MBP基于标记策略的Mgm101重组蛋白的制备

Biology

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Summary

酵母线粒体类核蛋白质,Mgm101,是一种重组蛋白RAD52型,形成大低聚环。甲协议的描述以制备可溶性的重组Mgm101使用麦芽糖结合蛋白(MBP)标记加上阳离子交换和尺寸排阻色谱法策略。

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Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

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Abstract

20年前被确定MGM101基因维护线粒体DNA中的作用。从几组研究表明,的Mgm101蛋白参与线粒体DNA的重组修复。最近的调查表明,Mgm101 RAD52型重组蛋白家族有关。这些蛋白质形成大的低聚环促进退火同源单链DNA分子。然而,表征阻碍了Mgm101的生产重组蛋白的难度。在这里,用于制备重组Mgm101的一个可靠的程序进行说明。麦芽糖结合蛋白(MBP)标签Mgm101的首先在大肠杆菌中表达。最初是由直链淀粉的亲和层析柱纯化的融合蛋白。在被释放后通过蛋白水解裂解,Mgm101从MBP分离,通过阳离子交换色谱法。然后单分散Mgm101是获得通过尺寸排阻色谱法。可以定期获得的产量为〜0.87毫克每升细菌培养Mgm101。该的重组Mgm101有DNA污染最小。对样品成功地用于生化,结构和单粒子图像分析Mgm101。此步骤也可用于制备其它大的低聚物的DNA结合蛋白,可能会被错误折叠的和细菌细胞毒性的。

Introduction

同源重组是非常重要的双链断裂的修复(DNA双链断裂)和链间交联,并从倒塌的复制叉1重新开始DNA复制。在常规的同源重组,中央的反应由ATP-依赖的重组酶RecA蛋白在原核细胞中,在真核生物中1-3的Rad51和Dmc1。这些重组酶形成核蛋白丝的单链DNA,这是必不可少的双链DNA模板( 图1,左侧面板)4-7内发起同源搜索和钢绞线入侵。除了 ​​常规的计划,同源重组也可以采取地方在RecA/Rad51-independent的方式( 图1,右图)。例如,酵母的保守和Rad59蛋白质可以直接催化切除双链DNA断裂露出的互补单链DNA链退火。这个重组过程中,被称为唱乐链退火,一般不涉及同源配对的双链DNA模板。退火后,除去核酸外切酶的异源尾巴刻痕结扎以恢复基因组连续性8-10。常伴有直接重复区域之间的基因组序列缺失修复由单链退火机制。

RAD52属于普遍噬菌体11的重组蛋白质,是一个多元化的群体。这些蛋白质也被称为单链退火蛋白(会计实务准则),根据他们的活动在促进同源的单链DNA分子退火。最好噬菌体会计实务准则Redβ的的ERF从噬菌体λ噬菌体rac和葡激酶蛋白从噬菌体lactococcal UL36和P22,RECT。的会计准则结构其特征在于由一个典型的β-β-β-α倍,虽然相似,几乎检测不到能够在他们的主要序列。他们都形成大的同源寡聚体环10 - 14倍的对称性在体外 12-14。这一特点高阶的组织结构功能的影响还不是很清楚。

我们有兴趣了解线粒体基因组同源重组的机制。我们先前已经确定MGM101是必不可少的维护在酿酒酵母 15线粒体DNA的基因。MGM101后来发现线粒体拟核相关需要的耐受性线粒体DNA损伤剂16。然而,这项研究已Mgm101忍住在过去十年中的难度生产重组Mgm101。最近,我们已经成功地大量生产可溶性Mgm101在从E大肠杆菌使用的MBP融合策略。这使我们能够证明Mgm101股生化和结构的相似性与RAD52家族蛋白17,18。在这份报告中,三个步骤的纯化过程进行了描述,产生均匀Mgm101for的生化和结构分析( 图2)。

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Protocol

以前的研究已经表明,第一个氨基末端的22个氨基酸残基的Mgm101裂解后,导入到线粒体19。对于在大肠杆菌中的表达,通过PCR扩增MGM101缺乏的前22个密码子的开放读码框放在男性的编码序列的表达载体pMAL-C2E的修改版本,麦芽糖结合蛋白(MBP)的下游。这会产生的MBP-Mgm101的的断前蛋白酶( 图3)与一个连接器包含一个切割位点的融合。首次构建质粒选择E。大肠杆菌转化,而 ​​不IPTG和的Xgal蓝色/白选择。将得到的质粒pMAL-C2E MGM101然后导入大肠杆菌大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,选择氨苄青霉素和氯霉素抗性菌落。

1。表达,诱导,细胞裂解和DNase I处理

  1. 伊诺克ulate新鲜的转化体在10ml补充有葡萄糖(0.2%),氨苄青霉素(100微克/毫升)和氯霉素(50微克/毫升)的LB培养基(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化钠)。在200转摇孵育在37°CO / N。
  2. 为2升与上述补充的LB培养基中,接种10毫升的预培养物。成长的细胞在37℃振荡,直到OD 600达到0.5。
  3. 通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),使最终浓度为0.3 mM,的MBP-Mgm101的融合蛋白的诱导表达。 5小时,在30℃振荡,细胞生长。
  4. 收集细胞,通过离心分离,用Beckman JA-10转子(5500×g离心,4℃下,10分钟)。后弃去上清,重悬细胞沉淀在30ml含有蛋白酶抑制剂亮抑蛋白酶肽(25μM,1μM的胃酶抑素A和1mM的PMSF)的裂解缓冲液(的的20mM Tris-HCl,pH值7.4和1mM EDTA,pH值7.4)。
  5. 超声细胞悬浮液,冰浴20秒使用超声波处理器(热系统,型号W-385),在占空比为50%时,允许在冰上冷却30秒,然后重复2倍。
  6. 添加1毫升DNA酶1股票在2毫克/毫升。细胞裂解液在4℃下摇动2小时。
  7. 调整的NaCl至终浓度为500 mM。
  8. 中取出的细胞碎片。在4℃下以10,000 xg离心30分钟。

2。与直链淀粉亲和层析纯化

  1. 平衡1.5毫升的裂解缓冲液中的直链淀粉树脂(50%浆液)。平衡直链淀粉树脂加入细胞裂解物。轻轻摇动4°CO / N
  2. 加载到Econo柱层析柱安装在冷室中的溶胞产物 - 树脂混合物。允许未结合的蛋白质,通过重力柱。
  3. 洗净,用300毫升的洗涤缓冲液I(的20mM Tris-盐酸,pH值7.4,400 mM氯化钠,1mM EDTA的溶液,pH值7.4和0.2mM的PMSF)的直链淀粉树脂。
  4. 重复洗涤用150ml洗涤缓冲液II(20 mm T型的上升HCl,pH值7.4,200 mM氯化钠,1mM的EDTA,pH为7.4,为0.2mM PMSF)。
  5. 加入5毫升的洗脱缓冲液(的20mM的Tris-HCl,pH值7.4,200 mM氯化钠,1mM EDTA的溶液,pH值7.4和0.2mM的PMSF,10mM的麦芽糖)柱中,温育在4℃下进行10分钟,收集洗脱液重复多次。
  6. 合并洗脱液,确定通过加载后,以考马斯亮蓝染色( 图4)上的SDS-PAGE凝胶的洗脱液的等分试样MBP-Mgm101的产率和纯度。

3。断前蛋白酶裂解和阳离子交换层析

  1. 添加50单位PreScission蛋白酶到的MBP-Mgm101洗脱液。在4℃下进行裂解位的CO / N,并允许它继续透析过程中对透析缓冲液(的的20mM Tris-HCl,pH值7.4,100 mM氯化钠,2mM的DTT,1mM EDTA的溶液,pH值7.4和0.2mM的PMSF)
  2. SDS-PAGE凝胶上( 图5A),检查裂解的效率。
  3. 由多个注入负荷切割MBP Mgm101离子在生物秤迷你宏观准备高S墨盒连接到Bio-Rad公司生物DuoFlow FPLC系统。
  4. 开始的阳离子交换色谱法,申请的步骤盐梯度为5mM,300mM的,500毫米,750毫米和1,000 mM NaCl的混合缓冲液A(5 mM氯化钠所建立的;​​的10mM磷酸钠,pH为7.2; mM的PMSF)和缓冲液B(1M NaCl的10mM的磷酸钠,pH为7.2,1mM的PMSF)。设置在0.5毫升/分钟的流速。收集Mgm101馏分和检查产品的纯度的蛋白在SDS-PAGE凝胶( 图5B)。

4。尺寸排阻色谱法

  1. 结合从阳离子交换色谱的蛋白质部分。透析GF平衡缓冲液中的蛋白质(的20mM MOPS,pH为7.0,150 mM氯化钠,1mM的EDTA,pH值7.4,5mM的2 - 巯基乙醇,0.2mM的PMSF)。
  2. VIVASPIN 15R超滤离心柱浓缩蛋白,以3000×g在4℃下通过纺丝,以减低音量〜1毫升
  3. 装载Mgm101Ø呐校准SUPEROSE 6制备级柱层析缓冲液平衡过的20mM MOPS,pH为7.0,150 mM氯化钠,5mM的β-巯基乙醇,1mM EDTA的溶液,pH值7.4,0.2mM的PMSF。
  4. 尺寸排阻色谱运行缓冲液,流速为0.5ml /分钟。
  5. 收集的零碎,纯化Mgm101峰。负载的等分试样的级分在12%的SDS-PAGE检查蛋白质的最终质量。
  6. 与VIVASPIN 6浓缩蛋白,然后迅速冻结样品在液氮中并储存在-80℃下
  7. 中使用Mgm101样品在6-12个月内单链DNA结合测定( 图8),并用透射电子显微镜( 图9)的结构的可视化。

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Representative Results

Mgm101是一个RAD52在线粒体相关的重组蛋白。 RAD52已被广泛研究,它的作用在线粒体DNA重组( 图1)。重组Mgm101可以准备通过三个步骤( 图2)。这是促进所使用的MBP的标记策略,允许以可溶形式表达在Mgm101从标签的蛋白水解裂解,随后被释放( 图3)。

在一个典型的制备方法中,约2-3毫克,MBP-Mgm101融合可以被回收后,直链淀粉的亲和层析从细菌培养1升。 SDS-PAGE凝胶上,MBP-Mgm101的〜70 kDa的( 图4)检测到的一个主要带。如果树脂被适当地洗涤洗脱前,由其他蛋白质的污染是最小的。断前蛋白酶裂解后,MBP和Mgm101的分离和显示为42 kDa和28 kDa的条带分别在SDS-PAGE( 图5A)。在消化不完全的情况下,如由一〜70 kDa条带的存在下,延伸的额外的断前蛋白酶消化忠告。

对于阳离子交换色谱裂解MBP-Mgm101的,MBP的是不保留的盐的应用前由列( 图6)。通常情况下,Mgm101洗脱用500mM的盐没有明显的污染,MBP( 图5B)。一个微小的峰值在300 mM的某个可见,对应的微量未裂解的MBP的Mgm101的的融合。这是可能的一个在该馏分Mgm101是,污染的DNA结合的亲和力,从而降低了向列的约束。因此,阳离子交换树脂是一个必要的步骤,以减少DNA污染。

图7示出的最后一个步骤Mgm101纯化,通过尺寸排阻色谱法。 Mgm101低聚物通常在单分散峰洗脱〜400 kDa的。经常看到一些突变形式的Mgm101之间的尺寸增加V0(空隙容积)和400 kDa的高峰。这样做的原因仍是未知数。突变影响低聚Mgm101可能诱导洗脱的V0级分中的聚集体的形成。但是,我们从来没有见过峰对应单体Mgm101的。 mgm101单体是有可能在溶液中不稳定。

将纯化的Mgm101具有高的单链DNA的结合亲和力( 图8)。基于滴定的游离的单链DNA在凝胶上的单链DNA的结合亲和力的可估计。的Mgm101/ssDNA复杂迁移不佳出来的井。一种可能的解释是,Mgm101带正电荷的和多个亚基的Mgm101到单链DNA的结合,中和其负电荷的蛋白质/ DNA复合物的电泳条件下不动。当适当的准备,Mgm101结合单链DNA与KD〜200纳米。

图9示出通过负染透射电子显微镜的纯化Mgm101的直接结构可视化。为直径为约20 nm的大环低聚物,新鲜制备Mgm101主要存在。相反,老年Mgm101样品形成压缩细丝。这些长丝不形成环的简单堆叠的。显然长丝中的螺旋图案。调制成丝过程的条件,目前正在调查中。可取的做法是,该蛋白质量检查在SDS-PAGE后,孵育在4℃下老化样品之前,通过电子显微镜分析。

图1
RAD52 RAD51重组重组站点上装载作为一个仲裁者,在CA简图如图1所示。nonical同源重组途径(左图),促进单链退火独立Rad51蛋白(右图)。

图2
图2。总体方案编制重组Mgm101的。 Mgm101首先在大肠杆菌中表达大肠杆菌中的MBP融合的形式。通过超声处理的细菌细胞裂解。应用的DNase I消化,减少对DNA的污染。该MBP的Mgm101的融合,然​​后从贫DNA的溶胞产物通过使用直链淀粉柱纯化。经过蛋白水解切割,Mgm101被释放,并通过阳离子交换色谱分离从MBP。这一步是必要的,以进一步减少污染DNA。洗脱下来的Mgm101馏分,然后使其通过的Superose 6制备级柱纯化至均一。


图3。的Mgm101表达质粒pMAL-C2E MGM101的物理图。断前MBP和Mgm101之间蛋白酶的切割位点被指示。的蛋白水解切割产率MBP和Mgm101,其分子量分别为42和28 kDa的。

图4
图4示出,的MBP-Mgm101的直链淀粉的亲和层析后的融合蛋白的纯度的SDS-PAGE电泳。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度,约5μg的Mgm101在凝胶上被加载。凝胶用考马斯亮蓝染色。

图5 图5。Mgm101 SDS-PAGE分析。 A)从MBP-Mgm101的融合蛋白与断前蛋白酶裂解后释放Mgm101。用蛋白酶O / N,消化后的等分试样约含5μg的蛋白质在凝胶上被加载。通过考马斯亮蓝染色的凝胶。 mgm101迁移稍慢于预期大小为28kDa,由于标准SDS-PAGE条件下的整体正电荷的蛋白质。 B)通过阳离子交换色谱分离后从MBP Mgm101。

图6
图6表示MBP的为Mgm101,通过阳离子交换色谱分离的色谱图。在切割的MBP-Mgm101被注入到一个生物量程赠送宏观准备高S墨盒多次。步骤盐梯度5毫米,300毫米,500毫米,750毫米和1000毫米的NaCl,然后应用。 点击这里查看larer图

图7
图7色谱图洗脱档案Mgm101低聚物在校准SUPEROSE 6制备级列。色谱法是通过在流速为0.5ml /分钟。观察到的峰〜400 kDa的洗脱下来的Mgm101的。 V0:空隙容积。, 点击这里查看larer图

图8
图8。电泳迁移率显示,纯化Mgm101拥有强大的单链DNA结合活性的检测。 1.25×10 -3 2,1mM EDTA的溶液,pH值8.0,10%甘油,1mM DTT的50微克/毫升牛血清白蛋白;和1mM PMSF。在室温下温育30分钟后,将样品加载到6%非变性丙烯酰胺凝胶上,并运行在0.5X TBE缓冲液中,在4℃下

图9
图9显示出新鲜的组织结构(左图)和老年(右图)Mgm101的电子显微照片。负染透射电子显微镜进行了使用在JEM-2100透射电子显微镜(JEOL)制工作在200千伏。对于负染色老化Mgm101,蛋白质被储存在4℃下在的GF缓冲液(20mM的MOPS,pH值7.0; 1氯化钠50毫米,5毫米β-巯基乙醇,1 mM的EDTA,pH值7.4和0.2毫米PMSF)分析前4周。 (礼貌的斯蒂芬·威尔肯斯博士)。

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Discussion

它一直是一个挑战,产生一个稳定的,原生的重组Mgm101蛋白E.大肠杆菌可能是由于其在细菌细胞中的不溶性。在这份报告中,我们表明,MBP融合战略使蛋白质表示在相当高的水平。通过负染色透射电子显微镜和尺寸排阻色谱法,我们以前曾表明,MBP的融合蛋白在体外 18形成均匀的低聚物。这是可能的折叠和低聚Mgm101的,可能比较慢线粒体基质相比,细菌细胞中。 unoligomerized Mgm101可迅速形成聚集体, 在体内有毒。 ,MBP的标记可能保持Mgm101一种可溶性的构象,允许生产齐聚,并减少其毒性。

质量好Mgm101制剂的一个重要标准是通过DNA的污染最小。 A 280 / A 280 / A 260的比例是低于这个水平,我建议扩展用DNase消化。在未来,这可能是有用的,以查看是否与S1核酸酶和RNA酶消化,可进一步减少污染的核酸。

我们以前曾表明,贮存在4℃下Mgm101了几个星期,诱导形成的长的螺旋形灯丝17。的连续长纤维形成的机理还不是很清楚。过成丝会影响蛋白质的溶解度。因此,强烈建议新鲜制备的Mgm101蛋白质的等分试样,然后存储在液氮中快速冷冻,在-80℃下存储u的6-12个月后的蛋白质的DNA结合活性保持不变NDER这些条件。

该协议也可用来制备突变体蛋白的Mgm101。低聚状态的稳定性Mgm101频繁的突变的影响。轻度突变可能会导致部分从MBP的裂解后的纯化的蛋白质沉淀。在这些情况下,增加至6升培养体积,以便有足够的稳定的尺寸排阻色谱法纯化的蛋白质的产率。严重影响低聚反应的突变可能允许生产的蛋白质在MBP的稠合的形式,但蛋白质可能并不稳定后,去除MBP的。

总之,目前的协议是可靠的,它允许低聚环在大肠杆菌中大Mgm101的高水平表达大肠杆菌 。此协议可适于Mgm101直向同源物20,21和其他寡聚蛋白的生产,特别是当在细菌细胞中的这些蛋白质的溶解度低。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益。

Acknowledgments

我们感谢斯蒂芬·威尔肯斯在透射电子显微镜的帮助。这项工作是支持由国家机构卫生部授予R01AG023731的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

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