Beredning av Mgm101 rekombinationsprotein av MBP-baserade taggning strategi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den jästmitokondriella nucleoid protein, Mgm101, är en Rad52-typ rekombinationsprotein som bildar stora oligomera ringar. Ett protokoll beskrivs för framställning av lösligt rekombinant Mgm101 med maltosbindande protein (MBP)-taggning strategi tillsammans med katjonbyte och storleksuteslutningskromatografi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den MGM101 genen identifierades 20 år sedan för sin roll i upprätthållandet av mitokondrie-DNA. Studier från flera grupper har föreslagit att Mgm101 protein är involverat i den rekombinatoriska reparation av mitokondrie-DNA. Nyligen utförda undersökningar har visat att Mgm101 är relaterad till Rad52-typ rekombinationsprotein familj. Dessa proteiner bildar stora oligomera ringar och främja hybridisering av homologa enkelsträngade DNA-molekyler. Emellertid har karakteriseringen av Mgm101 har hindrats av svårigheten att framställa det rekombinanta proteinet. Här används en tillförlitlig procedur för framställning av rekombinant Mgm101 beskrivas. Maltosbindningsprotein (MBP)-märkta är Mgm101 först uttrycks i Escherichia coli. Fusionsproteinet är initialt renas genom amylos affinitetskromatografi. Efter att ha släppts genom proteolytisk klyvning, är Mgm101 separeras från MBP genom katjonbyteskromatografi. Monodispergerade Mgm101 erhålls däreftergenom storleksuteslutningskromatografi. Ett utbyte av ungefär 0,87 mg Mgm101 per liter bakteriekultur kan rutinmässigt erhållas. Den rekombinanta Mgm101 har minimal kontaminering av DNA. De preparerade proverna används framgångsrikt för biokemiska, strukturella och enstaka analyser partikel bild av Mgm101. Detta protokoll kan också användas för framställning av andra stora oligomera DNA-bindande proteiner som kan misfolded och giftigt för bakterieceller.

Introduction

Homolog rekombination är viktigt för reparation av dubbel-strängbrott (DSB) och intersträng antipyridinantikropp, och för återinsättande av DNA-replikation från kollapsade replikationsgafflar 1. Vid konventionell homolog rekombination, förstörs den centrala reaktion som katalyseras av de ATP-beroende rekombinaser inklusive RecA i prokaryoter, och Rad51 och Dmc1 i eukaryoter 1-3. Dessa rekombinaser bildar nukleoproteinkomplex filament på ssDNA, vilka är nödvändiga för att initiera homologisökning och sträng invasion i duplex-DNA-mallar (Figur 1, vänstra panelen) 4-7. Förutom det konventionella systemet, kan homolog rekombination äger också rum i en RecA/Rad51-independent sätt (figur 1, högra panelen). Exempelvis kan jästen Rad52 och Rad59 proteinerna katalyserar direkt annealing av komplementära ssDNA-strängar som är exponerade genom resectioning av dsDNA-raster. Denna rekombination process, känd som sjungerle sträng glödgning, i allmänhet inte involverar homolog parning med dsDNA mallar. Efter glödgning, är heterologa svansar bort genom exonukleaser och skråmor ligeras att återställa 8-10 genomet kontinuitet. Reparation av enkelsträngen glödgning mekanism åtföljs ofta av deletioner av genomiska sekvenser mellan direkt upprepade regioner.

Rad52 tillhör olika grupper av rekombinationsproteiner som är utbredd bland bakteriofager 11. Dessa proteiner är också kända som enkelsträng Glödgning Protein (SSAPs), baserat på deras aktivitet för att främja hybridisering av homologa enkelsträngade DNA-molekyler. De bäst karakteriserade bakteriofager SSAPs är Redp och Erf från bakteriofager λ och P22, RecT från profagen rac och Sak proteinet från Lactococcus fag UL36. De SSAPs är strukturellt kännetecknas av en typisk β-β-β-α faldigt, även om likheten är så gott undetectstånd i deras primära sekvenser. De alla utgör stora homo-oligomera ringar på 10 - 14-faldig symmetri in vitro 12-14. De funktionella implikationerna av denna egenskap högre ordning organisationsstruktur är inte klarlagd.

Vi är intresserade av att förstå mekanismen av homolog rekombination i mitokondriella genomet. Vi har tidigare identifierat den MGM101 gen som är nödvändig för upprätthållandet av mtDNA i Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 därefter befanns vara associerad med mitokondriella nucleoids och krävs för toleransen av mtDNA till DNA-skadande ämnen 16. Dock har studier av Mgm101 hållits tillbaka under det senaste decenniet av svårigheten att producera rekombinant Mgm101. Vi har nyligen lyckats framställa lösligt Mgm101 vid stora kvantiteter från E. coli använder MBP-fusion strategi. Detta har gjort det möjligt för oss att visa att Mgm101 aktierbiokemiska och strukturella likheter med Rad52-familjen av proteiner 17,18. I denna rapport, är ett tre-steg rening som beskrivs, som producerar homogena Mgm101for biokemiska och strukturella analyser (Figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tidigare studier har visat att de första aminoterminala 22 rester av Mgm101 klyvs efter import till mitokondrier 19. För expression i Escherichia coli, är MGM101 öppna läsramen som saknar de första 22 kodonerna amplifierades genom PCR och placeras nedströms om malE-sekvensen som kodar för det maltosbindande proteinet (MBP) i en modifierad version av expressionsvektorn pMAL-C2E. Detta genererar nämnda MBP-Mgm101 fusion med en linker innehållande ett klyvningsställe för PreScission proteas (Figur 3). Den plasmid först konstrueras genom att välja E. coli transformanter utan IPTG och Xgal blå / vit val. Den resulterande plasmiden pMAL-C2E-MGM101 införs sedan in i E. coli stam BL21-CodonPlus (DE3)-RIL genom att välja ampicillin och kloramfenikol resistenta kolonier.

Ett. Expression, insug, cellys och DNas I-behandling

  1. InocUlate färska transformanter i 10 ml LB-medium (1% Bacto trypton, 0,5% jästextrakt, 1% NaCl) kompletterat med glukos (0,2%), ampicillin (100 | ig / ml) och kloramfenikol (50 pg / ml). Inkubera vid 37 ° CO / N med skakning vid 200 rpm.
  2. Inokulera 10 ml förodling i 2 liter av kompletterat LB-medium som ovan. Odla cellerna vid 37 ° C med skakning tills OD 600 når 0,5.
  3. Inducera uttryck av MBP-Mgm101 fusionsprotein genom att lägga Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) till en slutlig koncentration av 0,3 mM. Odla cellerna med skakning vid 30 ° C under 5 timmar.
  4. Samla cellerna genom centrifugering med användning av en Beckman JA-10-rotor (5500 x g, 4 ° C, 10 min). Efter kasta supernatanten, resuspendera cellpelleten i 30 ml lyseringsbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 och 1 mM EDTA, pH 7,4) innehållande proteashämmare (25 | iM leupeptin, 1 | iM pepstatin A och 1 mM PMSF).
  5. Sonikera cellsuspensionen på is under 20sek med ett ultraljud processor (Heat Systems, Model W-385) vid 50% intermittens, låt svalna på is i 30 sekunder och upprepa 2x.
  6. Tillsätt 1 ml DNAse 1 lager på 2 mg / ml. Rock cellysatet vid 4 ° C under 2 timmar.
  7. Justera NaCl till en slutlig koncentration av 500 mM.
  8. Avlägsna cellrester genom centrifugering vid 10.000 xg vid 4 ° C under 30 min.

2. Rening med amylos affinitetskromatografi

  1. Jämvikt 1,5 ml amylosharts (50% slurry) i lysbuffert. Tillsätt ekvilibrerad amylosharts till cellysatet. Rock försiktigt vid 4 ° CO / N.
  2. Fyll på lysatet-harts blandningen på en Econo-Kolonnkromatografi kolonn installerad i ett kallt rum. Låt de obundna proteinerna att passera kolonnen med hjälp av tyngdkraften.
  3. Tvätta amylosharts med 300 ml av tvättbuffert I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, och 0,2 mM PMSF).
  4. Upprepa tvätta med 150 ml tvättbuffert II (20 mm Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, och 0,2 mM PMSF).
  5. Tillsätt 5 ml elueringsbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, och 0,2 mM PMSF, 10 mM maltos) till kolonnen, inkubera vid 4 ° C under 10 minuter, samla in eluatet och upprepa för fler gånger.
  6. Kombinera eluaten, bestämma utbytet och renheten av MBP-Mgm101 genom laddning av en alikvot av eluatet på en SDS-PAGE-gel följt av Coomassie-färgning (figur 4).

Tre. PreScission proteasklyvningsställe och katjonbytarkromatografi

  1. Lägg 50 enheter PreScission proteas till MBP-Mgm101 eluatet. Utför klyvning vid 4 ° CO / N och låta organet fortsätta under dialys mot dialysbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4, och 0,2 mM PMSF)
  2. Kontrollera effektiviteten i klyvning på en SDS-PAGE-gel (Figur 5A).
  3. Ladda kluvna MBP-Mgm101 av multipel injicerajoner på en Bio-Scale Mini Macro-Prep Hög S patron ansluten till en Bio-Rad Biologic Tvåkanals FPLC-system.
  4. Starta katjonbyteskromatografi genom att applicera en gradient steg salt av 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM och 1,000 mM av NaCl som skapas genom att blanda buffert A (5 mM NaCl, 10 mM Na-fosfat, pH 7,2; ett mM PMSF) och buffert B (1 M NaCl, 10 mM Na-fosfat, pH 7,2, 1 mM PMSF). Ställ in flödeshastigheten på 0,5 ml / min. Samla upp Mgm101 fraktionen och kontrollera renheten av proteinet på en SDS-PAGE-gel (Figur 5B).

4. Size Exclusion Chromatography

  1. Kombinera de proteinfraktioner från katjonbyteskromatografi. Dialysera proteinet i GF jämviktsbuffert (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM 2-merkaptoetanol, 0,2 mM PMSF).
  2. Koncentrera proteinet med Vivaspin 15R Ultrafiltrering spinnkolonn för att reducera volymen till ~ 1 ml genom spinning vid 3000 xg vid 4 ° C.
  3. Ladda Mgm101 ona kalibrerad Superose 6 prep grade kolonn jämviktad med kromatografi-buffert (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
  4. Starta size exclusion med kromatografi buffert kördes vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min.
  5. Samla fraktionerna av de renade Mgm101 toppar. Fyll alikvoter av fraktionerna på en 12% SDS-PAGE för kontroll av den slutliga kvaliteten av proteinet.
  6. Koncentrera proteinet med Vivaspin 6, sedan snabbt frysa proverna i flytande N2 och förvara vid -80 ° C.
  7. Använd Mgm101 prover inom 6-12 månader för ssDNA-bindande analys (Figur 8) och för strukturella visualisering genom elektronmikroskopi (Figur 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mgm101 är en Rad52-relaterat rekombinationsprotein i mitokondrier. Rad52 har studerats för sin roll i mitokondrie-DNA-rekombination (figur 1). Rekombinant Mgm101 kan framställas genom en tre-steg (figur 2). Detta underlättas av användningen av MBP-taggning strategi som tillåter Mgm101 att uttryckas i en löslig form och sedan övergå från taggen genom proteolytisk klyvning (figur 3).

Vid en typisk framställning kan approximativt 2-3 mg MBP-Mgm101 fusion utvinnas från 1 liter bakteriekultur efter amylos affinitetskromatografi. På en SDS-PAGE-gel, är MBP-Mgm101 detekteras som ett huvudband på ~ 70 kDa (figur 4). Kontaminering med andra proteiner är minimal om hartset på lämpligt tvättas före eluering. Efter klyvning av PreScission proteas, är MBP och Mgm101 separeras och visas som band av 42 kDa och 28 kDa respektive påSDS-PAGE (figur 5A). I fallet av ofullständig matsmältning, såsom indikeras av närvaron av en ~ 70 kDa band, är en förlängd digerering med ytterligare PreScission Protease rekommenderas.

För katjonbyteskromatografi av kluvna MBP-Mgm101 är MBP inte bromsas upp i kolonnen innan tillämpningen av saltet (Figur 6). Typiskt Mgm101 eluerades med 500 mM salt utan märkbar förorening med MBP (figur 5B). En liten topp vid 300 mM är någon gång synlig, vilket motsvarar en spårmängd av oklyvt MBP-Mgm101 fusion. Det är möjligt att Mgm101 i denna fraktion är bunden av kontaminerande DNA, vilket minskar bindningsaffinitet till kolonnen. Således är katjonbyte ett nödvändigt steg för att minimera DNA-kontaminering.

Figur 7 visar det sista steget i Mgm101 rening genom storleksuteslutningskromatografi. De Mgm101 oligomerer eluera typiskt i en monodispers toppav ~ 400 kDa. Några muterade former av Mgm101 ses ofta med ökad storlekar mellan V0 (tom volym) och 400 kDa topp. Anledningen till detta är fortfarande okänd. Mutationer som påverkar oligomerisering av Mgm101 kan inducera bildning av aggregat som eluerar i V0 fraktionerna. Dock har vi aldrig sett toppar motsvarande monomera Mgm101. Mgm101 monomerer är sannolikt instabila i lösning.

Den renade Mgm101 har en hög bindningsaffinitet till ssDNA (Figur 8). Bindningsaffiniteten för ssDNA kan uppskattas baserat på titrering av fria ssDNA på gelén. Den Mgm101/ssDNA komplexet migrerar dåligt ur brunnarna. En möjlig förklaring är att Mgm101 positivt laddat och bindningen av flera subenheter av Mgm101 till ssDNA neutraliserar dess negativa laddningar som gör protein / DNA-komplex orörligt under elektroforesförhållanden. När lämpligt förberedd, binder Mgm101 ssDNA med en Kd ~ 200 nM.

Figur 9 visar den direkta strukturella visualisering av den renade Mgm101 genom negativ fläck transmissionselektronmikroskopi. Nyframställd Mgm101 är huvudsakligen närvarande som stora oligomera ringar med en diameter på ~ 20 nm. Istället, de åldrade Mgm101 proven bildar komprimerade filament. Dessa filament bildas inte genom enkel stapling av ringarna. Det finns uppenbarligen ett spiralmönster i filamenten. De villkor som modulerar filamentation processen är för närvarande under utredning. Det är tillrådligt att proteinet kontrollerar kvaliteten på SDS-PAGE efter inkubation vid 4 ° C under de åldrade proven innan de analyserades genom elektronmikroskopi.

Figur 1
Figur 1. Förenklat schematiskt diagram som visar att Rad52 fungerar som medlare för laddningen av Rad51 rekombinas på rekombinationsstället i en canonical homolog rekombination vägen (vänster), och främjar enkel sträng glödgning oberoende av Rad51 (högra panelen).

Figur 2
Figur 2. Övergripande schema för framställningen av rekombinant Mgm101. Mgm101 först uttrycks i E. coli i en MBP-sammansmält formen. Bakterieceller lyseras genom sonikering. DNas I digestion används för att minska DNA-kontaminering. Nämnda MBP-Mgm101 fusion renas därefter från DNA-utarmade lysat med användning av en amylos kolumn. Efter proteolytisk klyvning, är Mgm101 frigörs och separeras från MBP genom katjonbyteskromatografi. Detta steg är nödvändigt för att ytterligare minska föroreningen av DNA. Den eluerade Mgm101 fraktionen renas därefter till homogenitet genom att passera den genom en Superose 6 prep grade kolonn.


Figur 3. Fysisk karta av Mgm101-uttryckande plasmid pMAL-C2E-MGM101. Den spaltningsställe för det PreScission proteas mellan MBP och Mgm101 indikeras. Den proteolytiska spjälkningen ger MBP och Mgm101 med en molekylvikt av 42 och 28 kDa respektive.

Figur 4
Figur 4. SDS-PAGE som visar renheten hos MBP-Mgm101 fusionsprotein efter amylos affinitetskromatografi. Proteinkoncentrationen bestäms genom att mäta absorbansen vid 280 nm och cirka 5 pg av Mgm101 laddas på gelén. Gelén färgades med Coomassie blått.

Figur 5 Figur 5. SDS-PAGE-analys av Mgm101. A) utsläpp av Mgm101 från MBP-Mgm101 fusionsprotein efter klyvning med PreScission proteas. Efter digerering med proteaset O / N, en alikvot innehållande ungefär 5 | ig protein laddas på gelén. Gelén färgades med Coomassie-blått. Mgm101 migrerar något långsammare än den förväntade storleken på 28 kDa, på grund av den totala positiva laddningen hos proteinet under standard SDS-PAGE-tillstånd. B) Mgm101 efter separation från MBP genom katjonbyteskromatografi.

Figur 6
Figur 6. Kromatogram som visar separation av Mgm101 från MBP genom katjonbyteskromatografi. Den klyvda MBP-Mgm101 injiceras i en Bio-Scale Mini Macro-Prep Hög S patron flera gånger. Ett steg saltgradient av 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mm och 1000 mm i NaCl appliceras sedan. Klicka här för att se larer siffra .

Figur 7
Figur 7. Kromatogram som visar elueringsprofilen för Mgm101 oligomerer på en kalibrerad Superose 6 prep grade kolonn. Kromatografi utförs genom att vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min. Den eluerade Mgm101 observeras som en topp på ~ 400 kDa. V0: void volym. Klicka här för att se larer siffra .

Figur 8
Figur 8. Elektroforetisk rörlighet shift assay som visar att den renade Mgm101 har en robust bindningsaktivitet till ssDNA. Den 1,25 x 10 -3 MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8,0, 10% glycerol, 1 mM DTT, 50 | ig / ml BSA, och 1 mM PMSF. Efter inkubation vid rumstemperatur under 30 minuter, proverna laddades på en 6% nativ akrylamidgel och köras i 0,5 X TBE-buffert vid 4 ° C.

Figur 9
Figur 9. Elektronmikrofotografier visar att den strukturella organisationen av färskt (vänster) och äldre (högra panelen) Mgm101. Negativ färgning transmissionselektronmikroskopi utförs med användning av en JEM-2100 transmissionselektronmikroskop (JEOL) som arbetar vid 200 kV. För negativ fläck av åldern Mgm101 det protein lagrades vid 4 ° C i GF-buffert (20 mM MOPS, pH 7,0; ett50 mM NaCl; 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, och 0,2 mM PMSF) under fyra veckor innan de analyseras. (Med tillstånd av Dr Stephan Wilkens).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det har varit en utmaning att skapa en stabil, infödd rekombinant Mgm101 protein från E. coli möjligen på grund av sin olöslighet i bakterieceller. I denna rapport visar vi att MBP-fusion strategi gör att proteinet ska uttryckas på en rimligt hög nivå. Genom att använda negativ färgning transmissionselektronmikroskop och storleksuteslutande kromatografi har vi visat tidigare att MBP-fusionsproteinet bildar enhetliga oligomerer in vitro 18. Det är möjligt att vikningen och oligomerisering av Mgm101 kan vara långsammare i bakteriecellerna jämfört med den mitokondriella matrisen. Den unoligomerized Mgm101 kan snabbt bilda aggregat som är giftiga in vivo. MBP-taggning kan hålla Mgm101 i en löslig konformation som möjliggör produktiv oligomerisering och minskar dess toxicitet.

Ett viktigt kriterium för god kvalitet Mgm101 preparatet ha minimal kontamination av DNA. A 280 / A 280 / A 260 förhållandet är under denna nivå, jag utökade uppslutning med DNAs rekommenderas. I framtiden kan det vara bra att se om klyvning med S1-nukleas och RNas ytterligare kan minska förorenande nukleinsyror.

Vi har tidigare visat att lagring av Mgm101 vid 4 ° C för ett par veckor inducerar bildningen av långa spiralformade filament 17. Mekanismen för filamentbildning är inte klarlagd. Över-filamentering påverkar lösligheten av proteinet. Därför är det starkt rekommenderat att portioner av nylagade Mgm101 protein snabbt fryses i flytande kväve följt av lagring vid -80 ° C. Den DNA-bindande aktiviteten hos proteinet är oförändrad efter 6-12 månaders lagring under dessa villkor.

Detta protokoll kan också användas för framställning av mutanta proteiner av Mgm101. Oligomeriseringen tillståndet och stabiliteten hos Mgm101 ofta påverkas av mutationer. Milda mutationer kan orsaka en partiell utfällning av de renade proteinerna uppmanar klyvning från MBP. I dessa fall, vilket ökar odlingsvolymen till 6 liter kan tillåta tillräcklig sträckgräns av de renade stabila proteiner från storleksuteslutningskromatografi. Svåra mutationer som påverkar oligomerisering tillåta produktion av proteinerna i en MBP-sammansmält formen, men proteinet kan inte vara stabila efter avlägsnande av MBP.

Sammanfattningsvis är den nuvarande protokollet tillförlitlig vilket möjliggör hög expression av stora Mgm101 oligomera ringar i E. coli. Detta protokoll kan anpassas till framställning av Mgm101 ortologer 20, 21 och andra oligomera proteiner, speciellt när lösligheten för dessa proteiner är låg i bakteriecellerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Stephan Wilkens för hjälp i transmissionselektronmikroskopi. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01AG023731.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics