MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Maya mitokondriyal nükleoit proteini Mgm101, büyük oligomerik halkalar oluşturan bir Rad52 tipi rekombinasyon proteindir. Bir protokol, maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketleme katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile birlikte stratejisi kullanılarak çözülebilir rekombinant Mgm101 hazırlamak için tarif edilmektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MGM101 gen mitokondriyal DNA bakım rolü için 20 yıl önce tespit edilmiştir. Çeşitli gruplardan çalışmalar Mgm101 protein mitokondriyal DNA recombinational onarım dahil olduğunu ileri sürmüşlerdir. Son araştırmalar Mgm101 Rad52 tipi rekombinasyon protein aile ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu proteinler, büyük oligomerik halkaları oluşturmak ve homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik eder. Bununla birlikte, Mgm101 karakterizasyonu, rekombinant proteinin üretiminde sekteye edilmiştir. Burada, rekombinant Mgm101 hazırlanması için bir güvenilir bir yöntem tarif edilmektedir. Maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketli Mgm101 olanlar, Escherichia coli içinde ifade edilir. Füzyon proteini, başlangıçta amiloz afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Proteolitik bölünme ile serbest bırakıldıktan sonra, Mgm101 katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrılır. Monodispers Mgm101 daha sonra elde edilirboyut dışlama kromatografisi ile. Bakteri kültürü litre başına Mgm101 bir ~ 0.87 mg verim rutin elde olabilir. Rekombinant DNA Mgm101 asgari kirlenme vardır. Hazırlanan numunelerin başarıyla Mgm101 biyokimyasal, yapısal ve tek bir parçacık resim analizleri için kullanılır. Bu protokol, aynı zamanda yanlış katlanmış ve bakteri hücreleri için toksik olabilir diğer büyük oligomerik DNA bağlayıcı proteinlerin hazırlanması için kullanılabilir.

Introduction

Homolog rekombinasyon çift iplikli sonları tamiri (DSBs) ve zincirler arası çapraz bağlar, ve çökmüş çoğaltma çatal 1 DNA replikasyon reinitiation için önemlidir. Geleneksel homolog rekombinasyon, merkez reaksiyon Prokaryotlarda RecA ve RAD51 ve 1-3 ökaryotlarda Dmc1 da dahil olmak üzere, ATP-bağımlı rekombinaz tarafından katalize edilir. Bu rekombinaz dubleks DNA şablonları (Şekil 1, sol panel) 4-7 içinde homoloji arama ve iplikçik işgali başlatmak için gerekli olan ssDNA, üzerinde nükleoprotein filamentler oluştururlar. Geleneksel programına ilave olarak, aynı zamanda, bir homolog rekombinasyon RecA/Rad51-independent şekilde (Şekil 1, sağ panel) içerisinde yer alabilir. Örneğin, maya Rad52 ve Rad59 proteinler doğrudan dsDNA tatili geriden kestirmeye tarafından sunulan tamamlayıcı ssDNA ipliklerini tavlama katalize edebilir. Şarkı olarak bilinen bu rekombinasyon işlemi,le iplikçik tavlama, genellikle homolog dsDNA şablonları ile eşleştirme anlamına gelmez. Tavlama işleminden sonra, heterolog kuyrukları exonucleases ile çıkarılır ve çentikler genom süreklilik 8-10 geri ligate edilir. Tek tel çekme mekanizması ile tamir genellikle doğrudan tekrar bölgeleri arasında genom dizilerinin silinmesi eşlik eder.

Rad52 bakteriyofajlar 11 arasında yaygın olan rekombinasyon proteinlerin çeşitli bir grup aittir. Bu proteinler aynı zamanda, homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik etmedeki aktiviteleri göre, tek tel çekme Proteinleri (SSAPs) olarak bilinir. En iyi karakterize bakteriyofaj SSAPs Redβ ve laktokokkal faj ul36 gelen profajının rac ve Sak protein bakteriyofajlar λ ve P22, rect gelen Erf vardır. Benzerlik neredeyse undetect rağmen SSAPs yapısal olarak, tipik bir β-β-β-α kat ile karakterize edilirbirincil dizileri mümkün. 10 Onlar tüm form büyük homo-oligomerik halkaları - in vitro 12-14 14 kat simetri. Bu özelliği yüksek mertebeden yapısal organizasyonun fonksiyonel etkileri iyi anlaşılmış değildir.

Biz mitokondriyal genom homolog rekombinasyon mekanizması anlamada ilgilendi. Daha önce, Saccharomyces cerevisiae 15 mtDNA bakımı için gerekli olan MGM101 gen tanımlanmıştır. MGM101 sonradan mitokondriyal nukleoidler ile ilişkili olduğu bulunmuştur ve DNA'ya zarar veren ajanlara mtDNA tolerans 16 için gereklidir. Ancak, Mgm101 çalışma rekombinant Mgm101 üretmek için zorluk tarafından son on yılda geri gerçekleştirildi. Biz son zamanlarda E. büyük miktarlarda çözünür Mgm101 üretiminde başardı MBP-füzyon strateji kullanarak coli. Bu bize Mgm101 hisse göstermek sağladıprotein 17,18 en Rad52 aile ile biyokimyasal ve yapısal benzerlikler. Bu raporda, üç aşamalı bir saflaştırma prosedürü homojen Mgm101for biyokimyasal ve yapısal analizleri (Şekil 2) üretir, tarif edilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Önceki çalışmalar Mgm101 ilk amino terminal kalıntıları 22 mitokondri 19 içine aldıktan sonra yarıldığı gösterilmiştir. Escherichia coli içinde ekspresyonu için, ilk 22 kodonları eksik MGM101 açık okuma çerçevesi PCR ile amplifiye edilir ve ekspresyon vektörü üretilmesinde ise pMAL-C2E değiştirilmiş bir versiyonu maltoz bağlayıcı protein (MBP) kodlayan bir erkek sekansının aşağı yerleştirilir. Bu PreScission proteaz (Şekil 3), bir ayrılma yeri içeren bir bağlayıcı ile MBP-füzyon Mgm101 oluşturur. Plazmid ilk olarak E. seçerek inşa IPTG ve Xgal beyaz / mavi seçim olmadan coli transformantlar. Elde edilen plazmid üretilmesinde ise pMAL-C2E-MGM101 sonra E. sokulur coli ampisilin ve kloramfenikol dirençli koloniler seçerek BL21-CodonPlus (DE3)-RIL süzün.

1. İfade, İndüksiyon, Hücre Lizis ve DNaz I Tedavi

  1. Inocglikoz (% 0.2), ampisilin (100 ug / ml) ve kloramfenikol (50 ug / ml) ile desteklenmiş LB vasatı içinde 10 ml (% 1 Bacto Tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 1 NaCl) taze transformantlar ulate. 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° CO / K 'de inkübe edilir.
  2. Yukarıdaki gibi desteklenmiş LB vasatı içinde 2 litre içine 10 ml ön-kültür inoküle. OD 600 0.5 ulaşıncaya kadar sallayarak ile 37 ° C hücreleri büyütün.
  3. 0.3 mM'lik bir son konsantrasyonda izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenerek MBP-Mgm101 füzyon proteininin ekspresyonunu. 5 saat 30 ° C'de sallayarak hücreleri büyütün.
  4. Bir Beckman JA-10 rotoru (5500 x g, 4 ° C, 10 dakika) kullanılarak santrifüj hücreleri toplamak. Atıldıktan sonra, süpernatan, proteaz inhibitörleri (25 uM löpeptin, 1 uM pepstatin A ve 1 mM PMSF) ihtiva eden liziz tamponu, 30 ml (20 mM Tris-HCI, pH 7.4 ve 1 mM EDTA, pH 7.4) içinde hücre pelletini.
  5. 20 boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonu sonikasyonsn ultrasonik işlemci (Isı Sistemleri; Model W-385) kullanarak 50% görev döngüsü, 30 saniye boyunca buz üzerinde serin ve 2x tekrar sağlar.
  6. 2 mg / ml 'de 1 DNAz stoklar 1 ml ilave edilir. 2 saat boyunca 4 ° C 'de hücre lizatı sallayın.
  7. 500 mM'lik bir son konsantrasyona NaCl ayarlayın.
  8. 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10,000 x g'de santrifüj ile hücre artıkları çıkarın.

2. Amiloz Affinity Kromatografi ile Arıtma

  1. Lizis tamponu içinde amiloz reçinesi (% 50 çamurlu) 1.5 ml dengelenmesi. Hücre lizatı ile dengelenmiş amiloz reçine ekleyin. 4 ° CO / N. de hafifçe sallayın
  2. Soğuk bir odaya monte bir Econo-Kolon kromatografisi kolonuna lizat-reçine karışımı yükleyin. Ilişkisiz proteinler yerçekimi ile sütun geçmesine izin.
  3. Yıkama tamponu I (, 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF, 20 mM Tris-HCI, pH 7.4) 300 mL 'si ile yıkayınız amiloz reçine.
  4. II yıkama tamponu (20 mM T 150 mL 'si ile yıkama tekrarlayınRIS-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF).
  5. Sütun, 4 'de inkübe edilir 10 dakika boyunca ° C toplamak elüsyon tamponu, 5 ml (, 200 mM NaCI;, 1 mM EDTA, pH 7.4 ve 0.2 mM PMSF, 10 mM Maltoz, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) ile ekleme daha fazla kez eluat ve tekrar.
  6. Eluatlar birleştirin, Coomassie boyama (Şekil 4) tarafından izlenen bir SDS-PAGE jeli üzerinde eluatın bir kısım yükleyerek MBP-Mgm101 verimini ve saflığını belirlemek.

3. PreScission proteaz bölünme ve Katyon Değişim Kromatografisi

  1. MBP-Mgm101 elüatına PreScission proteaz 50 adet ekleyin. 4 de bölünme ° CO / N yapın ve (20 mM Tris-HCI, pH 7.4, 100 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF) bu diyaliz tampon maddesine karşı diyaliz süresince devam etmesine izin
  2. Bir SDS-PAGE jel (Şekil 5A) üzerinde bölünme verimini kontrol edin.
  3. Birden enjekte tarafından bölünmüş MBP-Mgm101 YükBio-Ölçek Mini Makro-Hazırlık Yüksek S kartuşu iyonları bir Bio-Rad Biyolojik Çift Geçişli FPLC sistemine bağlı.
  4. Bir adım tuzu 5 mM gradyan, 300 mM, 500 mM, 750 mM ve karıştırma tampon A (5 mM NaCI ile oluşturulur NaCl 1.000 mm uygulayarak, katyon değişim kromatografisi başlangıç;, 10 mM Na-fosfat, pH 7.2, 1 mM PMSF) ve Tampon B (1 M NaCI, 10 mM Na-fosfat, pH 7.2, 1 mM PMSF). 0.5 ml / dak akış hızı. Mgm101 fraksiyonu toplamak ve bir SDS-PAGE jel (Şekil 5B), proteinin saflığı gösterir.

4. Boyut Dışlama Kromatografisi

  1. Katyon değişim kromatografisinden protein fraksiyonları bir araya getirin. (150 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, 5 mM 2-merkaptoetanol, 0.2 mM PMSF, 20 mM MOPS, pH 7.0) GF dengeleme tamponu içinde protein Dialyze.
  2. 4 ° C'de 3000 xg'de iplik ~ 1 ml hacmini azaltmak için Vivaspin 15R Ultrafiltrasyon spin kolon ile protein konsantre
  3. Mgm101 o Yükna kromatografi tamponu (150 mM NaCI, 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7.4, 0.2 mM PMSF, 20 mM MOPS, pH 7.0) ile dengelenmiş bir Superpose 6 prep kolon dereceli olarak kalibre edilmiştir.
  4. 0.5 ml / dak 'lık bir akış hızında çalışırlar kromatografi tamponu ile boyut dışlama başlatın.
  5. Saflaştırılmış Mgm101 tepe fraksiyonlar toplayın. Protein nihai kalitesini kontrol etmek için, bir% 12 SDS-PAGE üzerinde fraksiyonların alikotları yerleştirin.
  6. Vivaspin 6 ile protein konsantre, sonra hızlı bir şekilde -80 sıvı N2 ve mağaza örnekleri dondurmak ° C
  7. SsDNA bağlayıcı analizi (Şekil 8) ve transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 9) ile yapısal görselleştirme için 6-12 ay içinde Mgm101 örnekleri kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mgm101 mitokondri bir Rad52 ilgili rekombinasyon proteindir. Rad52 yoğun mitokondriyal DNA rekombinasyon (Şekil 1) rolü için incelenmiştir. Rekombinant Mgm101 üç aşamalı bir prosedür (Şekil 2) ile hazırlanabilir. Bu Mgm101 çözünür bir biçimde ifade edilir ve daha sonra (Şekil 3) proteolitik bölünme ile etiketinden açığa çıkmasına izin veren MBP-etiketleme stratejisinin kullanımı ile kolaylaştırılır.

Tipik bir preparat olarak, MBP-füzyon Mgm101 yaklaşık 2-3 mg amiloz afinite kromatografisi ile bakteriyel kültür, 1 litre elde edilebilir. Bir SDS-PAGE jeli üzerinde, MBP-Mgm101 ~ 70 kDa (Şekil 4) önemli bir grup olarak tespit edilir. Reçine uygun bir elüsyon önce yıkanır, eğer başka proteinlerin neden olduğu kirlenme ve minimaldir. PreScission Proteaz tarafından bölünme sonra, MBP ve Mgm101 sırasıyla 42 kDa ve 28 kDa bantları olarak ayrılır ve gösterilirSDS-PAGE (Şekil 5A). Eksik sindirim durumunda, bir ~ 70 kDa bandı varlığı ile belirtildiği gibi, ek PreScission Proteaz ile uzun bir sindirim tavsiye edilir.

Ayrılan MBP-Mgm101 arasında katyon değişim kromatografisi için, MBP tuzunun uygulanmasından önce kolonu (Şekil 6) tarafından muhafaza edilmez. Tipik olarak, Mgm101 MBP (Şekil 5B) tarafından fark kirlenme olmadan tuzunun 500 mM ile yıkanır. 300 mM de küçük bir tepe uncleaved MBP-Mgm101 füzyon bir eser miktarda karşılık gelir, bazen görülebilir. Bu fraksiyonunda Mgm101 sütuna bağlanma yakınlığı azaltır kirletici DNA ile bağlı olması da mümkündür. Bu nedenle, katyon değişim DNA kontaminasyonu en aza indirmek için gerekli bir adımdır.

Şekil 7, boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırma Mgm101 nihai aşamasını gösterir. Mgm101 oligomerler genellikle monodispers zirve Zehir~ 400 kDa. Mgm101 bazı mutant formları genellikle artan V0 arasında boyutları (boşluk hacmi) ve 400 kDa zirve ile görülür. Bunun nedeni bilinmemektedir. Mgm101 en oligomerizasyonu etkileyen mutasyonların V0 fraksiyonları Zehir agrega oluşumu neden olabilir. Ancak, monomerik Mgm101 karşılık gelen tepe görmedim. Mgm101 monomer çözeltisi içinde büyük olasılıkla kararsızdır.

Arıtılmış Mgm101 ssDNA için yüksek bir bağlanma afinitesi (Şekil 8) sahiptir. SsDNA için bağlanma afinitesi jel üzerinde serbest ssDNA titrasyon dayalı tahmin edilebilir. Mgm101/ssDNA karmaşık dışarı kuyuların kötü geçirir. Olası bir açıklama, Mgm101 pozitif yüklü ve ssDNA Mgm101 için birden çok alt birimlerinin bağlayıcı elektroforez koşulları altında protein / DNA kompleksleri hareketsiz kılan negatif yük nötralize olmasıdır. Uygun bir şekilde hazırlanmış, Mgm101 ~ 200 nM'lik bir Kd ile ssDNA bağlar.

Şekil 9 olumsuz leke transmisyon elektron mikroskobu ile saflaştırılmış Mgm101 direkt yapısal görselleştirme gösterir. Taze hazırlanmış Mgm101 ~ 20 nm arasında bir çapa sahip büyük oligomerik halkalar esas olarak mevcuttur. Bunun yerine, yaşlı Mgm101 örnekleri sıkıştırılmış iplik oluşturur. Bu filamanlar halkaların istifleme oluşturduğu basit değildir. Filamanların bir açık desen helezonî yoktur. Filamentasyonu işlemi modüle koşullar halen araştırılmaktadır. Bu protein kalitesi 4 de inkübasyondan sonra, SDS-PAGE ile kontrol edilmesi tavsiye edilir elektron mikroskobu ile analiz edilmeden önce yaşlı örnekleri ° C.

Şekil 1
Şekil 1. Rad52 bir ca rekombinasyon sitede RAD51 recombinase ve yükleme için bir arabulucu olarak hizmet veren gösteren Basitleştirilmiş şemasınonical homolog rekombinasyon yolu (sol panel) ve RAD51 (sağ panel) bağımsız tavlama tek iplikli teşvik etmektedir.

Şekil 2,
Şekil 2,. Rekombinant Mgm101 hazırlanması için genel şeması. Mgm101 ilk E'de ifade edilir , bir MBP-bağlı biçimde coli. Bakteriyel hücreler sonikasyon sayesinde lize edilir. DNAz Ben sindirim DNA kontaminasyonu azaltmak için uygulanır. MBP-füzyon Mgm101 daha sonra bir amiloz kolonu kullanılarak DNA-tükenmiş lizatından arıtılır. Proteolitik bölünme sonra Mgm101 serbest bırakıldığında ve katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrılır. Bu adım, daha fazla DNA kontaminasyonunu azaltmak için gereklidir. Yıkanan Mgm101 fraksiyonu daha sonra bir Superpose 6 hazırlık dereceli kolonundan geçirerek homojenliği ile saflaştırılır.


Şekil 3. Mgm101-ifade plazmid üretilmesinde ise pMAL-C2E-MGM101 fiziksel haritası. MBP ve Mgm101 arasındaki PreScission proteaz bölünme sitesi için belirtilir. Sırasıyla, 42 ve 28 kDa arasında bir moleküler ağırlığa sahip proteolitik bölünme verim MBP ve Mgm101.

Şekil 4,
Şekil 4,. Amiloz afinite kromatografisinden sonra MBP-füzyon proteini Mgm101 saflığını gösteren SDS-PAGE. Protein konsantrasyonu, 280 nm'de absorbans ölçülerek belirlenir ve Mgm101 yaklaşık 5 ug jeli üzerinde yüklenir. Jel Coomassie mavi ile boyandı.

Şekil 5, Şekil 5,. Mgm101 SDS-PAGE analizi. PreScission proteaz ile bölünme sonra MBP-Mgm101 füzyon protein Mgm101 A) sürümü. Proteaz O / N, sindirim sonra, proteinin yaklaşık olarak 5 ug ihtiva eden bir kısım jel üzerinde yüklenir. Jel Coomassie mavi ile lekeli. Mgm101 standart SDS-PAGE koşulları altında proteinin genel olarak pozitif yük nedeniyle 28 kDa'lık beklenen büyüklüğü, biraz daha yavaş göç eder. B) Katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrıldıktan sonra Mgm101.

Şekil 6,
Şekil 6,. Katyon değişim kromatografisi ile MBP ikinci Mgm101 ayrılmasını gösteren Kromatografi. Ayrılan MBP-Mgm101 bir Bio-Ölçek Mini Makro-Prep yüksek S kartuşu birden çok kez enjekte edilir. 5 mM bir adım tuz gradyanı, 300 mm, 500 mm, 750 mM ve NaCl 1.000 mM sonra uygulanır. larer rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 7
Şekil 7. Kalibre edilmiş bir Superose 6 hazırlık sınıf sütun üzerinde Mgm101 oligomerlerinin elüsyon profilini gösteren Kromatogram. Kromatografi 0.5 ml / dak 'lık bir akış hızında gerçekleştirilir. Yıkanan Mgm101 ~ 400 kDa pik olarak görülmektedir. V0: boşluk hacmi. larer rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 8,
Şekil 8,. Saflaştınlmış Mgm101 ssDNA için güçlü bir bağlanma aktivitesi olduğunu gösteren elektroforetik mobilite kayma deneyiyle. 1.25 x 10 -3 MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8.0,% 10 gliserol, 1 mM DTT, 50 ug / ml BSA, ve 1 mM PMSF. 30 dakika için oda sıcaklığında kuluçkalamadan sonra, numuneler, bir% 6 yerel akrilamid jel üzerine yüklenir ve 4 ° C de 0.5X TBE tamponu Basım

Şekil 9,
Şekil 9. Kaldığı yapısal taze organizasyonu (sol panel) ve yaşlı (sağ panel) Mgm101 gösteren elektron mikroskobu. Negatif boyama transmisyon elektron mikroskobu 200 kV bir JEM-2100 transmisyon elektron mikroskobu (JEOL) işletim kullanılarak gerçekleştirilir. Negatif için yaşlı Mgm101 leke, proteinin 4 saklanan GF tampon ° C (20 mM MOPS, pH 7.0, 150 mM NaCI, 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF) analiz edilmeden önce 4 hafta içinde. (Dr Stephan Wilkens izniyle).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

E. bir istikrarlı, yerli rekombinant Mgm101 proteini üretmek için bir meydan okuma olmuştur bakteri hücrelerinin kendi çözünürlükten muhtemelen nedeniyle coli. Bu raporda, MBP-füzyon stratejisi protein oldukça yüksek bir seviyede ifade edilmesini sağlar olduğunu göstermektedir. Negatif boyama transmisyon elektron mikroskopisi ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak, daha önce MBP-füzyon proteininin in vitro 18 üniform oligomerleri oluşturur göstermiştir. Bu Mgm101 bir katlama ve oligomerizasyon mitokondrial matris ile karşılaştırıldığında bakteri hücreleri daha yavaş olabilir mümkündür. Unoligomerized Mgm101 hızla in vivo olarak toksik olan agrega oluşturabilir. MBP-etiketleme verimli oligomerizasyonu sağlar ve toksisite azalır bir çözünür yapısındaki Mgm101 devam edebilir.

Kaliteli Mgm101 hazırlanması için önemli bir kriter DNA asgari kirlenme sahip olmaktır. A 280 / A 280 / A 260 oranı bu seviyenin altında ise, DNAz ile uzun sindirim ben tavsiye edilir. Gelecekte, bu S1 nükleaz ve RNaz ile sindirim daha fazla nükleik asit kirlenmesine neden azaltabilir olup olmadığını görmek için yararlı olabilir.

Daha önce bir kaç hafta boyunca 4 ° C de Mgm101 depolanması uzun lifleri helezonî 17 oluşumunu uyardığını göstermiştir. Filament oluşum mekanizması iyi anlaşılamamıştır. Aşırı ipliklerin proteinin çözünürlüğünü etkiler. Bu nedenle, güçlü bir şekilde taze hazırlanmış Mgm101 protein alikotları hızlı bir şekilde -80 depolamanın ardından, sıvı nitrojen içinde dondurulur ve tavsiye edilir ° C Proteininin DNA bağlama aktivitesi saklama u 6-12 ay sonra değişmediBu koşullar vardılar.

Bu protokol, aynı zamanda Mgm101 mutant proteinleri hazırlamak için de kullanılabilir. Oligomerizasyon durumu ve Mgm101 kararlılığını sık mutasyonlar etkilenir. Hafif mutasyonlar MBP ikinci ayrışmalarının ardından, saflaştırılmış proteinlerin kısmi çökelmesine neden olabilir. Bu gibi durumlarda, 6 litre kültür hacminin artırılması boyut dışlama kromatografisinden stabil saflaştırılmış proteinlerin yeterli sünme izin verebilir. Oligomerizasyon etkileyen ciddi mutasyonlar MBP-bağlı formda protein üretimine izin verir, ancak proteinin MBP çıkarılmasından sonra stabil olmayabilir.

Özet olarak, mevcut protokol E'de büyük Mgm101 oligomerik halkaların yüksek seviyede ifade sağlayan güvenilir coli. Bu protokol, bu proteinlerin çözünürlüğü bakteriyel hücreler, düşük, özellikle Mgm101 ortologlar 20, 21 ve diğer oligomerik proteinlerin üretimi için adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Biz transmisyon elektron mikroskobu için yardım Stephan Wilkens teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık Hibe R01AG023731 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics