Vorbereitung des Mgm101 Rekombinationsprotein von MBP-based Tagging-Strategie

Biology

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Summary

Die Hefe-Mitochondrien nucleoid Protein, Mgm101, ist ein Rad52-Typ Rekombinationsprotein die große oligomere Ringe bildet. Ein Protokoll wird beschrieben, dass lösliches rekombinantes Mgm101 vorzubereiten mit dem Maltose Binding Protein (MBP)-Tagging-Strategie mit Kationenaustausch und Größenausschlusschromatographie gekoppelt.

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Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

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Abstract

Die MGM101 Gen wurde vor 20 Jahren für seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA identifiziert. Studien aus mehreren Gruppen haben vorgeschlagen, dass das Protein in der Mgm101 recombinational Reparatur der mitochondrialen DNA beteiligt ist. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass Mgm101 der Rad52-Typ Rekombinationsprotein Familie verwandt ist. Diese Proteine ​​bilden große oligomere Ringe und fördern die Anlagerung homologen einzelne DNA-Moleküle. Allerdings hat die Charakterisierung von Mgm101 der Schwierigkeit bei der Herstellung des rekombinanten Proteins behindert. Hier wird ein zuverlässiges Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Mgm101 beschrieben. Maltose Binding Protein (MBP)-markierten Mgm101 zunächst in Escherichia coli exprimiert. Das Fusionsprotein wird zunächst durch Amylose-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach der Begrüßung durch proteolytische Spaltung freigesetzt wird Mgm101 von MBP durch Kationenaustauschchromatographieschritt getrennt. Monodispersen Mgm101 erhält danndurch Größenausschlusschromatographie. Eine Ausbeute von ~ 0,87 mg Mgm101 pro Liter Bakterienkultur kann routinemäßig erhalten. Das rekombinante Mgm101 eine minimale Verunreinigung der DNA. Die vorbereiteten Proben werden erfolgreich für biochemische, strukturelle und Single Particle-Image-Analysen von Mgm101 verwendet. Dieses Protokoll kann auch zur Herstellung von anderen großen oligomere DNA-bindende Proteine ​​falsch gefaltet und giftig für Bakterienzellen verwendet werden.

Introduction

Homologe Rekombination ist für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) und Interstrang Vernetzungen und für die Wiederaufnahme der DNA-Replikation von eingestürzten Replikationsgabeln 1 wichtig. In konventionellen homologen Rekombination ist die zentrale Reaktion der ATP-abhängigen Rekombinasen wie RecA in Prokaryoten und Rad51 und Dmc1 in Eukaryonten 1-3 katalysiert wird. Diese Rekombinase bilden nucleoprotein Filamente auf ssDNA, die unerlässlich für die Einleitung Homologiesuche und Stranginvasion innerhalb duplex DNA-Templates (Abbildung 1, links) 4-7 sind. Zusätzlich zu den herkömmlichen Schema kann homologe Rekombination auch in einer Weise RecA/Rad51-independent (Abbildung 1, rechts). Zum Beispiel kann die Hefe Rad52 und Rad59 Proteine ​​direkt katalysieren die Anlagerung komplementäre ssDNA-Stränge, die durch Resektion von dsDNA Unterbrechungen ausgesetzt sind. Diese Rekombination Prozess, da singen bekanntle Banddurchlaufanlagen, hat in der Regel nicht um homologe Paarung mit dsDNA Vorlagen. Nach dem Glühen werden heterologe Schwänze durch Exonucleasen entfernt und Kerben sind ligiert Genom Kontinuität 8-10 wiederherzustellen. Reparatur durch den einzigen Banddurchlaufanlagen Mechanismus wird oft durch Deletionen von genomischen Sequenzen zwischen direkt wiederholt Regionen begleitet.

Rad52 gehört zu einer vielfältigen Gruppe von Proteinen, die Rekombination verbreitet unter 11 Bakteriophagen sind. Diese Proteine ​​sind auch als Single Strand Annealing Proteine ​​(SSAPs) bekannt, auf der Grundlage ihrer Aktivität in der Förderung der Anlagerung homologen einzelsträngige DNA-Moleküle. Die am besten charakterisierten Bakteriophagen SSAPs sind Redβ und Erf vom Bakteriophagen λ und P22, RecT vom Prophagen rac und der Sak-Protein aus der Lactococcus-Phagen UL36. Die SSAPs sind strukturell durch eine typische β-β-β-α fach dadurch, obwohl Ähnlichkeit praktisch Nichterfassungssignal wirdkönnen in ihrer primären Sequenzen. Sie alle bilden große homooligomeren Ringe von 10 - 14 fache Symmetrie in vitro 12-14. Die funktionellen Auswirkungen dieser Eigenschaft höherer Ordnung strukturelle Organisation ist nicht gut verstanden.

Wir sind daran interessiert, zu verstehen, den Mechanismus der homologen Rekombination in der mitochondrialen Genoms. Wir haben zuvor die MGM101 Gen, das für die Aufrechterhaltung der mtDNA in Saccharomyces cerevisiae 15 identifiziert. MGM101 anschließend wurde festgestellt, dass mitochondriale Nukleoide an und ist für die Toleranz der mtDNA auf DNA-schädigende Mittel 16 erforderlich. Allerdings wurde in der Studie von Mgm101 wurde zurück in den letzten zehn Jahren durch die Schwierigkeit gehalten rekombinanten Mgm101 erzeugen. Wir haben vor kurzem in der Herstellung von löslichen Mgm101 bei großen Mengen aus E. gelungen coli mit dem MBP-Fusion-Strategie. Dies hat es uns ermöglicht, dass Mgm101 Aktien demonstrierenbiochemische und strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Rad52-Familie von Proteinen 17,18. In diesem Bericht wird eine dreistufige Reinigungsverfahren beschrieben, die produziert homogene Mgm101for biochemische und strukturelle Analysen (Abbildung 2).

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Protocol

Frühere Studien haben gezeigt, dass die ersten 22 aminoterminalen Reste von Mgm101 nach dem Import in Mitochondrien 19 gespalten werden. Zur Expression in Escherichia coli, wird das MGM101 offenen Leserahmen ohne die ersten 22 Codons durch PCR amplifiziert und hinter die männlichen Sequenz, die das Maltose-bindende Protein (MBP) in einer modifizierten Version des Expressionsvektors pMAL-C2E platziert. Dies erzeugt die MBP-Mgm101 Fusion mit einem Linker, der eine Spaltstelle für die Protease PreScission (Abbildung 3). Das Plasmid wird zunächst durch Auswahl E. konstruiert coli Transformanten ohne IPTG und X-Gal blau / weiß-Selektion. Das resultierende Plasmid pMAL-C2E-MGM101 wird dann in den E. eingeführt coli-Stamm BL21-CodonPlus (DE3)-RIL indem Sie Ampicillin und Chloramphenicol-resistenten Kolonien.

1. Expression, Induktion, Cell Lysis und DNase I Behandlung

  1. InocUlate frisch Transformanten in 10 ml LB-Medium (1% Bacto Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) mit Glucose (0,2%), Ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (50 ug / ml) ergänzt. Bei 37 ° CO / N unter Schütteln bei 200 rpm inkubiert.
  2. Impfen die 10 ml Vorkultur in 2 Liter des ergänzten LB-Medium wie oben. Wachsen die Zellen bei 37 ° C unter Schütteln bis OD 600 erreicht 0,5.
  3. Induzieren der Expression von MBP-Mgm101 Fusionsproteins durch Zugabe von Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0,3 mM. Wachsen die Zellen unter Schütteln bei 30 ° C für 5 Stunden.
  4. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation unter Verwendung eines Beckman JA-10-Rotor (5.500 × g, 4 ° C, 10 min). Nachdem der Überstand verworfen, das Zellpellet in 30 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 1 mM EDTA, pH 7,4), der Protease-Inhibitoren (25 uM Leupeptin, 1 uM Pepstatin A und 1 mM PMSF).
  5. Beschallen Zellsuspension auf Eis für 20sec mit einem Ultraschall-Prozessor (Heat Systems; Modell W-385) bei 50% ED, ermöglichen, sich auf Eis für 30 sec abkühlen und 2x wiederholen.
  6. 1 ml DNAse 1 stock bei 2 mg / ml. Rock the Zelllysat bei 4 ° C für 2 Stunden.
  7. Stellen NaCl bis zu einer Endkonzentration von 500 mM.
  8. Entfernen der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10.000 × g bei 4 ° C für 30 min.

2. Reinigung mit Amylose-Affinitätschromatographie

  1. Äquilibrieren 1,5 ml Amylose-Harz (50% Suspension) in dem Lysepuffer. Fügen Sie das Gleichgewicht Amyloseharz dem Zelllysat. Schaukeln sanft bei 4 ° CO / N.
  2. Legen Sie das Lysat-Harz-Mischung auf einer Econo-Column Chromatographie-Säule in einem kalten Raum installiert. Lassen Sie die ungebundenen Proteine, um die Spalte durch die Schwerkraft passieren.
  3. Waschen der Amylose-Harz mit 300 ml Waschpuffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF).
  4. Wiederholen Sie die Wäsche mit 150 ml Waschpuffer II (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF).
  5. 5 ml Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF, 10 mM Maltose) auf die Säule bei 4 ° C inkubiert für 10 Minuten, Sammeln das Eluat und wiederholen Sie für weitere Male.
  6. Kombinieren der Eluate, bestimmen die Ausbeute und Reinheit der MBP-Mgm101 durch Laden eines Aliquots des Eluats auf einem SDS-PAGE-Gel von Coomassie-Färbung (Abbildung 4).

3. PreScission Proteasespaltung und Kationenaustausch-Chromatographie

  1. In 50 Einheiten PreScission Protease an die MBP-Mgm101 Eluat. Führen die Spaltung bei 4 ° CO / N und lassen es während der Dialyse gegen Dialysepuffer weiter (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 100 mM NaCl; 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF)
  2. Prüfen Sie die Effizienz der Spaltung auf einem SDS-PAGE-Gel (Abbildung 5A).
  3. Legen Sie das gespaltene MBP-Mgm101 von mehreren injizierenIonen auf einem Bio-Maßstab Mini Macro-Prep Hohe S Patrone zu einem Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC-System verbunden.
  4. Starten Sie den Kationenaustauscherchromatographie durch Anlegen einer Schritt Salzgradient von 5 mm, 300 mm, 500 mm, 750 mm und 1000 mM NaCl, die durch Mischen von Puffer A (5 mM NaCl erstellt wird; 10 mM Na-Phosphat, pH 7,2; 1 mM PMSF) und Puffer B (1 M NaCl; 10 mM Na-Phosphat, pH 7,2; 1 mM PMSF). Stellen Sie den Durchfluss bei 0,5 ml / min. Sammeln Sie die Mgm101 Fraktion und überprüfen Sie die Reinheit des Proteins auf einem SDS-PAGE-Gel (Abbildung 5B).

4. Size Exclusion Chromatography

  1. Kombinieren Sie die Proteinfraktionen aus Kationenaustauscherchromatographie. Dialyse des Proteins in GF Äquilibrierungspuffer (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF).
  2. Konzentrieren des Proteins mit VIVASPIN 15R Ultrafiltration Spin-Säule, um die Lautstärke zu ~ 1 ml durch Spinnen bei 3.000 xg bei 4 ° C reduzieren
  3. Legen Mgm101 ona kalibriert Superose 6 prep Grad Säule, die mit dem Chromatographie-Puffer (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl; 5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
  4. Starten des Größenausschluss-Chromatographie mit dem Puffer bei einer Flussrate von 0,5 ml / min ausgeführt.
  5. Sammeln Sie die Fraktionen der gereinigten Mgm101 Gipfeln. Legen Aliquots der Fraktionen auf einem 12% SDS-PAGE zur Überprüfung der Qualität des fertigen Protein.
  6. Konzentrieren des Proteins mit VIVASPIN 6, dann schnell frieren die Proben in flüssigem N2 und bei -80 ° C
  7. Verwenden Sie die Mgm101 Proben innerhalb von 6-12 Monaten für ssDNA-Bindungs-Assay (Abbildung 8) und für strukturelle Visualisierung mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie (Abbildung 9).

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Representative Results

Mgm101 ist ein Rad52-bezogenen Rekombinationsprotein in Mitochondrien. Rad52 wurde ausgiebig für seine Rolle in der mitochondrialen DNA-Rekombination (Abbildung 1) untersucht. Rekombinante Mgm101 kann durch eine Drei-Schritt-Verfahren (Abbildung 2) hergestellt werden. Dies wird durch die Verwendung des MBP-Tagging Strategie Mgm101 in eine lösliche Form exprimiert werden und anschließend von dem Tag durch proteolytische Spaltung freigesetzt (Fig. 3) kann erleichtert.

In einer typischen Herstellung können etwa 2-3 mg MBP-Fusion Mgm101 von 1 Liter Bakterienkultur nach Amylose Affinitätschromatographie gewonnen werden. Auf einem SDS-PAGE-Gel wird MBP-Mgm101 als Hauptbande von ~ 70 kDa (Abb. 4) detektiert. Verunreinigung durch andere Proteine ​​ist minimal, wenn das Harz auch vor der Elution gewaschen. Nach Spaltung durch PreScission Protease werden MBP und Mgm101 getrennt und als Banden von 42 kDa und 28 kDa gezeigt, die jeweils aufSDS-PAGE (Fig. 5A). Bei unvollständiger Verdauung, wie durch die Gegenwart einer ~ 70 kDa-Bande ist eine erweiterte Verdauung mit zusätzlichen PreScission Protease bereitstellt.

Für die Kationenaustauschchromatographie von gespaltenem MBP-Mgm101 wird MBP nicht durch die Säule vor dem Aufbringen des Salzes (6) gehalten ist. Typischerweise wird Mgm101 mit 500 mM Salz ohne merkliche Kontamination durch MBP (5B) eluiert. Ein kleiner Peak bei 300 mM ist manchmal sichtbar, was einer Spurenmenge von ungeschnittenen MBP-Fusion Mgm101. Es ist möglich, dass Mgm101 in dieser Fraktion durch kontaminierende DNA, die Bindungsaffinität reduziert auf die Säule gebunden ist. Somit ist Kationenaustausch ein notwendiger Schritt, um DNA-Kontaminationen zu minimieren.

Abbildung 7 zeigt den letzten Schritt Mgm101 Reinigung durch Größenausschlusschromatographie. Die Mgm101 Oligomere typischerweise in einer monodispersen Peak eluiertvon ~ 400 kDa. Einige mutierte Formen von Mgm101 werden oft mit erhöhter Größen zwischen V0 (void Volumen) und der 400 kDa Peak gesehen. Der Grund dafür ist noch unbekannt. Mutationen, die die Oligomerisierung von Mgm101 induzieren kann die Bildung von Aggregaten, die in den V0 Fraktionen eluieren. Wir haben jedoch nie Peaks monomeren Mgm101 gesehen. Mgm101 Monomere sind höchstwahrscheinlich instabil in Lösung.

Das gereinigte Mgm101 hat eine hohe Affinität zu ssDNA (Abbildung 8). Die Bindungsaffinität für ssDNA kann basierend auf der Titration der frei ssDNA auf dem Gel abgeschätzt werden. Die Mgm101/ssDNA Komplex wandert schlecht aus den Brunnen. Eine mögliche Erklärung ist, dass Mgm101 positiv geladen ist und die Bindung von mehreren Untereinheiten Mgm101 um ssDNA neutralisiert die negativen Ladungen, die das Protein / DNA-Komplexe unbeweglich unter den Bedingungen der Elektrophorese ist. Wenn entsprechend vorbereitet, bindet Mgm101 ssDNA mit einem Kd-Wert von ~ 200 nM.

Abbildung 9 zeigt die direkte strukturelle Visualisierung des gereinigten Mgm101 durch negative Fleck Transmissions-Elektronenmikroskopie. Frisch präparierte Mgm101 überwiegend als große oligomere Ringe mit einem Durchmesser von ~ 20 nm. Stattdessen bilden die Alters Mgm101 Proben komprimiert Filamente. Diese Filamente werden durch die einfache Stapelung der Ringe gebildet ist. Es ist eindeutig ein spiralförmiges Muster in den Filamenten. Die Bedingungen, die die Filamentierung Prozess modulieren werden derzeit untersucht. Es ist ratsam, dass die Qualität der Proteine ​​auf SDS-PAGE nach der Inkubation bei 4 ° C geprüft für die gealterten Proben, bevor sie durch Elektronenmikroskopie analysiert.

Abbildung 1
1. Vereinfachtes schematisches Diagramm zeigt, daß Rad52 als Vermittler für die Belastung des Rad51 Rekombinase auf dem Rekombinationsstelle dient in ca.kanonischen homologe Rekombination Weg (links), und fördert Einzelstrang Glühen unabhängig von Rad51 (rechtes Bild).

Abbildung 2
2. Gesamtkonzept für die Herstellung von rekombinanten Mgm101. Mgm101 wird zunächst in E. ausgedrückt coli in einem MBP-kondensierter Form. Bakterienzellen durch Beschallung lysiert. DNAse I Verdauung angewendet wird, um DNA-Kontaminationen zu reduzieren. Der MBP-Fusion Mgm101 wird dann von der DNA-abgereicherten Lysat unter Verwendung eines Amylose-Säule gereinigt. Nach proteolytische Spaltung, wird Mgm101 freigegeben und von MBP durch Kationenaustauschchromatographie. Dieser Schritt ist notwendig, eine weitere Verringerung der Kontamination von DNA. Die eluierte Fraktion wird dann Mgm101 zur Homogenität, indem es durch eine Superose 6 prep Grad gereinigt.


Abbildung 3. Physikalische Karte der Mgm101-exprimierenden Plasmid pMAL-C2E-MGM101. Die Spaltstelle der Protease PreScission zwischen MBP und Mgm101 angegeben. Die proteolytische Spaltung liefert MBP und Mgm101 mit einem Molekulargewicht von 42 und 28 kDa.

Fig. 4
4. SDS-PAGE, die die Reinheit des MBP-Fusionsprotein nach Mgm101 Amylose Affinitätschromatographie. Die Proteinkonzentration wird durch Messung der Absorption bei 280 nm und etwa 5 ug Mgm101 auf das Gel geladen. Das Gel wird mit Coomassie-Blau gefärbt.

Abbildung 5 Abbildung 5. SDS-PAGE-Analyse von Mgm101. A) Die Freisetzung von Mgm101 aus dem MBP-Fusionsprotein Mgm101 nach der Spaltung mit der Protease PreScission. Nach dem Verdau mit der Protease O / N, ein Aliquot, enthaltend etwa 5 ug Protein auf das Gel geladen. Das Gel wird mit Coomassie-Blau gefärbt. Mgm101 wandert etwas langsamer als die erwartete Größe von 28 kDa, durch die positive Gesamtladung des Proteins unter der Standard-SDS-PAGE erhalten. B) Mgm101 nach der Trennung von MBP durch Kationenaustauschchromatographie.

Abbildung 6
6. Chromatogramm, das die Trennung von Mgm101 von MBP durch Kationenaustauschchromatographie. Die gespaltene MBP-Mgm101 in eine Bio-Maßstab Mini Macro-Prep Hohe S Patrone mehrfach injiziert. Ein Schritt Salzgradienten von 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM und 1000 mM NaCl aufgebracht wird. Klicken Sie hier, um larer Figur sehen .

Abbildung 7
Abbildung 7. Chromatogramm zeigt das Elutionsprofil Mgm101 Oligomere auf einer geeichten Superose 6 prep Grad Spalte. Chromatographie wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min durchgeführt. Die eluierte Mgm101 ist als Peak von ~ 400 kDa beobachtet. V0: void Volumen. Klicken Sie hier, um larer Figur sehen .

Fig. 8
Abbildung 8. Elektrophoretische Mobility Shift Assay zeigt, dass das gereinigte Mgm101 eine robuste Bindungsaktivität an ssDNA hat. Der 1,25 x 10 -3 2; 1 mM EDTA, pH 8,0, 10% Glycerin; 1 mM DTT; 50 ug / ml BSA und 1 mM PMSF. Nach Inkubation bei RT für 30 min werden die Proben auf einem 6% Acrylamid nativen Gel geladen und in 0,5 × TBE-Puffer bei 4 ° C.

Abbildung 9
Abbildung 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die strukturelle Organisation der frischen (links) und im Alter (rechts) Mgm101. Negative Färbung Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung eines JEM-2100 Transmissionselektronenmikroskops (JEOL) bei 200 kV durchgeführt. Für Negativ des Alters Mgm101 Fleck wird das Protein bei 4 ° C in der GF-Puffer (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl; 5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF) für 4 Wochen vor der Analyse. (Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Stephan Wilkens).

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Discussion

Es war eine Herausforderung, um eine stabile, nativen rekombinanten Protein aus E. Mgm101 produzieren coli möglicherweise aufgrund seiner Unlöslichkeit in Bakterienzellen. In diesem Bericht zeigen wir, dass die MBP-Fusion-Strategie das Protein zu einem angemessen hohen Niveau exprimiert werden können. Durch negative Färbung Transmissionselektronenmikroskopie und Größenausschlusschromatographie, haben wir bereits gezeigt, dass die MBP-Fusionsprotein einheitliche Oligomere bildet in vitro 18. Es ist möglich, dass die Faltung und Oligomerisierung Mgm101 kann langsamer sein, in den Zellen der Bakterien gegenüber der mitochondrialen Matrix. Die unoligomerized Mgm101 kann schnell Aggregate bilden, die toxisch in vivo sind. MBP-Tagging kann Mgm101 in einer löslichen Konformation, die produktiver Oligomerisierung ermöglicht und vermindert dessen Toxizität zu halten.

Ein wichtiges Kriterium für gute Qualität Mgm101 Vorbereitung ist auf minimale Kontamination durch DNA haben. Die A 280 / A 280 / A 260-Verhältnis ist unter diesem Niveau, erweiterte Verdauung mit DNAse I wird empfohlen. In der Zukunft kann es nützlich sein, um zu sehen, ob Verdauung mit S1-Nuklease und RNase weiter reduzieren kann kontaminierenden Nukleinsäuren.

Wir haben zuvor gezeigt, dass die Lagerung von Mgm101 bei 4 ° C für ein paar Wochen die Bildung von langen helikalen Filamenten 17 induziert. Der Mechanismus der Fadenbildung nicht gut verstanden. Over-filamentation beeinflußt die Löslichkeit des Proteins. Daher ist es dringend empfohlen, dass Aliquots frisch zubereitet Mgm101 Protein schnell in flüssigem Stickstoff durch Lagerung folgte bei -80 ° C. Die DNA-bindende Aktivität des Proteins bleibt nach 6-12 Monaten Lagerung u unverändertnter diese Bedingungen.

Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um mutierte Proteine ​​Mgm101 herzustellen. Die Oligomerisierung Zustand und die Stabilität der Mgm101 werden häufig durch die Mutationen betroffen. Mild Mutationen bewirken eine teilweise Ausfällung der gereinigten Proteine ​​bei der Spaltung von MBP. In diesen Fällen ist die Erhöhung der Kultur auf 6 Liter kann eine ausreichende Ausbeute an stabilen gereinigten Proteine ​​von Größenausschlusschromatographie. Schwere Mutationen Oligomerisierung kann ermöglichen die Herstellung von Proteinen in einer MBP-kondensierten Form, sondern das Protein nicht nach Entfernung des MBP stabil.

Zusammenfassend ist das aktuelle Protokoll zuverlässig ermöglicht, welche eine hohe Expression von großen Mgm101 oligomeren Ringe in E. coli. Dieses Protokoll kann auf die Herstellung von Mgm101 orthologs 20, 21 und andere oligomere Proteine ​​angepasst werden, insbesondere wenn die Löslichkeit dieser Proteine ​​günstig in den Zellen der Bakterien ist.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Wir danken Stephan Wilkens für Hilfe in Transmissions-Elektronenmikroskopie. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01AG023731 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

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References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

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