Tilberedning av Mgm101 rekombinasjon Protein av MBP-baserte Tagging Strategi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Gjæren mitokondrie nucleoid protein, Mgm101, er en Rad52-type rekombinasjon protein som danner store oligomeric ringer. En protokoll er beskrevet å forberede løselig rekombinant Mgm101 bruke maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategi kombinert med kationebytter og størrelse utelukkelse kromatografi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den MGM101 genet ble identifisert 20 år siden for sin rolle i opprettholdelsen av mitokondrie-DNA. Studier fra flere grupper har antydet at Mgm101 protein er involvert i recombinational reparasjon av mitokondrie-DNA. Nylige undersøkelser har indikert at Mgm101 er relatert til Rad52-type rekombinasjon protein family. Disse proteinene danner store oligomere ringene og fremme annealing av homolog enkelttrådet DNA-molekyler. Imidlertid har karakterisering av Mgm101 blitt hindret av vanskeligheter med å produsere det rekombinante protein. Her er en pålitelig prosedyre for utarbeidelse av rekombinant Mgm101 beskrevet. Maltose Binding Protein (MBP)-merket Mgm101 er først uttrykt i Escherichia coli. Fusjonsproteinet blir først renset ved amylose affinitetskromatografi. Etter å ha blitt frigitt av proteolytiske spalting, er Mgm101 skilt fra MBP etter kationbytter kromatografi. Monodispersed Mgm101 blir deretter innhentetav størrelse utelukkelse kromatografi. Man fikk et utbytte på ~ 0,87 mg Mgm101 per liter bakteriekultur kan være rutinemessig oppnådd. Den rekombinant Mgm101 har minimal forurensning av DNA. De preparerte prøvene hell brukes til biokjemiske, strukturelle og enkelt partikkel Billedanalyseseksjonen av Mgm101. Denne protokollen kan også anvendes for fremstilling av andre store oligomere DNA-bindende proteiner som kan være toksiske for Misfolded og bakterieceller.

Introduction

Homolog rekombinasjon er viktig for reparasjon av dobbel-tråd pauser (DSBs) og interstrand crosslinks, og for reinitiation av DNA replikering fra sammenraste replikering gafler en. I konvensjonell homolog rekombinasjon, er det sentrale reaksjon katalysert av ATP-avhengige recombinases inkludert RECA i prokaryoter, og RAD51 og Dmc1 i eukaryoter 1-3. Disse recombinases danne nucleoprotein filamenter på ssDNA, som er avgjørende for å initiere homologi søk og strand invasjon innen duplex DNA maler (figur 1, venstre panel) 4-7. I tillegg til det konvensjonelle ordningen, kan homolog rekombinasjon også finne sted i en RecA/Rad51-independent måte (fig. 1, høyre panel). For eksempel kan de gjær Rad52 og Rad59 proteiner direkte katalysere avspenning av komplementære ssDNA tråder som er utsatt ved resectioning av dsDNA pauser. Denne rekombinasjon prosess, kjent som syngele strand avspenning, betyr som regel ikke medføre homologe sammenkobling med dsDNA maler. Etter gløding, er heterologe haler fjernet ved eksonukleaser og hakk ligeres for å gjenopprette genom kontinuitet 8-10. Reparasjon av enkelt strand avspenning mekanismen er ofte ledsaget av sletting av genomisk sekvenser mellom direkte gjentatte regioner.

Rad52 tilhører en mangfoldig gruppe av rekombinasjon proteiner som er utbredt blant bakteriofager 11. Disse proteinene er også kjent som enkelt streng Annealing proteiner (SSAPs), basert på deres aktivitet i å fremme annealing av homolog enkelttrådet DNA-molekyler. De beste kjennetegnet bakteriofag SSAPs er Redβ og Erf fra bakteriofager λ og P22, Rect fra prophage rac og Sak protein fra Lactococcus fag ul36. De SSAPs er strukturelt karakterisert ved en typisk β-β-β-α fold, selv om likheten undetect taltstand i sine primære sekvenser. De alle danner store homo-oligomeric ringer av 10-14 ganger symmetri in vitro 12-14. De funksjonelle implikasjoner av denne karakteristiske høyere orden strukturelt er ikke godt forstått.

Vi er interessert i å forstå mekanismen av homolog rekombinasjon i mitokondrielle genomet. Vi har tidligere identifisert MGM101 gen som er viktig for vedlikehold av mtDNA i Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 ble senere funnet å være assosiert med mitokondrie nucleoids og er nødvendig for toleranse av mtDNA til DNA-skadende agenter 16. Imidlertid har studien av Mgm101 blitt holdt tilbake i det siste tiåret av problemer med å produsere rekombinant Mgm101. Vi har nylig lykkes i å produsere løselig Mgm101 på store mengder fra E. coli ved hjelp av MBP-fusion strategi. Dette har gjort oss i stand til å demonstrere at Mgm101 aksjerbiokjemiske og strukturelle likheter med Rad52-familien av proteiner 17,18. I denne rapporten er en tre-trinns renseprosess som er beskrevet, som produserer homogene Mgm101for biokjemiske og strukturelle analyser (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tidligere studier har vist at de første 22 aminoterminale rester av Mgm101 spaltes etter import inn i mitokondriene 19.. For ekspresjon i E.coli, blir MGM101 åpen leseramme som mangler de første 22 kodoner amplifisert ved PCR og plassert nedstrøms i forhold til hann-sekvens som koder for maltose-bindende protein (MBP) i en modifisert versjon av ekspresjonsvektoren PMAL-C2E. Dette genererer MBP-Mgm101 fusjon med en linker som inneholder en cleavage område for PreScission protease (figur 3). Plasmidet konstruert ved først å velge E. coli transformants uten IPTG og Xgal blå / hvit utvalg. Det resulterende plasmid PMAL-C2E-MGM101 innføres så i E. coli stamme BL21-CodonPlus (DE3)-RIL ved å velge ampicillin og kloramfenikol resistente kolonier.

En. Uttrykk, induksjon, cellelyse og DNase I Treatment

  1. INOCUlate ferske transformanter i 10 ml LB medium (1% Bacto trypton, 0,5% gjærekstrakt, 1% NaCl) supplementert med glukose (0,2%), ampicillin (100 pg / ml) og kloramfenikol (50 ug / ml). Inkuber ved 37 ° CO / N med risting ved 200 rpm.
  2. Inokuler 10 ml forkulturen i 2 liter av LB-medium supplert som beskrevet ovenfor. Dyrke cellene ved 37 ° C med risting inntil OD 600 har nådd 0,5.
  3. Indusere ekspresjon av MBP-Mgm101 fusjonsprotein ved å tilsette Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en endelig konsentrasjon på 0,3 mM. Dyrke cellene med risting ved 30 ° C i 5 t..
  4. Samle cellene ved sentrifugering ved hjelp av en Beckman JA-10 rotor (5500 xg, 4 ° C, 10 min). Etter fjerning av supernatanten, cellepelleten suspenderes i 30 ml lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 og 1 mM EDTA, pH 7,4) inneholdende proteaseinhibitorer (25 uM leupeptin, 1 mM pepstatin A og 1 mM PMSF).
  5. Sonicate cellesuspensjon på is i 20sek ved hjelp av en ultralyd prosessor (Heat Systems, Modell W-385) på 50% duty cycle, avkjøl på is i 30 sek, og gjenta 2x.
  6. Tilsett 1 ml DNAse en lager ved 2 mg / ml. Rock the cellelysat ved 4 ° C i 2 timer.
  7. Juster NaCl til en endelig konsentrasjon på 500 mM.
  8. Fjern celleavfall ved sentrifugering ved 10.000 xg ved 4 ° C i 30 min.

2. Rensing med Amylose affinitetskromatografi

  1. Ekvilibrere 1,5 ml av amylose-harpiks (50% suspensjon) i lyseringsbuffer. Tilsett ekvilibrert amylose harpiks til cellelysat. Rock forsiktig ved 4 ° CO / N.
  2. Laste lysatet-harpiks mix på en Econo-Kolonnekromatografi kolonne installert i et kaldt rom. Tillate de ikke-bundne proteiner å passere kolonnen ved hjelp av tyngdekraften.
  3. Vask den amylose-harpiks med 300 ml av vaskebuffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF).
  4. Gjenta vasketrinn med 150 ml vaskebuffer II (20 mM TRIS-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF).
  5. Tilsett 5 ml av elueringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF, 10 mM maltose) til kolonnen, inkuber ved 4 ° C i 10 min, samle eluatet og gjenta for flere ganger.
  6. Kombiner de eluater, bestemme utbyttet og renheten av MBP-Mgm101 ved lasting av en alikvot av eluatet på en SDS-PAGE-gel, etterfulgt av Coomassie farging (figur 4).

3. PreScission Protease Kløv og kationebytter Kromatografi

  1. Legg 50 enheter av protease PreScission til MBP-Mgm101 eluat. Utføre spaltningen ved 4 ° CO / N og tillater det å fortsette under dialyse mot dialysebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF)
  2. Kontrollere effektiviteten av spalting på en SDS-PAGE-gel (figur 5A).
  3. Legg den kløyvde MBP-Mgm101 av flere injisereioner på en Bio-Scale Mini Macro-Prep Høy S kassett koblet til en Bio-Rad Biologisk DuoFlow FPLC system.
  4. Start kationebytter-kromatografi ved å anvende et trinn saltgradient på 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM og 1,000 mM NaCl som dannes ved blanding av buffer A (5 mM NaCl, 10 mM Na-fosfat, pH 7,2, 1 mM PMSF) og Buffer B (1 M NaCl, 10 mM Na-fosfat, pH 7,2, 1 mM PMSF). Sett flow rate på 0,5 ml / min. Samle Mgm101 fraksjon og kontrollere renheten av proteinet på en SDS-PAGE-gel (figur 5B).

4. Size Exclusion Kromatografi

  1. Kombiner protein fraksjoner fra kationebytter kromatografi. Dialyser proteinet i GF ekvilibrering buffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM 2-merkaptoetanol, 0,2 mM PMSF).
  2. Konsentrer proteinet med VIVASPIN 15R Ultrafiltrering spin-kolonnen for å redusere volumet til ~ 1 ml ved sentrifugering ved 3000 xg ved 4 ° C.
  3. Laste Mgm101 ona kalibrert Superose 6 prep karakter kolonne ekvilibrert med kromatografi buffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
  4. Start gelfiltrerings med kromatografi buffer kjøres med en strømningshastighet på 0,5 ml / min.
  5. Samle fraksjoner av de rensede Mgm101 toppene. Load alikvoter av fraksjoner på en 12% SDS-PAGE for å kontrollere den endelige kvaliteten av proteinet.
  6. Konsentrer protein med VIVASPIN 6, deretter raskt fryse prøvene i flytende N2 og oppbevar ved -80 ° C.
  7. Bruk Mgm101 prøver innen 6-12 måneder for ssDNA-bindingsprøve (fig. 8) og for strukturell visualisering ved transmisjonselektronmikroskopi (figur 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mgm101 er en Rad52-relatert rekombinasjon protein i mitokondriene. Rad52 har blitt grundig undersøkt for sin rolle i mitokondrie DNA rekombinasjon (figur 1). Rekombinant Mgm101 kan fremstilles ved en tre-trinns prosedyre (figur 2). Dette forenkles ved bruk av MBP-merking strategi som tillater Mgm101 skal uttrykkes i en oppløselig form, og deretter frigjøres fra merket ved proteolytisk spaltning (figur 3).

Ved en typisk preparering, kan omtrent 2-3 mg MBP-Mgm101 fusjon gjenvinnes fra 1 liter bakteriell kultur etter amylose affinitetskromatografi. På en SDS-PAGE-gel, er MBP-Mgm101 detektert som en stor band av ~ 70 kDa (figur 4). Forurensningen med andre proteiner er minimal dersom harpiksen er hensiktsmessig vasket før eluering. Etter spalting av PreScission Protease, er MBP og Mgm101 separert og vist som band av 42 kDa og 28 kDa henholdsvis påSDS-PAGE (Figur 5A). I tilfelle av ufullstendig fordøyelse, som indikert ved tilstedeværelsen av et ~ 70 kDa-båndet, er en utvidet fordøyelse med ytterligere PreScission Protease rådet.

For kationebytter-kromatografi av spaltet MBP-Mgm101, er MBP ikke beholdes av kolonnen før anvendelsen av saltet (figur 6). Typisk blir Mgm101 eluert med 500 mM salt uten merkbar forurensning av MBP (fig. 5B). En liten topp på 300 mm er en gang synlig, noe som tilsvarer et spor mengde uncleaved MBP-Mgm101 fusjon. Det er mulig at Mgm101 i denne fraksjon er bundet av kontaminerende DNA, som reduserer bindingsaffiniteten til kolonnen. Således er kationebytter et nødvendig trinn for å minimere DNA-kontaminering.

Figur 7 viser det siste trinnet av Mgm101 rensing av størrelse utelukkelse kromatografi. De Mgm101 oligomers vanligvis Eluer i en monodispersed topppå ~ 400 kDa. Noen mutante former av Mgm101 blir ofte sett med økte størrelser mellom V0 (void volum) og 400 kDa peak. Grunnen til dette er fortsatt ukjent. Mutasjoner som påvirker oligomerization av Mgm101 kan indusere dannelsen av aggregater som Eluer i V0 fraksjoner. Men vi har aldri sett topper tilsvarende monomere Mgm101. Mgm101 monomerer er sannsynligvis ustabil i oppløsning.

Det rensede Mgm101 har en høy bindingsaffinitet til ssDNA (figur 8). Bindingsaffiniteten for ssDNA kan anslås basert på den titrering av den frie ssDNA på gelen. Den Mgm101/ssDNA kompleks vandrer dårlig ut av brønnene. En mulig forklaring er at Mgm101 er positivt ladet og binding av flere subenheter av Mgm101 til ssDNA nøytraliserer sine negative ladninger som gjør proteinet / DNA komplekser immobile under elektroforese forhold. Når riktig forberedt, binder Mgm101 ssDNA med en Kd på ~ 200 nM.

Fig. 9 viser den direkte visualisering av den strukturelle Mgm101 renset ved negativ flekken transmisjonselektronmikroskopi. Nylaget Mgm101 er hovedsakelig til stede som store oligomeric ringer med en diameter på ~ 20 nm. I stedet, de gamle Mgm101 prøvene danner komprimerte filamenter. Disse filamenter ble ikke dannet ved enkel stabling av ringene. Det er helt klart en spiralformede mønster i fibrene. Forholdene som modulerer filamentering prosessen er for tiden under etterforskning. Det er tilrådelig at proteinet Kvaliteten kontrolleres på SDS-PAGE etter inkubering ved 4 ° C for de gamle prøver før de blir analysert ved elektron-mikroskopi.

Figur 1
Figur 1. Forenklet skjematisk diagram som viser at Rad52 fungerer som en mellommann for lasting av RAD51 recombinase på rekombinasjon nettstedet i en canonical homolog rekombinasjon veien (venstre panel), og fremmer enkelt strand avspenning uavhengig av RAD51 (høyre panel).

Figur 2
Figur 2. Totalt ordning for utarbeidelse av rekombinant Mgm101. Mgm101 er først uttrykt i E. coli i en MBP-smeltet skjema. Bakterielle celler blir lysert ved sonikering. DNase I fordøyelse brukes for å redusere DNA-kontaminering. MBP-Mgm101 fusjon blir deretter renset fra DNA-fratatte lysat ved anvendelse av et amylose-kolonne. Etter proteolytisk spaltning, er Mgm101 frigjøres og separert fra MBP ved kationebytter-kromatografi. Dette trinnet er nødvendig for ytterligere å redusere forurensning av DNA. De eluerte Mgm101 fraksjon blir deretter renset til homogenitet ved å føre det gjennom en Superose 6 kolonne prep karakter.


Figur 3. Fysisk kart over Mgm101-uttrykke plasmid PMAL-C2E-MGM101. Spaltningssetet for PreScission protease mellom MBP og Mgm101 indikeres. Den proteolytisk spaltning utbytter MBP og Mgm101 med en molekylvekt på 42 og 28 kDa hhv.

Figur 4
Fig. 4. SDS-PAGE som viser renheten av MBP-Mgm101 fusjonsprotein etter amylose affinitetskromatografi. Proteinkonsentrasjon bestemmes ved å måle absorbansen ved 280 nm og omtrent 5 mikrogram av Mgm101 er lastet på gelen. Gelen er farget med Coomassie blå.

Figur 5 Figur 5. SDS-PAGE-analyse av Mgm101. A) Utgivelsen av Mgm101 fra MBP-Mgm101 fusion protein etter spalting med PreScission protease. Etter fordøyelse med proteasen O / N, en alikvot inneholdt tilnærmet 5 ug av protein er lastet på gelen. Gelen ble farget med Coomassie blå. Mgm101 vandrer litt langsommere enn den forventede størrelse på 28 kDa, på grunn av den generelle positiv ladning av proteinet under SDS-PAGE standard tilstand. B) Mgm101 etter separasjon fra MBP etter kationebytter kromatografi.

Figur 6
Figur 6. Kromatogram viser separasjon av Mgm101 fra MBP ved kationebytter-kromatografi. Den kløyvde MBP-Mgm101 injiseres i en Bio-Scale Mini Macro-Prep Høy S patron flere ganger. Et skritt salt gradient av 5 mm, 300 mm, 500 mm, 750 mm og 1000 mm NaCl brukes deretter. Klikk her for å se larer figur .

Figur 7
Figur 7. Kromatogram som viser elueringsprofilen til Mgm101 oligomerer på en kalibrert Superose 6 kolonne prep karakter. Kromatografi utføres ved ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min. Den eluerte Mgm101 er observert som en topp på ~ 400 kDa. V0: void volum. Klikk her for å se larer figur .

Figur 8
Figur 8. Elektroforetisk mobilitet shift assay som viser at det rensede Mgm101 har en robust bindingsaktivitet til ssDNA. Den 1,25 x 10 -3 MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8,0, 10% glyserol, 1 mM DTT, 50 ug / ml BSA, og 1 mM PMSF. Etter inkubering ved RT i 30 min, blir prøvene påsatt på en 6% akrylamidgel innfødt og kjøres i 0,5 x TBE-buffer ved 4 ° C.

Figur 9
Figur 9. Electron mikrografer viser at den strukturelle organiseringen av fersk (venstre panel) og eldre (høyre panel) Mgm101. Negativ farging transmisjonselektronmikroskopi utføres ved hjelp av et JEM-2100 transmisjonselektronmikroskop (JEOL) som opererer ved 200 kV. For negativ flekk av alderen Mgm101, er proteinet som er lagret ved 4 ° C i GF-buffer (20 mM MOPS, pH 7.0; ett50 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF) i 4 uker før de ble analysert. (Courtesy of Dr. Stephan Wilkens).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det har vært en utfordring å få et stabilt, native rekombinant Mgm101 protein fra E. coli eventuelt på grunn av sin uoppløselighet i bakterieceller. I denne rapporten viser vi at MBP-fusion strategi gjør at proteinet skal bli uttrykt på et rimelig høyt nivå. Ved hjelp av negativ farging transmisjonselektronmikroskopi og gelfiltrerings-kromatografi, vi har tidligere vist at MBP-fusjonsproteinet danner ensartede oligomerer in vitro 18.. Det er mulig at folding og oligomerisering av Mgm101 kan være langsommere i de bakterielle celler sammenlignet med den mitokondrielle matriks. Den unoligomerized Mgm101 kan raskt danne aggregater som er giftige in vivo. MBP-tagging kan holde Mgm101 i en løselig konformasjon som gjør at produktiv oligomerization og reduserer dets toksisitet.

Et viktig kriterium for god kvalitet Mgm101 forberedelse er å ha minimal forurensning av DNA. A 280 / A A-280/260 A-forhold er under dette nivå, utvidede fordøyelse med DNase I er anbefalt. I fremtiden kan det være nyttig å se om fordøyelsen med S1 nuclease og RNase kan ytterligere redusere forurensende nukleinsyrer.

Vi har tidligere vist at lagring av Mgm101 ved 4 ° C i noen få uker induserer dannelsen av lange heliske filamenter 17. Mekanismen for filament formasjon er ikke godt forstått. Over-filamentering påvirker løseligheten av proteinet. Derfor er det sterkt anbefalt at porsjoner av nylaget Mgm101 protein er raskt frosset i flytende nitrogen etterfulgt av lagring ved -80 ° C. Den DNA-bindende aktivitet av proteinet forblir uendret etter 6-12 måneders lagring under disse forholdene.

Denne protokollen kan også anvendes for å fremstille mutante proteiner av Mgm101. Den oligomerisering tilstanden og stabiliteten av Mgm101 blir ofte påvirket av mutasjonene. Milde mutasjoner kan forårsake en delvis utfelling av de rensede proteiner ved spalting fra MBP. I slike tilfeller øker kultur volum på 6 liter kan tillate tilstrekkelig utbytte av de stabile rensede proteiner fra gelfiltrerings-kromatografi. Alvorlige mutasjoner som påvirker oligomerisering kan tillate produksjon av proteiner i en MBP-smeltet form, men proteinet kan ikke være stabil etter fjerning av MBP.

Oppsummert er gjeldende protokoll pålitelig som gir høy grad uttrykk for store Mgm101 oligomeric ringer i E. coli. Denne protokollen kan tilpasses produksjon av Mgm101 orthologs 20, 21 og andre oligomere proteiner, spesielt når løseligheten av disse proteinene er lav i de bakterielle celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Stephan Wilkens for hjelp i transmisjonselektronmikroskopi. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant R01AG023731.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics