إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الخميرة الميتوكوندريا البروتين نوواني، Mgm101، هو من نوع البروتين Rad52 إعادة التركيب التي تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة. يوصف بروتوكول لإعداد Mgm101 المؤتلف للذوبان باستخدام البروتين ملزمة مالتوز (ب ب) الجغرافية الاستراتيجية إلى جانب تبادل الأيونات الموجبة وحجم الاستبعاد اللوني.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تم التعرف على الجين MGM101 قبل 20 عاما لدوره في الحفاظ على الحمض النووي. واشارت دراسات عدة مجموعات من أن البروتين Mgm101 وتشارك في إصلاح تهجيني من الحمض النووي. وأشارت التحقيقات الأخيرة التي Mgm101 تتعلق Rad52 من نوع إعادة التركيب عائلة البروتين. هذه البروتينات تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبير وتعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. ومع ذلك، فقد أعاقت توصيف Mgm101 من صعوبة في إنتاج البروتين المؤتلف. هنا، يوصف إجراء موثوق بها لإعداد المؤتلف Mgm101. المالتوز البروتين ملزمة (ب ب) الموسومة Mgm101 يتم التعبير الأول في الإشريكية القولونية. يتم تنقيته من البروتين الانصهار في البداية من قبل أميلوز تقارب اللوني. بعد إطلاق سراحه من قبل انشقاق بروتين، يتم فصل Mgm101 من MBP بواسطة الموجبة اللوني الصرف. يتم الحصول على Monodispersed Mgm101 ثمحسب حجم الاستبعاد اللوني. العائد من ~ 0.87 ملغ من Mgm101 للتر الواحد من ثقافة البكتيرية ويمكن الحصول بشكل روتيني. وMgm101 المؤتلف ديه الحد الأدنى من التلوث من الحمض النووي. يتم استخدام عينات معدة بنجاح لالبيوكيميائية والهيكلية واحد الجسيمات تحليلات صورة Mgm101. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لإعداد البروتينات الحمض النووي ملزم بلازميدة قليلة القسيمات الكبيرة الأخرى التي يمكن أن تتجمع وسامة للخلايا البكتيرية.

Introduction

إعادة التركيب مثلي المهم لإصلاح مزدوج الجديلة فواصل (DSBs) وinterstrand crosslinks، وباستعادة تكرار الحمض النووي من تكرار الشوك المنهارة 1. في إعادة التركيب مثلي التقليدية، يتم تحفيز رد الفعل المركزي من قبل recombinases التي تعتمد على ATP بما في ذلك RECA في بدائيات النوى، وRad51 وDmc1 في حقيقيات النوى 1-3. هذه recombinases تشكيل خيوط البروتين النووي على ssDNA، التي تعتبر ضرورية للبدء في البحث عن التماثل وغزو حبلا ضمن قوالب الحمض النووي المزدوجة (الشكل 1، لوحة اليسار) 4-7. بالإضافة إلى مخطط التقليدية، ويمكن إعادة التركيب مثلي أيضا أن تأخذ مكان بطريقة RecA/Rad51-independent (الشكل 1، لوحة على اليمين). على سبيل المثال، يمكن أن الخميرة Rad52 وRad59 البروتينات تحفز بشكل مباشر على الصلب من فروع ssDNA التكميلية التي يتعرض لها من قبل resectioning من فواصل dsDNA. هذه العملية إعادة التركيب، والمعروفة باسم الغناءجنيه حبلا الصلب، وعموما لا تنطوي على الاقتران مثلي مع القوالب dsDNA. بعد الصلب، يتم إزالة ذيول مغاير من قبل exonucleases وو تربط النكات لاستعادة 8-10 استمرارية الجينوم. وغالبا ما يترافق إصلاح من قبل آلية الصلب حبلا واحد عن طريق الحذف من تسلسل الجينوم بين المناطق المتكررة مباشرة.

Rad52 ينتمي إلى مجموعة متنوعة من البروتينات إعادة التركيب التي هي على نطاق واسع بين البكتيريا 11. وتعرف هذه البروتينات أيضا باسم ضفيرة واحدة البروتينات التليين (SSAPs)، على أساس نشاطهم في تعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. أفضل SSAPs البكتيريا تتميز هي Redβ وإيرف من البكتيريا λ وP22، مصحح من RAC طليعة العاثية والبروتين ساك من فج lactococcal ul36. وتتميز هيكليا SSAPs من قبل أضعاف β-β-β-α نموذجي، على الرغم من التشابه هو undetect تقريباقادرة في تسلسل الابتدائي. أنهم جميعا شكل حلقات هومو بلازميدة قليلة القسيمات كبير من 10-14 أضعاف التناظر في المختبر 12-14. الآثار الوظيفية لهذه المنظمة مميزة مرتبة أعلى الهيكلية ليست مفهومة جيدا.

ونحن مهتمون في فهم آلية إعادة التركيب مثلي في الجينوم الميتوكوندريا. حددنا سابقا الجين MGM101 التي لا غنى عنها للحفاظ على و mtDNA في خميرة الخباز 15. تم العثور MGM101 في وقت لاحق أن تكون مرتبطة مع nucleoids الميتوكوندريا ومطلوب من أجل التسامح و mtDNA من الحمض النووي للعوامل المضرة 16. ومع ذلك، فقد تم عقد دراسة Mgm101 مرة أخرى في العقد الماضي من قبل صعوبة لإنتاج Mgm101 المؤتلف. لقد نجحنا مؤخرا في إنتاج Mgm101 قابل للذوبان في كميات كبيرة من E. القولونية باستخدام استراتيجية MBP الانصهار. وقد مكن هذا لنا لإثبات أن Mgm101 سهمأوجه التشابه البيوكيميائية والهيكلية مع Rad52-عائلة من البروتينات 17،18. في هذا التقرير، وصفت إجراء تنقية ثلاث خطوات، والتي تنتج Mgm101for التحليلات البيوكيميائية والهيكلية متجانس (الشكل 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أظهرت دراسات سابقة أن أول محطة الأمينية 22 مخلفات Mgm101 يتم المشقوق بعد الاستيراد في الميتوكوندريا 19. للتعبير في الإشريكية القولونية، يتم تضخيمه MGM101 إطار القراءة المفتوح تفتقر إلى الكودونات أول 22 بواسطة PCR وضعت المصب من تسلسل ذكر ترميز البروتين ملزمة المالتوز (ب ب) في نسخة معدلة من ناقلات التعبير pMAL-C2E. هذا يولد الانصهار MBP-Mgm101 مع رابط موقع يحتوي على الانقسام لالبروتيني PreScission (الشكل 3). البلازميد هي التي شيدت أول من خلال تحديد E. transformants القولونية دون IPTG وXgal اختيار أزرق / أبيض. ثم يتم إدخال البلازميد الناتج pMAL-C2E-MGM101 في E. كولاي سلالة BL21-CodonPlus (DE3)-ريلاينس اندستريز من خلال تحديد الأمبيسلين والمستعمرات مقاومة الكلورامفينيكول.

1. التعبير، والاستقراء، تحلل الخليوي وأنا الدناز العلاج

  1. شركة النفط الوطنية العراقيةulate transformants الطازجة في 10 مل من المتوسط ​​LB (1٪ Bacto تريبتون، 0.5٪ مستخلص الخميرة، 1٪ كلوريد الصوديوم) تستكمل مع الجلوكوز (0.2٪)، الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (50 ميكروغرام / مل). احتضان عند 37 درجة CO / N مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
  2. تلقيح preculture مل 10 إلى 2 ليتر من المتوسط ​​LB تستكمل على النحو الوارد أعلاه. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية مع الهز حتى تصل إلى 0.5 OD 600.
  3. لحث على التعبير عن بروتين الانصهار MBP-Mgm101 بإضافة الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في تركيز النهائي من 0.3 ملم. تنمو الخلايا مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 5 ساعة.
  4. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي باستخدام بيكمان JA-10 الدوار (5،500 x ج، 4 ° C، 10 دقيقة). بعد تجاهل طاف، resuspend وبيليه خلية في 30 مل من تحلل العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 و 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (25 leupeptin ميكرومتر، ميكرومتر 1 pepstatin A و 1 ملي PMSF).
  5. يصوتن تعليق الخلية على الجليد لمدة 20ثانية باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية (نظم الحرارة؛ نموذج W-385) في دورة العمل 50٪، والسماح لتبرد على الجليد لمدة 30 ثانية، وكرر 2X.
  6. إضافة 1 مل من 1 الأسهم الدناز في 2 ملغ / مل. صخرة المحللة الخلية في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  7. ضبط كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 500 مم.
  8. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي عند 10،000 XG في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

2. تنقية أميلوز مع تقارب اللوني

  1. تتوازن 1.5 مل من راتنج أميلوز (50٪ الطين) في تحلل العازلة. إضافة الراتنج أميلوز معايرتها إلى المحللة الخلية. صخرة بلطف عند 4 درجة CO / N.
  2. تحميل مزيج المحللة الراتنج على عمود اللوني فندق Econo عمود تركيبها في غرفة باردة. السماح للبروتينات غير منضم لتمرير العمود عن طريق الجاذبية.
  3. غسل الراتنج أميلوز مع 300 مل من غسل العازلة الأول (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4؛ 400 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF).
  4. تكرار غسل مع 150 مل من غسل العازلة الثاني (20 ملي TRIS، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF).
  5. إضافة 5 مل من شطف العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF، 10 ملي المالتوز) إلى العمود، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وجمع شطافة وكرر لأكثر من مرة.
  6. الجمع بين eluates، وتحديد العائد ونقاء MBP-Mgm101 عن طريق تحميل قسامة من شطافة على هلام SDS-PAGE تليها coomassie تلطيخ (الشكل 4).

3. PreScission الشق البروتيني والموجبة تبادل اللوني

  1. إضافة 50 وحدة من الأنزيم البروتيني PreScission إلى شطافة MBP-Mgm101. أداء انشقاق في 4 درجات CO / N والسماح لها بمواصلة خلال غسيل الكلى ضد العازلة غسيل الكلى (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم DTT؛ 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF)
  2. تحقق من كفاءة الانقسام على هلام SDS-PAGE (الشكل 5A).
  3. تحميل المشقوق MBP-Mgm101 بواسطة حقن متعددةالأيونات على الحيوية البسيطة مقياس ماكرو الإعدادية عالية S خرطوشة متصلا DuoFlow بيولوجي نظام FPLC بيو راد.
  4. بدء اللوني تبادل الأيونات الموجبة عن طريق تطبيق التدرج خطوة الملح 5 ملم، 300 ملم، 500 ملم، 750 ملم و 1،000 ملم من كلوريد الصوديوم الذي يتم إنشاؤه عن طريق خلط العازلة A (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملي PMSF) والعازلة B (1 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملم PMSF). ضبط معدل تدفق عند 0.5 مل / دقيقة. جمع الكسر Mgm101 والتحقق من نقاء من البروتين على هلام SDS-PAGE (الشكل 5B).

4. حجم اللوني الاستبعاد

  1. الجمع بين الكسور البروتين من اللوني تبادل الأيونات الموجبة. Dialyze البروتين في المخزن موازنة GF (20 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم؛ 1MM EDTA، ودرجة الحموضة 7.4؛ 5 مم 2 المركابتويثانول؛ 0.2 ملم PMSF).
  2. تركيز البروتين مع VIVASPIN 15R الترشيح الفائق عمود الدوران للحد من حجم إلى ~ 1 مل من خلال الدوران في 3،000 XG في 4 درجات مئوية.
  3. تحميل Mgm101 سNA معايرة Superose 6 الإعدادية الصف العمود معايرتها مع العازلة اللوني (20 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي β-المركابتويثانول؛ 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4؛ 0.2 ملم PMSF).
  4. بدء الاستبعاد حجم المخزن المؤقت مع اللوني تشغيل بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة.
  5. جمع الكسور لتنقية Mgm101 القمم. تحميل مأخوذة من الكسور على 12٪ SDS-PAGE لفحص الجودة النهائية من البروتين.
  6. تركيز البروتين مع VIVASPIN 6، ثم تجمد بسرعة العينات في N2 السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  7. استخدام Mgm101 العينات في غضون 6-12 شهرا لفحص ssDNA ملزم (الشكل 8) وعن التصور الهيكلي من قبل انتقال الإلكترون المجهري (الشكل 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mgm101 هو بروتين إعادة التركيب ذات الصلة Rad52 في الميتوكوندريا. وقد درس على نطاق واسع Rad52 لدورها في إعادة التركيب الحمض النووي (الشكل 1). المؤتلف Mgm101 يمكن أن تعده إجراء ثلاث خطوات (الشكل 2). ومما يسهل ذلك عن طريق استخدام استراتيجية MBP الجغرافية التي تسمح Mgm101 أن أعرب في شكل قابل للذوبان وأفرج عنه في وقت لاحق من العلامة التي تشطر بروتين (الشكل 3).

في إعداد نموذجي، حوالي 2-3 ملغ من MBP-Mgm101 الانصهار يمكن استردادها من 1 لتر من ثقافة البكتيرية بعد أميلوز تقارب اللوني. على هلام SDS-PAGE، تم الكشف عن MBP-Mgm101 كنطاق الرئيسية لل~ 70 كيلو دالتون (الشكل 4). التلوث بواسطة بروتينات أخرى هو الحد الأدنى إذا تم غسلها الراتنج مناسب قبل شطف. بعد انشقاق بواسطة البروتياز PreScission، يتم فصل MBP وMgm101 وكما هو مبين العصابات من 42 كيلو دالتون و 28 كيلو دالتون على التواليSDS-PAGE (الشكل 5A). في حالة الهضم غير مكتملة، كما يدل على ذلك وجود فرقة ~ 70 كيلو دالتون، وينصح على الهضم موسع مع البروتياز PreScission إضافية.

لاللوني تبادل الأيونات الموجبة من المشقوق MBP-Mgm101، لا يتم الاحتفاظ MBP حسب العمود قبل تطبيق الملح (الشكل 6). عادة، يتم مزال Mgm101 مع 500 ملم من الملح دون تلوث ملحوظ من قبل MBP (الشكل 5B). ذروة صغيرة في 300 ملي مرئيا في وقت ما، والتي تتطابق مع كمية ضئيلة من uncleaved الانصهار MBP-Mgm101. فمن الممكن أن Mgm101 في هذا الكسر ملزمة تلويث الحمض النووي، مما يقلل من تقارب ملزمة للعمود. وهكذا، تبادل الأيونات الموجبة هي خطوة ضرورية للحد من التلوث الحمض النووي.

ويبين الشكل 7 الخطوة النهائية من Mgm101 تنقية عن طريق حجم الاستبعاد اللوني. والأوليغومرات Mgm101 أزل عادة في ذروة monodispersed من ~ 400 كيلو دالتون. وغالبا ما ينظر بعض أشكال متحولة من Mgm101 مع زيادة الأحجام بين V0 (حجم الفراغ) وذروة كيلو دالتون 400. والسبب في ذلك لا يزال مجهولا. الطفرات التي تؤثر على oligomerization من Mgm101 قد لحث على تشكيل المجاميع التي أزل في الكسور V0. ومع ذلك، فإننا لم أر أبدا قمم المقابلة لMgm101 أحادى. Mgm101 مونومرات من المحتمل غير مستقرة في حل.

المطهرون Mgm101 لها قابلية عالية ملزما للssDNA (الشكل 8). ويمكن تقدير تقارب ملزمة لssDNA على أساس المعايرة من ssDNA الحرة على هلام. مجمع Mgm101/ssDNA يهاجر سيئة للخروج من الآبار. وثمة تفسير محتمل هو أن Mgm101 موجبة الشحنة وملزم من مفارز متعددة من Mgm101 إلى ssDNA يحيد رسوم السلبي الذي يجعل بروتين / الحمض النووي المجمعات قادرة على الحركة في ظل الظروف الكهربائي. عندما أعدت بشكل مناسب، Mgm101 يربط ssDNA مع دينار كويتي من ~ 200 نانومتر.

ق = "jove_content"> الشكل 9 يبين التصور الهيكلي مباشرة للMgm101 تنقيته من خلال السلبية وصمة عار انتقال المجهر الإلكتروني. الطازجة Mgm101 موجود أساسا حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة يبلغ قطرها 20 نانومتر ~. بدلا من ذلك، الذين تتراوح أعمارهم بين Mgm101 عينات تشكل خيوط مضغوط. لا يتم تشكيل هذه الخيوط من قبل التراص بسيطة من حلقات. ومن الواضح أن هناك نمطا حلزونية في الشعيرات. الشروط التي تعدل عملية filamentation هي حاليا قيد التحقيق. فإنه من المستحسن أن نوعية البروتين محددا على SDS-PAGE بعد الحضانة عند 4 درجة مئوية لمدة تتراوح أعمارهم بين العينات قبل أن يتم تحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني.

الشكل 1
الشكل 1. المبسطة الرسم التخطيطي تبين أن Rad52 بمثابة وسيط لتحميل من recombinase البكتيري المحور Rad51 على موقع إعادة التركيب في كاليفورنيا nonical مثلي مسار إعادة التركيب (اللوحة اليسرى)، ويعزز ضفيرة واحدة الصلب مستقلة من Rad51 (اللوحة اليمنى).

الشكل 2
الشكل 2. مخطط شامل لإعداد Mgm101 المؤتلف. وأعرب عن Mgm101 الأولى في E. القولونية في شكل MBP تنصهر. وهي lysed الخلايا البكتيرية بواسطة صوتنة. يتم تطبيق الدناز أنا الهضم للحد من تلوث الحمض النووي. ثم يتم تنقيته من الانصهار MBP-Mgm101 من المحللة الحمض النووي المستنفد باستخدام عمود أميلوز. بعد انشقاق بروتين، ويتم تحريرها Mgm101 وفصلها عن MBP بواسطة اللوني تبادل الأيونات الموجبة. هذه الخطوة كانت ضرورية لزيادة خفض التلوث عن طريق الحمض النووي. ثم يتم تنقيته من مزال Mgm101 جزء لتجانس بتمريرها من خلال Superose 6 الإعدادية العمود الصف.

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الشكل (3)
الشكل (3). الخريطة الفيزيائية للMgm101، معربا عن البلازميد pMAL-C2E-MGM101. يشار إلى موقع الانقسام لالبروتيني PreScission بين MBP وMgm101. عائدات انشقاق بروتين MBP وMgm101 مع الوزن الجزيئي لل42 و 28 كيلو دالتون على التوالي.

الشكل 4
الشكل 4. SDS-PAGE تبين نقاء انصهار بروتين MBP-Mgm101 بعد أميلوز تقارب اللوني. يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر، ويتم تحميل ما يقرب من 5 ميكروغرام من Mgm101 على هلام. اتسخت الجل مع coomassie الأزرق.

الرقم 5 الشكل 5. تحليل SDS-PAGE من Mgm101. A) الإفراج عن Mgm101 من البروتين الانصهار MBP-Mgm101 بعد انشقاق مع البروتيني PreScission. بعد الهضم مع البروتيني O / N، يتم تحميل قسامة تحتوي على ما يقرب من 5 ميكروغرام من البروتين على هلام. اتسخت الجل بواسطة coomassie الأزرق. Mgm101 يهاجر أبطأ قليلا من حجمها المتوقعة من 28 كيلو دالتون، ونظرا لشحنة موجبة العام للبروتين تحت مستوى حالة SDS-PAGE. B) Mgm101 بعد الانفصال عن MBP بواسطة اللوني تبادل الأيونات الموجبة.

الشكل (6)
الشكل (6). كروماتوغرام تظهر فصل Mgm101 من MBP بواسطة اللوني تبادل الأيونات الموجبة. يتم حقن المشقوق MBP-Mgm101 إلى الحيوية البسيطة مقياس ماكرو الإعدادية عالية S خرطوشة عدة مرات. A التدرج خطوة الملح 5 ملم، 300 ملم، 500 ملم، 7ثم يتم تطبيق 50 ملم و 1،000 ملم من كلوريد الصوديوم. انقر هنا لعرض الرقم larer .

الرقم 7
الرقم 7. كروماتوغرام تبين الشخصي شطف من Mgm101 الأوليغومرات على Superose 6 الإعدادية العمود الصف معايرة. يتم تنفيذ اللوني بواسطة بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة. لوحظ Mgm101 مزال باعتبارها ذروة ~ 400 كيلو دالتون. V0: حجم الفراغ. انقر هنا لعرض الرقم larer .

الرقم 8
الرقم 8. الكهربي التنقل التحول فحص تبين أن المطهرون Mgm101 لديه النشاط ملزمة قوية لssDNA. و1.25 × 10 -3 2، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0، و 10٪ الجلسرين؛ 1 ملم DTT؛ 50 ميكروغرام / مل BSA؛ و1 ملم PMSF. بعد الحضانة عند RT لمدة 30 دقيقة، يتم تحميل العينات في الصعود إلى 6٪ هلام الأكريلاميد الأم وتشغيل في المخزن TBE 0.5X في 4 درجات مئوية.

الرقم 9
الرقم 9. الميكروسكوب الكترون تظهر أن التنظيم الهيكلي من الطازجة (اللوحة اليسرى) والذين تتراوح أعمارهم بين (اللوحة اليمنى) Mgm101. ويتم تلطيخ السلبية المجهر الإلكتروني انتقال من استخدام حركة العدل والمساواة-2100 انتقال الإلكترون المجهر (JEOL) التشغيل عند 200 كيلو فولت. لاللطخة السلبية من العمر Mgm101، يتم تخزين البروتين في 4 درجات مئوية في المخزن المؤقت GF (20 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي β-المركابتويثانول؛ 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF) لمدة 4 أسابيع قبل أن يتم تحليلها. (بالإذن من الدكتور ستيفان يلكنز).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد كان التحدي لإنتاج مستقر، وأصلي المؤتلف Mgm101 البروتين من E. القولونية وربما يعود ذلك إلى الذوبان في الخلايا البكتيرية. في هذا التقرير، وتبين لنا أن الاستراتيجية MBP الانصهار يسمح للبروتين أن أعرب على مستوى عال إلى حد معقول. باستخدام السلبية تلطيخ انتقال المجهر الإلكتروني وحجم الاستبعاد اللوني، لقد أظهرنا سابقا أن البروتين MBP الانصهار يشكل الأوليغومرات موحدة في المختبر 18. فمن الممكن أن للطي وoligomerization من Mgm101 قد يكون أبطأ في الخلايا البكتيرية مقارنة مع المصفوفة الميتوكوندريا. وunoligomerized Mgm101 قد تشكل بسرعة المجاميع التي تكون سامة في الجسم الحي. MBP الجغرافية قد تبقي Mgm101 في التشكل القابلة للذوبان التي يسمح oligomerization الإنتاجية ويقلل من سميتها.

معيارا هاما لنوعية جيدة إعداد Mgm101 هو أن يكون الحد الأدنى من التلوث عن طريق الحمض النووي. وA 280 / A 280 / A نسبة 260 هو أقل من هذا المستوى، والهضم موسع مع الدناز ينصح أنا. في المستقبل، قد يكون من المفيد أن نرى ما إذا كان الهضم مع S1 نوكلياز وريبونوكلياز يمكن زيادة خفض تلويث الأحماض النووية.

لقد أظهرنا سابقا أن تخزين Mgm101 في 4 درجات مئوية لمدة بضعة أسابيع الحث على تشكيل خيوط حلزونية طويلة 17. آلية تشكيل خيوط ليست مفهومة جيدا. يؤثر الإفراط في filamentation القابلية للذوبان من البروتين. لذلك، ينصح بشدة أن aliquots من الطازجة Mgm101 بروتين يتم تجميد بسرعة في النيتروجين السائل تليها تخزين في -80 درجة مئوية. النشاط ملزمة الحمض النووي من البروتين دون تغيير بعد 6-12 شهرا من التخزين يوالتانجو هذه الظروف.

ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لإعداد البروتينات متحولة من Mgm101. كثيرا ما تتأثر الدولة oligomerization واستقرار Mgm101 من الطفرات. قد يسبب طفرات خفيفة لهطول جزئي لتنقية البروتينات على الانقسام من MBP. في هذه الحالات، مما يزيد من حجم الثقافة إلى 6 لترات قد تسمح العائد كافية من البروتينات مستقرة تنقيته من حجم الاستبعاد اللوني. الطفرات الحادة التي يعاني منها oligomerization قد تسمح بإنتاج البروتينات في شكل MBP تنصهر، ولكن هذا البروتين قد لا تكون مستقرة بعد إزالة MBP.

وباختصار، فإن البروتوكول الحالي هو موثوق بها والذي يسمح التعبير ارتفاع مستوى كبير Mgm101 حلقات بلازميدة قليلة القسيمات في E. القولونية. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لإنتاج Mgm101 orthologs 20 و 21 و البروتينات بلازميدة قليلة القسيمات الأخرى، وخصوصا عندما ذوبان تلك البروتينات منخفضة في الخلايا البكتيرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر يلكنز ستيفان لمساعدة في انتقال المجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AG023731.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics