MBP आधारित टैगिंग रणनीति से Mgm101 पुनर्संयोजन प्रोटीन की तैयारी

Biology

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Summary

खमीर मितोचोन्द्रिअल nucleoid प्रोटीन, Mgm101, बड़े oligomeric छल्ले कि रूपों एक Rad52 प्रकार पुनर्संयोजन प्रोटीन है. एक प्रोटोकॉल माल्टोस बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) टैगिंग कटियन विनिमय और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ मिलकर रणनीति का प्रयोग घुलनशील पुनः संयोजक Mgm101 तैयार करने के लिए वर्णित है.

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Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

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Abstract

MGM101 जीन mitochondrial डीएनए के रखरखाव में अपनी भूमिका के लिए 20 साल पहले की पहचान की थी. कई समूहों से अध्ययन Mgm101 प्रोटीन mitochondrial डीएनए के recombinational मरम्मत में शामिल है कि सुझाव दिया है. हाल ही में जांच Mgm101 Rad52 प्रकार पुनर्संयोजन प्रोटीन परिवार से संबंधित है कि संकेत दिया है. ये प्रोटीन बड़े oligomeric के छल्ले के रूप में और मुताबिक़ एकल असहाय डीएनए अणु की annealing बढ़ावा. हालांकि, Mgm101 के लक्षण वर्णन पुनः संयोजक प्रोटीन का निर्माण करने में कठिनाई द्वारा बाधा कर दिया गया है. इधर, पुनः संयोजक Mgm101 की तैयारी के लिए एक विश्वसनीय प्रक्रिया में वर्णित है. Maltose बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) टैग Mgm101 पहले Escherichia कोलाई में व्यक्त किया है. संलयन प्रोटीन शुरू में एमाइलोज आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध होता है. Proteolytic दरार से रिहा होने के बाद, Mgm101 धनायनित विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा MBP से अलग किया जाता है. Monodispersed Mgm101 तो प्राप्त की हैआकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा. जीवाणु संस्कृति के प्रति लीटर Mgm101 की ~ 0.87 मिलीग्राम की एक उपज नियमित रूप से प्राप्त किया जा सकता है. पुनः संयोजक Mgm101 डीएनए की न्यूनतम संदूषण है. तैयार नमूने सफलतापूर्वक Mgm101 की, जैव रासायनिक संरचनात्मक और एक कण छवि विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल भी misfolded और बैक्टीरियल कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है कि अन्य बड़े oligomeric डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

मुताबिक़ पुनर्संयोजन डबल भूग्रस्त टूटता है की मरम्मत (DSBs) और interstrand crosslinks, के लिए और ढह प्रतिकृति कांटे 1 से डीएनए प्रतिकृति के reinitiation के लिए महत्वपूर्ण है. पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन में, केंद्रीय प्रतिक्रिया प्रोकीर्योट्स में RECA, और RAD51 और 1-3 eukaryotes में Dmc1 सहित एटीपी निर्भर recombinases द्वारा उत्प्रेरित है. ये recombinases द्वैध डीएनए टेम्पलेट (चित्रा 1, बाएं पैनल) 4-7 भीतर अनुरूपता खोज और किनारा आक्रमण की शुरुआत करने के लिए आवश्यक हैं जो ssDNA, पर nucleoprotein तंतु के रूप में. पारंपरिक योजना के अलावा, मुताबिक़ पुनर्संयोजन भी एक RecA/Rad51-independent तरीके से (चित्रा 1, सही पैनल) में जगह नहीं ले सकता. उदाहरण के लिए, खमीर Rad52 और Rad59 प्रोटीन सीधे dsDNA टूट की resectioning से सामने आ रहे हैं जो पूरक ssDNA किस्में annealing उत्प्रेरित कर सकते हैं. गाने के रूप में जाना जाता है यह पुनर्संयोजन प्रक्रिया,ले किनारा annealing, आम तौर पर मुताबिक़ dsDNA टेम्पलेट्स के साथ जोड़ी को शामिल नहीं करता. Annealing के बाद, heterologous पूंछ exonucleases से हटा रहे हैं और nicks जीनोम निरंतरता 8-10 बहाल करने के लिए ligated हैं. भी कतरा annealing तंत्र द्वारा मरम्मत अक्सर सीधे दोहराया क्षेत्रों के बीच जीनोमिक दृश्यों के विलोपन के साथ है.

Rad52 bacteriophages 11 के बीच व्यापक हैं कि पुनर्संयोजन प्रोटीन की एक विविध समूह के अंतर्गत आता है. ये प्रोटीन भी मुताबिक़ एकल असहाय डीएनए अणु की annealing को बढ़ावा देने में उनकी गतिविधियों के आधार पर भी कतरा एनीलिंग प्रोटीन (SSAPs) के रूप में जाना जाता है. सर्वश्रेष्ठ विशेषता जीवाणुभोजी SSAPs Redβ और lactococcal फेज ul36 से prophage आरएसी और Sak प्रोटीन से bacteriophages λ और P22, रंगरूट से ERF हैं. समानता लगभग undetect है हालांकि SSAPs संरचनात्मक रूप से, एक ठेठ β-β-β-α गुना की विशेषता हैउनकी प्राथमिक दृश्यों में सक्षम. 10 की वे सभी फार्म बड़े होमोसेक्सुअल oligomeric छल्ले - विट्रो 12-14 में 14 गुना समरूपता. इस विशेषता उच्च आदेश संरचनात्मक संगठन के कार्यात्मक प्रभाव अच्छी तरह से नहीं समझा गया है.

हम mitochondrial जीनोम में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के तंत्र को समझने में रुचि रखते हैं. हम पहले से Saccharomyces cerevisiae 15 में mtDNA के रखरखाव के लिए आवश्यक है कि MGM101 जीन की पहचान की है. MGM101 बाद मितोचोन्द्रिअल nucleoids साथ जुड़ा होना पाया गया था और डीएनए हानिकारक एजेंटों के लिए mtDNA की सहिष्णुता 16 के लिए आवश्यक है. हालांकि, Mgm101 का अध्ययन पुनः संयोजक Mgm101 निर्माण करने के लिए कठिनाई से पिछले एक दशक में वापस आयोजित किया गया है. हमने हाल ही में ई. से बड़ी मात्रा में घुलनशील Mgm101 का निर्माण करने में सफल रहा है इस MBP-संलयन रणनीति का प्रयोग कोलाई. यह हमें उस Mgm101 शेयरों का प्रदर्शन करने के लिए सक्षम हैप्रोटीन 17,18 के Rad52 परिवार के साथ जैव रासायनिक और संरचनात्मक समानता. इस रिपोर्ट में, एक तीन कदम शोधन प्रक्रिया सजातीय Mgm101for जैव रासायनिक और संरचनात्मक विश्लेषण (चित्रा 2) पैदा करता है, जो वर्णन किया गया है.

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Protocol

पिछले अध्ययनों Mgm101 के पहले एमिनो टर्मिनल 22 अवशेषों माइटोकांड्रिया 19 में आयात के बाद cleaved रहे हैं कि पता चला है. Escherichia कोलाई में अभिव्यक्ति के लिए, पहले 22 कोडोन कमी MGM101 खुला पढ़ने फ्रेम पीसीआर से परिलक्षित होता है और अभिव्यक्ति वेक्टर pMAL-c2E का एक संशोधित संस्करण में maltose बाध्यकारी प्रोटीन (MBP) एन्कोडिंग पुरुष अनुक्रम के बहाव रखा. इस PreScission प्रोटीज (चित्रा 3) के लिए एक दरार साइट युक्त एक linker के साथ इस MBP-Mgm101 संलयन उत्पन्न करता है. प्लाज्मिड पहले ई. चयन करके निर्माण किया है IPTG और Xgal सफेद / नीले चयन बिना कोलाई transformants. परिणामस्वरूप प्लाज्मिड pMAL-c2E-MGM101 फिर ई. में शुरू की है कोली एम्पीसिलीन और chloramphenicol प्रतिरोधी कालोनियों का चयन करके BL21-CodonPlus (DE3), आरआईएल तनाव.

1. अभिव्यक्ति, प्रेरण, सेल और DNase मैं उपचार

  1. Inocग्लूकोज (0.2%), एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और chloramphenicol (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक लेग माध्यम के 10 मिलीग्राम (1% Bacto tryptone, 0.5% खमीर निकालने, 1% NaCl) में ताजा transformants ulate. 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सीओ / एन सेते हैं.
  2. ऊपर के रूप में पूरक लेग माध्यम से 2 लीटर में 10 मिलीलीटर preculture टीका लगाना. आयुध डिपो के 600 0.5 तक पहुँच झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित.
  3. 0.3 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में इसोप्रोपाइल β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़कर इस MBP-Mgm101 संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित. 5 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ कोशिकाओं को विकसित.
  4. एक Beckman जावेद-10 रोटर (5,500 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) का उपयोग centrifugation द्वारा कोशिकाओं लीजिए. Discarding के बाद सतह पर तैरनेवाला, प्रोटीज अवरोधक (25 माइक्रोन leupeptin, 1 माइक्रोन pepstatin ए और 1 मिमी PMSF) युक्त lysis बफर के 30 एमएल (20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7.4 और 1 मिमी EDTA, पीएच 7.4) में सेल गोली resuspend.
  5. 20 के लिए बर्फ पर सेल निलंबन Sonicateसेकंड के एक अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर (हीट सिस्टम, मॉडल डब्ल्यू 385) का उपयोग कर 50% शुल्क साइकिल पर, 30 सेकंड के लिए बर्फ पर शांत और 2x दोहराने के लिए अनुमति देते हैं.
  6. 2 मिलीग्राम / एमएल DNase 1 शेयर के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल lysate रॉक.
  7. 500 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता NaCl समायोजित करें.
  8. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 XG पर centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटा दें.

2. एमाइलोज आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी साथ शोधन

  1. Lysis बफर में एमाइलोज राल (50% घोल) के 1.5 मिलीलीटर संतुलित. सेल lysate को equilibrated एमाइलोज राल जोड़ें. 4 ° सीओ / एन में धीरे रॉक
  2. एक ठंडे कमरे में स्थापित एक इकोनो कॉलम क्रोमैटोग्राफी स्तंभ पर lysate राल मिश्रण लोड. अनबाउंड प्रोटीन गंभीरता से स्तंभ पारित करने की अनुमति दें.
  3. धोने बफर मैं (, 400 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, पीएच 7.4, और 0.2 मिमी PMSF 20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7.4) के 300 मिलीलीटर के साथ एमाइलोज राल धो लें.
  4. धोने बफर द्वितीय (20 मिमी टी के 150 मिलीलीटर के साथ धोने दोहराएँआरआईएस-एचसीएल, 7.4 पीएच, 200 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, पीएच 7.4, और 0.2 मिमी PMSF).
  5. स्तंभ के लिए, 4 में सेते 10 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस, इकट्ठा क्षालन बफर के 5 मिलीलीटर (, 200 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, पीएच 7.4 और 0.2 मिमी PMSF, 10 मिमी maltose 20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7.4) जोड़ें अधिक समय के लिए eluate और दोहराने.
  6. Eluates का मिश्रण है, Coomassie धुंधला (चित्रा 4) के बाद एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर eluate के एक विभाज्य लोड करके इस MBP-Mgm101 की उपज और पवित्रता का निर्धारण करते हैं.

3. PreScission protease दरार और कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी

  1. इस MBP-Mgm101 eluate को PreScission प्रोटीज की 50 इकाइयों में जोड़ें. 4 में दरार ° सीओ / एन प्रदर्शन करना और (20 मिमी Tris-एचसीएल, 7.4 पीएच, 100 मिमी NaCl, 2 मिमी डीटीटी, 1 मिमी EDTA, पीएच 7.4, और 0.2 मिमी PMSF) यह डायलिसिस बफर के खिलाफ डायलिसिस के दौरान जारी रखने की अनुमति
  2. एक एसडीएस पृष्ठ जेल (चित्रा 5A) पर दरार की दक्षता की जांच करें.
  3. कई इंजेक्षन द्वारा cleaved है MBP-Mgm101 लोडएक जैव स्केल मिनी वृहद तैयारी उच्च एस कारतूस पर आयनों एक जैव रेड जीवविज्ञान DuoFlow FPLC प्रणाली से जुड़े.
  4. एक कदम नमक 5 मिमी की ढाल, 300 मिमी, 500 मिमी, 750 मिमी और मिश्रण बफर (5 मिमी NaCl द्वारा बनाई गई है कि NaCl के 1,000 मिमी लगाने से कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी प्रारंभ, 10 मिमी ना फॉस्फेट, पीएच 7.2, 1 मिमी PMSF) और बफर बी (1 एम NaCl, 10 मिमी ना फॉस्फेट, पीएच 7.2, 1 मिमी PMSF). 0.5 मिलीग्राम / मिनट में प्रवाह की दर निर्धारित करें. Mgm101 अंश लीजिए और एक एसडीएस पृष्ठ जेल (चित्रा 5 ब) पर प्रोटीन की शुद्धता की जांच.

4. आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी

  1. कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी से प्रोटीन अंशों का मिश्रण. (, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, पीएच 7.4, 5 मिमी 2-mercaptoethanol, 0.2 मिमी PMSF 20 मिमी MOPS, पीएच 7.0) GF संतुलन बफर में प्रोटीन Dialyze.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 XG पर कताई द्वारा ~ 1 मिलीलीटर मात्रा को कम करने के VIVASPIN 15R Ultrafiltration स्पिन स्तंभ के साथ प्रोटीन ध्यान लगाओ
  3. Mgm101 ओ लोडना क्रोमैटोग्राफी बफर (, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी β-mercaptoethanol, 1 मिमी EDTA, पीएच 7.4, 0.2 मिमी PMSF 20 मिमी MOPS, पीएच 7.0) के साथ equilibrated Superose 6 प्रस्तुत करने का ग्रेड स्तंभ calibrated.
  4. 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर चलाने क्रोमैटोग्राफी बफर के साथ आकार बहिष्कार शुरू करो.
  5. शुद्ध Mgm101 चोटियों के भागों लीजिए. प्रोटीन की अंतिम गुणवत्ता की जाँच के लिए एक 12% एसडीएस पृष्ठ पर अंशों की aliquots लोड.
  6. VIVASPIN 6 के साथ प्रोटीन ध्यान लगाओ, तो जल्दी -80 में तरल N2 और दुकान में नमूने फ्रीज डिग्री सेल्सियस
  7. SsDNA बाध्यकारी परख (चित्रा 8) के लिए और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (9 चित्रा) से संरचनात्मक दृश्य के लिए 6-12 महीने के भीतर Mgm101 नमूनों का प्रयोग करें.

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Representative Results

Mgm101 माइटोकांड्रिया में एक Rad52 संबंधी पुनर्संयोजन प्रोटीन है. Rad52 बड़े पैमाने पर mitochondrial डीएनए पुनर्संयोजन (चित्रा 1) में अपनी भूमिका के लिए अध्ययन किया गया है. संयोजक Mgm101 एक तीन कदम प्रक्रिया (चित्रा 2) के द्वारा तैयार किया जा सकता है. इस Mgm101 एक घुलनशील रूप में व्यक्त किया और बाद में (चित्रा 3) proteolytic दरार से टैग से जारी होने की अनुमति देता है कि इस MBP-टैगिंग रणनीति के उपयोग से मदद की है.

एक ठेठ तैयारी में, इस MBP-Mgm101 संलयन के लगभग 2-3 मिलीग्राम एमाइलोज आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के बाद जीवाणु संस्कृति का 1 लीटर से बरामद किया जा सकता है. एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर, इस MBP-Mgm101 ~ 70 केडीए (चित्रा 4) के एक प्रमुख बैंड के रूप में पाया जाता है. राल उचित क्षालन से पहले धोया जाता है तो अन्य प्रोटीन से प्रदूषण को कम से कम है. PreScission Protease द्वारा दरार के बाद, इस MBP और Mgm101 पर क्रमश: 42 केडीए और 28 केडीए के बैंड के रूप में अलग किया और दिखाया जाता हैएसडीएस पृष्ठ (चित्रा 5A). अधूरा पाचन के मामले में, के रूप में एक ~ 70 केडीए बैंड की उपस्थिति ने संकेत दिया, अतिरिक्त PreScission Protease साथ एक विस्तारित पाचन की सलाह दी है.

Cleaved है MBP-Mgm101 की कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी के लिए, इस MBP नमक के आवेदन से पहले स्तंभ (चित्रा 6) द्वारा बनाए रखा नहीं है. आमतौर पर, Mgm101 MBP (चित्रा 5 ब) द्वारा नजर संदूषण के बिना नमक के 500 मिमी के साथ eluted है. 300 मिमी से कम एक छोटी सी चोटी uncleaved MBP-Mgm101 संलयन की मात्रा का पता लगाने के लिए मेल खाती है, जो कुछ समय से दिखाई देता है. यह इस अंश में Mgm101 स्तंभ के लिए बाध्य संबंध कम कर देता है जो contaminating डीएनए से बाध्य है कि संभव है. इस प्रकार, कटियन विनिमय डीएनए प्रदूषण कम करने के लिए एक आवश्यक कदम है.

चित्रा 7 आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा Mgm101 शुद्धि के अंतिम चरण से पता चलता है. Mgm101 oligomers के आम तौर पर एक monodispersed शिखर में elute~ 400 केडीए की. Mgm101 से कुछ उत्परिवर्ती रूपों अक्सर बढ़ V0 के बीच आकार शून्य (मात्रा) और 400 केडीए पीक के साथ देखा जाता है. इस का कारण अभी अज्ञात है. Mgm101 की oligomerization को प्रभावित करने उत्परिवर्तनों V0 भागों में elute जो समुच्चय के गठन को प्रेरित कर सकते हैं. हालांकि, हम मोनोमेरिक Mgm101 को इसी चोटियों कभी नहीं देखा है. Mgm101 monomers के समाधान में होने की संभावना अस्थिर कर रहे हैं.

शुद्ध Mgm101 ssDNA करने के लिए एक उच्च बंधन आत्मीयता (चित्रा 8) है. ssDNA के लिए बाध्य संबंध जेल पर मुफ्त ssDNA का अनुमापन के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है. Mgm101/ssDNA जटिल बाहर कुओं की खराब प्रवास करती है. एक संभावित व्याख्या Mgm101 सकारात्मक आरोप लगाया और ssDNA को Mgm101 की कई यूनिटों के बंधन वैद्युतकणसंचलन परिस्थितियों में प्रोटीन / डीएनए परिसरों स्थिर बना देता है जो अपने नकारात्मक आरोप बेअसर है. उचित रूप से तैयार करते हैं, Mgm101 ~ 200 एनएम के एक केडी साथ ssDNA बांधता है.

9 चित्रा नकारात्मक दाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध Mgm101 के प्रत्यक्ष संरचनात्मक दृश्य दिखाता है. हौसले से तैयार Mgm101 ~ 20 एनएम के एक व्यास के साथ बड़े oligomeric छल्ले के रूप में मुख्य रूप से मौजूद है. इसके बजाय, वृद्ध Mgm101 नमूने संकुचित तंतु के रूप में. ये तंतु छल्ले के stacking सरल द्वारा गठित नहीं कर रहे हैं. तंतु में एक चक्करदार पैटर्न स्पष्ट रूप से नहीं है. filamentation प्रक्रिया मिलाना स्थिति है कि जांच के अंतर्गत वर्तमान में हैं. यह प्रोटीन गुणवत्ता 4 में ऊष्मायन के बाद एसडीएस पृष्ठ पर जाँच की है कि उचित है इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा रहा से पहले वृद्ध नमूने लिए डिग्री सेल्सियस.

चित्रा 1
चित्रा 1. Rad52 में एक कैरियर में पुनर्संयोजन साइट पर RAD51 recombinase की लोडिंग के लिए एक मध्यस्थ के रूप में कार्य करता है कि दिखा सरलीकृत योजनाबद्ध आरेखnonical मुताबिक़ पुनर्संयोजन मार्ग (बाएं पैनल), और RAD51 (सही पैनल) की स्वतंत्र annealing भी कतरा बढ़ावा देता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. पुनः संयोजक Mgm101 की तैयारी के लिए समग्र योजना. Mgm101 पहले ई. में व्यक्त किया जाता है एक MBP-इनकार रूप में कोलाई. बैक्टीरियल कोशिकाओं sonication द्वारा lysed रहे हैं. DNase मैं पाचन डीएनए प्रदूषण को कम करने के लिए लागू किया जाता है. इस MBP-Mgm101 संलयन तो एक एमाइलोज स्तंभ का उपयोग करके डीएनए समाप्त lysate से शुद्ध होता है. Proteolytic दरार के बाद, Mgm101 जारी की है और कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा MBP से अलग कर दिया. यह कदम आगे डीएनए से प्रदूषण को कम करने के लिए आवश्यक है. eluted Mgm101 अंश तो एक Superose 6 प्रस्तुत करने का ग्रेड स्तंभ के माध्यम से इसे पारित करने से एकरूपता के लिए शुद्ध होता है.


चित्रा 3. Mgm101 व्यक्त प्लाज्मिड pMAL-c2E-MGM101 की शारीरिक नक्शा. MBP और Mgm101 बीच PreScission प्रोटीज के लिए दरार साइट संकेत दिया है. क्रमश: 42 और 28 केडीए के एक आणविक वजन के साथ proteolytic दरार पैदावार MBP और Mgm101.

चित्रा 4
चित्रा 4. एमाइलोज आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के बाद इस MBP-Mgm101 संलयन प्रोटीन की पवित्रता दिखा एसडीएस पृष्ठ. प्रोटीन एकाग्रता 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है और Mgm101 के लगभग 5 ग्राम जेल पर लोड किया जाता है. जेल Coomassie नीले रंग के साथ दाग है.

चित्रा 5 चित्रा 5. Mgm101 के एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण. PreScission प्रोटीज साथ दरार के बाद इस MBP-Mgm101 संलयन प्रोटीन से Mgm101 की ए) रिलीज. प्रोटीज हे / एन, साथ पाचन के बाद प्रोटीन की लगभग 5 ग्राम युक्त एक विभाज्य जेल पर लोड किया जाता है. जेल Coomassie नीले रंग से सना हुआ है. Mgm101 मानक एसडीएस पृष्ठ शर्त के तहत प्रोटीन के समग्र सकारात्मक आरोप के कारण 28 केडीए की अपनी उम्मीद आकार, की तुलना में थोड़ा धीमा प्रवास करती है. बी) कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा MBP से जुदाई के बाद Mgm101.

चित्रा 6
चित्रा 6. कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा MBP से Mgm101 की जुदाई दिखा chromatogram. cleaved है MBP-Mgm101 एक जैव स्केल मिनी वृहद तैयारी उच्च एस कारतूस कई बार में इंजेक्ट किया जाता है. 5 मिमी से एक कदम नमक ढाल, 300 मिमी, 500 मिमी, 750 मिमी और NaCl के 1,000 मिमी फिर लागू की गई है. larer आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

7 चित्रा
चित्रा 7. एक calibrated Superose 6 प्रस्तुत करने का ग्रेड स्तंभ पर Mgm101 oligomers के क्षालन प्रोफ़ाइल दिखा chromatogram. क्रोमैटोग्राफी 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर किया जाता है. eluted Mgm101 ~ 400 केडीए के एक चोटी के रूप में मनाया जाता है. V0: शून्य मात्रा. larer आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

8 चित्रा
चित्रा 8. शुद्ध Mgm101 ssDNA करने के लिए एक मजबूत बंधन गतिविधि दिखा रहा है कि Electrophoretic गतिशीलता बदलाव परख. 1.25 एक्स 10 -3 2 MgCl, 1 मिमी EDTA, पीएच 8.0, 10% ग्लिसरॉल, 1 मिमी डीटीटी, 50 माइक्रोग्राम / एमएल बीएसए, और 1 मिमी PMSF. 30 मिनट के लिए आरटी पर ऊष्मायन के बाद, नमूने एक 6% देशी acrylamide जेल पर लोड कर रहे हैं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.5X TBE बफर में चलाने

9 चित्रा
चित्रा 9. कि संरचनात्मक ताजा के संगठन (बाएं पैनल) और वृद्ध (सही पैनल) Mgm101 दिखा इलेक्ट्रॉन micrographs. नकारात्मक धुंधला ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 200 केवी पर एक जैश-2100 संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (JEOL) ऑपरेटिंग का उपयोग किया जाता है. नकारात्मक लिए वृद्ध Mgm101 के दाग, प्रोटीन 4 में संग्रहीत किया जाता है GF के बफर में डिग्री सेल्सियस (20 मिमी MOPS, पीएच 7.0, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी β-mercaptoethanol, 1 मिमी EDTA, पीएच 7.4, और 0.2 मिमी PMSF) का विश्लेषण किया जा रहा से पहले 4 सप्ताह के लिए. (डा. स्टेपहान Wilkens के सौजन्य).

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Discussion

यह ई. से एक स्थिर, देशी पुनः संयोजक Mgm101 प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक चुनौती रहा है बैक्टीरियल कोशिकाओं में इसकी जटिलता को संभवतः कारण कोलाई. इस रिपोर्ट में, हम इस MBP-संलयन रणनीति प्रोटीन एक काफी उच्च स्तर पर व्यक्त करने की अनुमति देता है कि दिखा. नकारात्मक धुंधला ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके, हम पहले से इस MBP-संलयन प्रोटीन इन विट्रो 18 में वर्दी oligomers कि रूपों से पता चला है. यह Mgm101 की तह और oligomerization मितोचोन्द्रिअल मैट्रिक्स के साथ तुलना में बैक्टीरियल कोशिकाओं में धीमी हो सकती है कि संभव है. unoligomerized Mgm101 जल्दी विवो में विषाक्त कर रहे हैं कि समुच्चय के रूप में हो सकता है. इस MBP-टैगिंग उत्पादक oligomerization की अनुमति देता है और इसकी विषाक्तता घटता है कि एक घुलनशील रचना में Mgm101 रख सकते हैं.

अच्छी गुणवत्ता Mgm101 तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी डीएनए द्वारा न्यूनतम संदूषण के लिए है. ए 280 / ए 280 / ए 260 के अनुपात में इस स्तर से नीचे है, तो DNase साथ विस्तारित पाचन मैं सिफारिश की है. भविष्य में, यह S1 के nuclease और RNase साथ पाचन आगे न्यूक्लिक एसिड contaminating कम कर सकते हैं कि क्या देखने के लिए उपयोगी हो सकता है.

हम पहले कुछ हफ्तों के लिए 4 बजे Mgm101 डिग्री सेल्सियस का भंडारण लंबे पेचदार तंतु 17 के गठन को प्रेरित करता है कि पता चला है. फिलामेंट के गठन की व्यवस्था अच्छी तरह से नहीं समझा गया है. पर-filamentation प्रोटीन की घुलनशीलता को प्रभावित करता है. इसलिए, यह दृढ़ता से हौसले से तैयार Mgm101 प्रोटीन की aliquots जल्दी -80 में भंडारण के द्वारा पीछा तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हैं सलाह दी है कि डिग्री सेल्सियस प्रोटीन के डीएनए बाध्यकारी गतिविधि भंडारण यू के 6-12 महीने के बाद अपरिवर्तित रहता हैइन स्थितियों nder.

इस प्रोटोकॉल Mgm101 के उत्परिवर्ती प्रोटीन तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. oligomerization राज्य और Mgm101 की स्थिरता अक्सर परिवर्तन से प्रभावित कर रहे हैं. हल्के म्यूटेशन MBP से दरार पर शुद्ध प्रोटीन की एक आंशिक वर्षा के कारण हो सकता है. इन मामलों में, 6 लीटर संस्कृति मात्रा बढ़ती आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी से स्थिर शुद्ध प्रोटीन की पर्याप्त पैदावार अनुमति दे सकता है. Oligomerization को प्रभावित करने वाले गंभीर म्यूटेशनों एक MBP-इनकार रूप में प्रोटीन के उत्पादन की अनुमति दे सकता है, लेकिन प्रोटीन है MBP के हटाने के बाद स्थिर नहीं हो सकता है.

सारांश में, मौजूदा प्रोटोकॉल ई. में बड़े Mgm101 oligomeric छल्ले के उच्च स्तर अभिव्यक्ति की अनुमति देता है जो विश्वसनीय है कोलाई. इस प्रोटोकॉल उन प्रोटीन की घुलनशीलता बैक्टीरियल कोशिकाओं में कम है, खासकर जब Mgm101 orthologs 20, 21 और अन्य oligomeric प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में मदद के लिए स्टीफन Wilkens धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य अनुदान R01AG023731 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

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References

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