функциональное значение этой характеристики высшего порядка структурной организации не очень хорошо понял.

Мы заинтересованы в понимании механизма гомологичной рекомбинации митохондриального генома. Ранее мы уже определили MGM101 ген, который имеет важное значение для поддержания мтДНК в Saccharomyces CEREVISIAE 15. MGM101 Впоследствии было обнаружено, связаны с митохондриальной нуклеоидах и необходима для допуска мтДНК с ДНК-повреждающих агентов 16. Тем не менее, изучение Mgm101 был проведен еще в последнее десятилетие из-за сложности для получения рекомбинантного Mgm101. Мы недавно удалось получить растворимые Mgm101 в больших количествах из E. палочка помощью MBP-Fusion стратегии. Это позволило нам продемонстрировать, что Mgm101 акцийбиохимические и структурные сходства с Rad52-семейства белков, 17,18. В этом отчете, трехступенчатой ​​очистки процедура описана, который производит однородную Mgm101for биохимических и структурного анализа (рис. 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Предшествующие исследования показали, что первый аминоконцевой 22 остатков Mgm101 расщепляются после импорта в митохондрии 19. Для экспрессии в E. coli, MGM101 открытую рамку считывания, лишенный первых 22 кодона, амплифицируют с помощью ПЦР и размещенный ниже по течению от мужской последовательности, кодирующей белок, связывающий мальтозу (MBP) в модифицированной версии вектора экспрессии pMAL-Н2О. Это создает MBP-Mgm101 слияния с линкер, содержащий сайт расщепления протеазы PreScission (рис. 3). Плазмиды впервые построены выбрав E. палочка трансформантах без IPTG и Xgal синий / белый выбора. Полученную в результате плазмиду pMAL-Н2О-MGM101 затем вводят в E. штамме BL21-CodonPlus (DE3)-RIL, выбрав ампициллин и хлорамфеникол колонии, устойчивые.

1. Выражение, индукция, лизис клеток и ДНКаза I Лечение

  1. INOCУлате свежий трансформантов в 10 мл LB-среды (1% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) с добавлением глюкозы (0,2%), ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (50 мкг / мл). Инкубировать при 37 ° CO / N при встряхивании при 200 оборотах в минуту.
  2. Инокулируют 10 мл предварительной культуры в 2 л дополнен LB средой, как указано выше. Расти клетки при 37 ° С с перемешиванием, пока OD 600 не достигнет 0,5.
  3. Индуцируют экспрессию MBP-Mgm101 слитого белка путем добавления изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 0,3 мМ. Расти клетки при встряхивании при 30 ° C в течение 5 часов.
  4. Собирают клетки центрифугированием использованием Beckman JA-10 роторе (5500 мкг, 4 ° С, 10 мин). После удаления супернатанта, ресуспендируют осадок клеток в 30 мл лизирующего буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4 и 1 мМ ЭДТА, рН 7,4), содержащим ингибиторы протеаз (25 мкМ лейпептина, 1 мкМ пепстатина и 1 мМ PMSF).
  5. Разрушать ультразвуком клеточной суспензии на льду в течение 20с использованием ультразвукового процессора (Отопительные системы, модель W-385) при 50% рабочем цикле, дать остыть на льду в течение 30 сек, и повторяется 2 раза.
  6. Добавить 1 мл 1 ДНКазе акции по 2 мг / мл. Rock клеточного лизата при 4 ° С в течение 2 часов.
  7. Регулировка NaCl до конечной концентрации 500 мМ.
  8. Удалить клеточного дебриса путем центрифугирования при 10000 х г при 4 ° С в течение 30 мин.

2. Очистка с помощью аффинной хроматографии Амилоза

  1. Равновесие 1,5 мл амилозы смола (50% суспензии) в буфере для лизиса. Добавить уравновешенной смолы амилозы к клеточного лизата. Rock осторожно при 4 ° CO / N.
  2. Загрузите лизатом смолы смеси на Econo-колонки хроматографии установлен в холодном помещении. Разрешить несвязанных белков передать колонку под действием силы тяжести.
  3. Промыть амилозы смола 300 мл промывочного буфера I (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF).
  4. Повторите мыть с 150 мл промывочного буфера II (20 мм тс.п.-HCl, рН 7,4, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF).
  5. Добавляют 5 мл элюирующего буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF, 10 мМ мальтозы) в колонну, инкубируют при 4 ° С в течение 10 мин, собирают элюата и повторить в течение более раз.
  6. Смешайте элюата, определяют выход и чистоту MBP-Mgm101 путем загрузки аликвоты элюата на SDS-PAGE геле с последующим окрашиванием кумасси (рис. 4).

3. PreScission расщепления протеазы и катионообменной хроматографии

  1. Добавить 50 единиц протеазы PreScission к MBP-Mgm101 элюата. Выполнение расщепления при 4 ° CO / N и дать ему возможность продолжаться в течение диализом против буфера для диализа (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 100 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF)
  2. Проверьте эффективность расщепления на SDS-геле (рис. 5а).
  3. Загрузите расщепленной MBP-Mgm101 несколькими инъекционныеионов на Bio-Scale Картридж Мини Макро-Prep Высокая S подключен к Bio-Rad Биологические системы двухпоточное FPLC.
  4. Начало катионообменной хроматографии с применением ступенчатого градиента соли 5 мМ, 300 мМ, 500 мМ, 750 мМ и 1000 мМ NaCl, которая создается путем смешивания буфера (5 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфат, рН 7,2, 1 мМ PMSF) и буфера B (1 М NaCl, 10 мМ Na-фосфат, рН 7,2, 1 мМ PMSF). Установить расход при 0,5 мл / мин. Собирают фракции Mgm101 и проверки чистоты белка на SDS-PAGE геле (фиг. 5В).

4. Эксклюзионной хроматографии

  1. Объедините белковых фракций из катионообменной хроматографии. Диализировать белка в GF уравновешивающим буфером (20 мМ MOPS, рН 7,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,2 мМ PMSF).
  2. Концентрат белка с Vivaspin 15R колонке спина ультрафильтрации для уменьшения объема до ~ 1 мл центрифугированием при 3000 мкг при 4 ° С.
  3. Загрузите Mgm101 Oпа калиброванный Superose 6 подготовительной класс колонку, уравновешенную хроматографии буфера (20 мМ MOPS, рН 7,0, 150 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, 0,2 мМ PMSF).
  4. Начало эксклюзионной хроматографии с буфером работать при скорости потока 0,5 мл / мин.
  5. Собирают фракции очищенного Mgm101 пиков. Загрузка аликвоты фракций на 12% SDS-PAGE для проверки качества конечного белка.
  6. Концентрат белка с Vivaspin 6, а затем быстро заморозить образцы в жидком N2 и хранят при -80 ° С.
  7. Используйте Mgm101 образцы в течение 6-12 месяцев для одноцепочечной ДНК-анализа связывания (рис. 8) и для структурной визуализации с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mgm101 является Rad52 связанных рекомбинации белка в митохондриях. Rad52 была тщательно изучена за его роль в митохондриальной ДНК-рекомбинации (рис. 1). Рекомбинантный Mgm101 могут быть получены тремя этапами процедуры (рис. 2). Этому способствует использование MBP-тегов стратегию, которая позволит Mgm101 быть выражено в растворимой форме и впоследствии освобождены из тега путем протеолитического расщепления (рис. 3).

При обычном получении, приблизительно 2-3 мг MBP-Mgm101 сплав может быть восстановлен из 1 л бактериальной культуры после амилозы аффинной хроматографии. На SDS-геле, MBP-Mgm101 определяется как основной полосой ~ 70 кДа (рис. 4). Загрязнение других белков минимальна, если смола соответствующим мыть перед элюирования. После расщепления протеазой PreScission, MBP и Mgm101 разделены и показаны в виде полосы 42 кДа и 28 кДа, соответственно, наSDS-PAGE (фиг. 5А). В случае неполного пищеварения, на что указывает присутствие полосы ~ 70 кДа, расширенный пищеварение с дополнительными протеазы PreScission рекомендуется.

Для катионообменной хроматографии расщепленного MBP-Mgm101, MBP не удерживается колонкой перед применением соли (рис. 6). Как правило, Mgm101 элюируют 500 мМ соли без заметного загрязнения MBP (фиг. 5В). Небольшой пик при 300 мМ это иногда видны, что соответствует следовые количества нерасщепленному MBP-Mgm101 синтеза. Вполне возможно, что Mgm101 в этой фракции связан загрязняющие ДНК, что снижает сродство к колонке. Таким образом, катионообменными является необходимым шагом для минимизации загрязнения ДНК.

На рисунке 7 показан заключительный этап Mgm101 очистки гель-проникающей хроматографии. Mgm101 олигомеры обычно элюирования в монодисперсных пикаиз ~ 400 кДа. Некоторые мутантные формы Mgm101 часто видели с увеличенным размером от V0 (объем пустот) и 400 кДа пика. Причина этого до сих пор неизвестно. Мутации, влияющие на олигомеризации Mgm101 может вызывать образование агрегатов, которые элюируют в V0 фракций. Однако, мы никогда не видели пиков, соответствующих мономерных Mgm101. Mgm101 мономеров нестабилен в растворе.

Очищенный Mgm101 имеет высокое сродство связывания с одноцепочечной ДНК (рис. 8). Аффинностью связывания с одноцепочечной ДНК может быть оценена на основе титрованием свободного оцДНК на геле. Комплекс Mgm101/ssDNA плохо мигрирует из скважин. Возможным объяснением является то, что Mgm101 заряжена положительно и связывание нескольких субъединиц Mgm101 к одноцепочечной ДНК нейтрализует его отрицательных зарядов, что делает белок / ДНК комплексов неподвижными под условия электрофореза. При соответствующем подготовлена, Mgm101 связывается с одноцепочечной ДНК Кд ~ 200 нм.

На рисунке 9 показано прямое структурное визуализации очищенной Mgm101 отрицательными пятно просвечивающей электронной микроскопии. Свежеприготовленный Mgm101 в основном присутствует в виде большой олигомерные кольца с диаметром ~ 20 нм. Вместо этого возраста Mgm101 образцы сжатом виде нитей. Эти нити не образуются простым укладки колец. Существует четко по спирали в волокнах. Условия, которые модулируют процесс филаментацию настоящее время ведется расследование. Желательно, чтобы качество белка проверяется на SDS-PAGE после инкубации при 4 ° С в течение старению образцов перед анализом методом электронной микроскопии.

Рисунок 1
Рисунок 1. Упрощенная схема, показывающая, что Rad52 служит посредником для погрузки Rad51 рекомбиназу на сайте рекомбинации в CAканонический путь гомологичной рекомбинации (слева), а также способствует одну прядь отжига зависит от Rad51 (правая панель).

Рисунок 2
Рисунок 2. Общая схема для получения рекомбинантных Mgm101. Mgm101 впервые экспрессируется в E. палочки в MBP-плавленый форме. Бактериальные клетки лизируют ультразвуком. Я ДНКазе пищеварения применяется для уменьшения загрязнения ДНК. MBP-Mgm101 сплав затем очищают от ДНК обедненный лизата с помощью амилозы колонки. После протеолитического расщепления высвобождается Mgm101 и отделен от MBP катионообменной хроматографией. Этот шаг необходим для дальнейшего сокращения загрязнения ДНК. Элюированных Mgm101 фракцию затем очищен до гомогенности путем пропускания его через колонку Superose 6 класс преп.


Рисунок 3. Физическая карта Mgm101 экспрессирующие плазмиды pMAL-Н2О-MGM101. Сайт расщепления протеазы PreScission между MBP и Mgm101 указывается. Протеолитического расщепления выход МВР и Mgm101 с молекулярной массой 42 и 28 кДа, соответственно.

Рисунок 4
Рисунок 4. SDS-PAGE показывает чистоту MBP-Mgm101 слитого белка после амилозы аффинной хроматографии. Концентрацию белка определяли путем измерения оптической плотности при 280 нм и примерно 5 мкг Mgm101 загружается на геле. Гель окрашивали кумасси голубым.

Рисунок 5 Рисунок 5. SDS-PAGE анализа Mgm101. А) выпуск Mgm101 от MBP-Mgm101 слитого белка после расщепления с PreScission протеазы. После расщепления протеазой O / N, аликвоту, содержащую приблизительно 5 мкг белка загружается на геле. Гель окрашивают Кумасси синим. Mgm101 мигрирует немного медленнее, чем ожидаемый размер 28 кДа, в связи с общим положительным зарядом белка по стандарту SDS-PAGE состоянии. B) Mgm101 после отделения от MBP методом катионообменной хроматографии.

Рисунок 6
Рисунок 6. Хроматограмма показывает разделение Mgm101 от MBP катионообменной хроматографией. Отщепленный MBP-Mgm101 вводят в картридж Bio-Масштаб Мини Макро-Prep Высокая S несколько раз. Ступенчатым градиентом соли 5 мМ, 300 мМ, 500 мМ, 750 мм, а 1 000 мМ NaCl затем применяется. Щелкните здесь для просмотра larer фигурой .

Рисунок 7
На рисунке 7. Хроматограмма показывает профиль элюции Mgm101 олигомеров на калиброванных Superose 6 подготовительной класс колонки. Хроматография осуществляется при скорости потока 0,5 мл / мин. Элюированную Mgm101 наблюдается как пик ~ 400 кДа. V0: объем пустот. Щелкните здесь для просмотра larer фигурой .

Рисунок 8
Рисунок 8. Методом сдвига электрофоретической подвижности, показывающие, что очищенный Mgm101 имеет надежную активность связывания с одноцепочечной ДНК. 1,25 х 10 -3 2, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, 10% глицерин, 1 мМ DTT, 50 мкг / мл BSA и 1 мМ PMSF. После инкубации при комнатной температуре 30 мин, образцы загружают на 6% коренных гель акриламида и работать в буфере TBE 0.5X при 4 ° C.

Рисунок 9
Рисунок 9. Электронные микрофотографии, показывающие, что структурная организация свежие (слева) и возраста (правая панель) Mgm101. Отрицательное окрашивание просвечивающей электронной микроскопии осуществляется с использованием JEM-2100 просвечивающего электронного микроскопа (JEOL), работающей при 200 кВ. При отрицательном пятна возраста Mgm101, белок хранится при 4 ° С в буфере GF (20 мМ MOPS, рН 7,0, 150 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF) в течение 4 недель перед анализом. (Фото д-ра Стефана Wilkens).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это был вызов для получения стабильного, родные рекомбинантного белка из Mgm101 E. кишечной возможно, из-за его нерастворимость в бактериальных клетках. В этом докладе, мы покажем, что MBP-Fusion стратегии позволяет белку быть выражены на достаточно высоком уровне. При использовании отрицательной микроскопии на просвет окрашивание электронов и эксклюзионной хроматографии, ранее мы показали, что MBP-слитый белок образует единую олигомеров в пробирке 18. Вполне возможно, что складывание и олигомеризации Mgm101 может быть медленнее в бактериальных клетках по сравнению с митохондриальной матрицы. Unoligomerized Mgm101 может быстро образуют агрегаты, которые являются токсичными в естественных условиях. MBP-тегов может держать Mgm101 в растворимом конформацию, которая позволяет продуктивно олигомеризации и снижает его токсичность.

Важным критерием хорошего качества подготовки Mgm101 должен иметь минимальное загрязнение ДНК. 280 / 280/260 соотношение ниже этого уровня, расширенные с пищеварением ДНКазе Я рекомендуется. В будущем, это может быть полезно, чтобы убедиться, переваривание нуклеазой S1 и РНКазы может еще больше снизить загрязнение нуклеиновых кислот.

Ранее мы показали, что хранение Mgm101 при 4 ° С в течение нескольких недель индуцирует образование длинных спиральных нитей 17. Механизм формирования нитей не изучены. Чрезмерное филаментацию влияет на растворимость белка. Таким образом, настоятельно рекомендуется, чтобы аликвотам свежеприготовленный Mgm101 белка быстро замораживали в жидком азоте последующим хранением при -80 ° С. ДНК-связывающих активность белка остается неизменным после 6-12 месяцев хранения UNDER этих условиях.

Этот протокол также может быть использован для получения мутантных белков Mgm101. Государство олигомеризации и стабильность Mgm101 часто зависит от мутаций. Мягкий мутации могут вызвать частичное осаждение очищенных белков на отщепление от МВР. В этом случае увеличение объема культуры до 6 литров может обеспечить достаточное выход стабильной очищенных белков с гель-проникающей хроматографии. Тяжелые мутации, затрагивающие олигомеризации может разрешать производство белков в MBP-конденсированные формы, но белок не может быть стабильным после удаления MBP.

Таким образом, текущий протокол надежной, который позволяет высокий уровень экспрессии большого Mgm101 олигомерные кольца в E. палочки. Этот протокол может быть адаптирован к производству Mgm101 ортологи 20, 21 и других олигомерных белков, особенно когда растворимость этих белков низка в бактериальных клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Стефан Wilkens за помощью в просвечивающей электронной микроскопии. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант R01AG023731.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics