获取荧光时间推移电影的芽殖酵母和分析单细胞动力学移植物

Biology

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Summary

我们提出了一个简单的协议来获得生长的酵母细胞的荧光显微镜的电影,和一个基于GUI的软件程序包,提取单细胞的时间序列数据。该分析包括自动沿袭和集成的跟踪数据的目视检查和手工curation分组表决的时间分配。

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Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

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Abstract

荧光时间推移显微镜在单细胞水平研究的许多生物过程中已经成为一个强大的工具。特别地,描绘基因表达的时间依赖性的电影提供深入了解其调节的动态,但是,也有许多的技术挑战,以获得和分析单个细胞的荧光电影。我们在这里介绍一个简单的协议,使用市售的微流体培养装置,产生这样的数据,和一个基于MATLAB的图形用户界面(GUI)为基础的软件封装量化荧光图像。的软件段和轨道细胞,使用户能够直观地牧师数据中的错误,并自动分配的血统和分裂次数。 GUI进一步分析时间序列产生整个细胞的痕迹以及他们的第一和第二次衍生物。虽然该软件是专为S。酵母 ,其模块化和通用性,应该允许它吨Ø作为一个平台,研究其他细胞类型的一些修改。

Introduction

单细胞基因表达分析进一步了解基因调控的许多方面。荧光记者表达的静态快照,使用流式细胞仪或显微镜单细胞表达的分布提供了有用的信息,但缺乏需要直接告知基因表达的动态时间序列数据的历史和演变。荧光时间推移显微镜呈现的一种手段,同时获得单细胞测定和他们的历史。各种实验和分析技术已经发展到获取和定量荧光记者表达的电影,从而传授洞察(见检讨1)如细胞与细胞变异细菌的持久化形成4,2,3,转录基因调控功能启动和延伸5,转录6,7爆破,细胞周期依赖性8,9的 ,和遗传10。但是,OBT质量恒常单细胞荧光时间序列,包括培养的单层细胞在一个可控的环境中,并在高通量定量分析所获取的荧光电影的重要的技术挑战。在这里,我们描述一个过程来获取和分析荧光S的电影酵母中没有所需的经验,在细胞培养装置制造或在软件开发中( 图1)。

首先,我们将详细地,例如,协议产生荧光的时间序列的芽殖酵母表达一种或多种荧光记者的电影。虽然定制的微文化室已建成并成功地采用了先前11-13,我们使用市售的微流体装置从CellAsic(加利福尼亚Hayward)。系统局限单层生长的细胞,并允许灌注环境的持续控制。显微镜协议,我们提出的是一个简单的方法来获得fluoresc芽殖酵母的ENCE电影的,但任何修改过的实验方案(定制培养装置,替代介质条件 )的单个酵母细胞产生类似的荧光电影数据可能会被取代。

接下来,我们勾勒出电影使用的图形用户界面(GUI)基于MATLAB软件包(Mathworks公司,马萨诸塞Natic​​k),被称为快速荧光时间​​系列分析的图形用户界面(移植物),提取时间序列数据分析单细胞。移植物有类似的功能,多功能的,开放源码的软件包细胞ID 14分割和跟踪细胞中提取荧光强度和几何信息。然而,移植物提供了重要的额外功能。首先,它提供了简单的交互式编辑分割和跟踪结果来验证数据的准确性,而不是仅仅统计浇注离群区域分析后的痕迹。此外,它扩展了分析,自动生成Ÿ候谱系和细胞周期的芽殖酵母的兴趣点。决定时,母亲和女儿划分,以形成两个独立的单元区域是非常重要的,以确定在整个细胞周期8的全细胞(包括任何连接芽的母亲)测量。该套件包括三个模块来完成这些任务。第一部分单元区域的基础上聚焦和散的明视场图像之间的对比度,并允许用户定义和视觉测试分段参数。第二轨道(布莱尔和克罗克 IDL例行杜弗兰的MATLAB实现,可在: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ),通过测量细胞区域自动分配谱系;使视力检查和纠错。一个简单的绘图GUI是来查询单细胞性质。第三个模块赋予现蕾和分工TIMES,和全细胞输出的时间序列数据,以及他们的第一和第二时间的衍生物(9所讨论的)。分析模块输出的数据,为后续研究的统计软件选择作为空间分隔的文本文件。因此,包使用户能够提取高品质的时间序列数据,通过图形界面。我们已经用这种方法在单芽殖酵母细胞的细胞周期9为一个函数估计实时转录率。模块进行了优化,芽殖酵母,参数或,如有必要,可适于其他生物体和图像类型可自由查看的代码。分割,跟踪和谱系分配算法可能是特定类型的成像分配和生物体。现有的算法可以被取代,但仍保留的GUI界面,允许用户友好的可视化分割和跟踪检查和纠正错误总是占据R与任何算法。

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Protocol

1。获取单个酵母细胞生长在微流控室的荧光显微镜电影

  1. 培养物接种1毫升SC媒体(合成用2%的葡萄糖和氨基酸的完整补充定义的介质)与细胞从新鲜生长板,和孵育在30℃下培养过夜〜16小时的辊鼓上准备培养,例如,最终的OD 600nm的 〜0.1早期的对数相生长。
  2. OD 600nm的 = 0.1稀释起动文化需要,新生1毫升新鲜试管6-8小时。这提供了适合微流体装置装入密度细胞生长在营养丰富的稳态。 (另外,取代步骤1.1-1.2的程序必须的准备工作,如实验所需的细胞。)
  3. 准备一个的Y04C微文化板块从CellAsic:除去运输解决方案;用无菌水冲洗井;使用ONIX灌注系统流量水通过孔1-6在6磅5分钟,冲洗通道。然后,流加载为10秒(装载通道具有更高的流速,应分别被刷新)6磅8。
  4. 从所有孔中除去水和替换以及8加载与250微升的SC中的入口孔1-6和50μl的在细胞培养从步骤1.2。 (另外,放置在进气口井1-6所需的媒体需要切换不同的条件下进行实验。)
  5. 的ONIX歧管的密封板,并开始启动的频道和培养室在6 psi为至少5分钟,2分钟,然后在6磅的入口以及为起始媒体流从进气口井1-6的实验。流不断,直到1.7步。
  6. 准备显微镜进行实验。我们使用的蔡司Axio Observer.Z1广角镜与级联二背照式EMCCD相机(配光,图森,亚利桑那州)和200流明金属卤化物弧光灯(在此之前,科学,罗克兰,MA)的荧光激发衰减到10%,以防止漂白。为了尽量减少切换时间需要掌握多个荧光通道,我们夫妇一个单一的,适当的激发/发射滤​​波器CFP,YFP和RFP分色三带通滤波器立方体(色度科技股份有限公司,波纹管瀑布,VT 89006集)设置外部,快速切换滤光片轮(的电子产品Ludl,诺瓦托,CA)。
  7. 将几滴浸入流体的目标(如果需要的话,我们使用了蔡司计划复消色差63X/1.40油DIC),安全的微流体装置安装在倒置显微镜的阶段。确保板不移位,在所有的阶段在整个实验过程中提高细胞跟踪数据分析。我们只是贴板安装阶段,以防止其转移。
  8. 使用嵌入的位置,集中于第一培养室(室高度为最小)的最左边的第三重刑标记。关闭流从媒体入口,并从细胞流以及加载8 6磅5秒阵阵。移动舞台,看看周围的细胞培养室。加载流时间和压力,直到达到所需的细胞密度增加,但避免超载和堵塞最左边的屏障新鲜媒体进入燃烧室。
  9. 开始流从媒体入口,以及包含该媒体在6 psi。
  10. 的MetaMorph(Molecular Devices公司,桑尼维尔,CA)或其他显微镜自动化和控制软件,设置一个多维收购多级职位,随着时间的推移,采取多张图像。设置的数量和时间点之间的时间间隔。选择多个〜10个细胞的阶段职位(更将迅速过度拥挤)。我们通常使用5分钟的时间间隔和图像,多达16个位置,每个需要收购在每个时间点〜11秒。
  11. 设置在每一个阶段的位置,使在每个时间点次采集E程序会:集中的传输光线明亮的场(BF)图像使用的MetaMorph的内置自动对焦方法(实现自动对焦作为一个自定义编写的日记在每个阶段的位置开始提供更大的控制对焦精度);获得的BF图像+1微米到焦平面(FP);收购BF重点图像(BFOOF)的FP(使用自定义编写的期刊图像之间需要改变焦点)-4微米,并获得一个灰度每个荧光记者在FP使用快速收购以最小的漂白优化设置的图像。
  12. 如果有必要,获得无细胞的培养室的区域中为每个荧光报道的背景和阴影校正图像。
  13. 准备流程序,的实验在ONIX控制软件。同时开始收购计划的MetaMorph和流量的的ONIX控制软件程序。
  14. 在实验结束时,纠正未甚至背景和阴影中的荧光图像(如果需要),并为每个图像通道的任意结合。tif文件在每个阶段的位置。STK电影文件( 例如,创建BF,BFOOF,CFP,YFP和RFP电影的位置1 )。

2。格式和分类数据跟踪FormatData在MATLAB中的图形用户界面(图2)

  1. 运行FormatData.m的文件在MATLAB中打开数据输入GUI。在顶部,指定或浏览包含图像文件的设置数据目录的文件夹,然后使用GUI来指定在实验中记录的数据类型和图像文件。
  2. 要右键,选择“时间推移”,表示要进行分析类型旁边的单选按钮。 “时间推移”,治疗的时间序列( 细胞生长在一个微腔)的电影形象系列。 “静态”将会把每一个形象系列作为一套从人口( 多个图像采取不同的快照ferent的位置在一个幻灯片样本)。这个移植版本,时间推移多个位置的数据可以被处理,但每个位置作为一个单独的文件(参见步骤2.14)。
  3. 检查框进行图像配准纠正不精确的舞台动作电影中的每个图像转移的框架内,以尽量减少明显的细胞运动。我们强烈建议,因为它极大地提高了跟踪(减少人工跟踪策展后),但会增加随机的,“白噪音”的像素值来填充图像已在边境转移。它也可以选择观看分段BF图像后,在步骤2.7中,或在任何点,直到步骤2.13。
  4. 检查“明场”对话框中的“数据通道”面板。单击“选择”的权利BF图像加载。 *。TIF文件,选择对应到一个单一的电影通过按住Shift键的同时选择所有BF图像,然后单击“打开”。 * STK文件,只需选择感兴趣BF一叠。如果图像是成功充分认可,将文件名,在弹出的菜单中列出,在“识别的数据”面板的右侧。 *。TIF文件,确保文件名出现在正确的顺序(保存文件顺序采集过程中的名称 - BF_t001等)。
  5. 检查“光明球场(焦点)”框,然后使用“选择”按钮,在步骤2.4加载BFOOF的文件,在弹出的右侧将列出。 (BFOOF获得BF -4微米相对的FP以及63X分部。)
  6. 查看“细胞面膜”框中。在“屏蔽源”面板中,选择“”分部BF“旁边的单选按钮。按下“参数”按钮,打开分割的图形用户界面。 (或者,选择一个预先分割遮罩影片通过选择“选择模板文件”按钮旁边的单选按钮,按下了后者,并选择步骤2.4的电影。在这种情况下,是没有必要的一个BFOOF的电影,可以跳到步骤2.8)。
  7. 设置不同的分割参数(每个描述可以查看通过按下“参数说明”),点击“测试”( 图3)测试的分割质量。成功地将分割区域绿色,洋红边界。请务必使用滑块来检查在电影中的多个时间点。当分割是令人满意的,选择“完成”返回分割参数FormatData GUI。
  8. 选中“彩色图像”框。第一荧光图像通道在文本编辑框中输入颜色名称,然后按下“添加和选择”加载彩色文件步骤2.4。色名称将被添加到左边的列表框中,将被添加到文件名右表。如果出现错误加载彩色文件,在左边的列表框中选择颜色名称,并单击“删除颜色”删除文件。重复为每个颜色通道。
  9. 如果额外的子区域掩模的基础上的荧光色( 例如荧光标记的细胞核→原子核耳旁区域面罩)的需要,选中“颜色面具”框中。如果不是,请跳到步骤2.12。在“颜色屏蔽源”面板中,进入次区域面具在文本编辑框中的名称。从弹出菜单中选择一种颜色,“颜色屏蔽源”面板(需要的颜色已被添加在步骤6)和推动打开一个阈值测试GUI的“参数”。
  10. 按下“自动阈值”按钮来自动确定阈值,使用大津市的方法15,该图像将突出区域的阈值以上( 图4)保藏。阈值可以使用编辑框中手动调整。使用滚动条来确认所有时间点的门槛是合适的。满意时,按下“完成”返回门槛FormatData GUI。
  11. 推“添加分类”,使用门槛模块应用到选定的彩色图像生成子区域的面具。的彩色掩码的名称和源将被显示在表的左侧,与相关的recognized出现在右边表中的文件名。 (或者,按下“添加并选择”载入预先制作的次区域口罩文件。)
  12. 在底部,指定或浏览到所需的文件夹被用作保存目录。
  13. 按“格式数据读取的图像文件(由Francois Nedelec的开发使用的tiffread2.m代码,可在: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ),处理数据,并创建一个* mat文件在指定的文件夹中。该文件将作为输入的ProcessTimeSeries GUI。
  14. 重复步骤2.4-2.13每个阶段的位置的一组的电影。

3。追踪细胞和宗族通过时间与ProcessTimeSeries GUI和牧师ID和宗族分配(图5)

  1. 运行ProcessTimeSeries.m的文件在MATLAB打开跟踪的图形用户界面。开场后,设置以下参数GUI:
    • “商会的高度”(“文件I / O面板,左上角) - 这表明细胞室中被困的高度。它是用来作为一个约束近似作为三维椭圆体的长轴和短轴的基础上的单元区域中8细胞体积。
    • “微米/像素”(“文件I / O”面板) -转换因子的校准像素微米的距离的横截面的面积和体积,因此可以计算微米2微米3,分别在影像中。
    • “过滤器”面板“(下面的”文件I / O面板) - 设定的最小和最大参数过滤掉垃圾地区在面具:“区域” - 以像素为单位的区域面积;“ECC” - 偏心因子,更圆→0 “SF” - 的形状因子,圆形→1。
  2. 点击“载入图像”中的“文件I / O面板,并选择*。垫FormatData GUI的利益输出的数据文件。的区域的掩模(以及所有子区域的掩模)被施加到每个颜色通道,以及一些不同的测量( 表1)。数据文件,然后保存。 (如果加载文件成ProcessTimeSeries从前一交易日,它会问如果分析从一开始就应该重新启动。注意:这会清除所有跟踪的策展已经完成和治疗的数据,就好像它是新鲜的FormatData GUI。意外重启,迅速按Ctrl + C,在MATLAB命令窗口,以防止被覆盖先前策划*。mat文件)。
  3. 接着,跟踪细胞。在“轨道细胞”面板(“过滤器”面板旁),设置以下参数:
    • “最大位移” - 像素细胞可以被标记为不同的单元格之前的相邻图像之间旅行的最大距离。更高的排量意味着该算法可以考虑将更多的细胞,但它也增加了复杂性在人群中匹配的细胞区域。首先,我们在12和减少,如果发生错误,跟踪(见第3步.4)。
    • “最小长度” - 最低数量的细胞跟踪的出现被认为是一个有效的数据系列。我们用1来防止任何真正的痕迹去除,但是这可以增加,如果分割结果昙花一现,杂散区域的痕迹。
    • “帧存储器” - 连续帧的最大数量的细胞区域可以消失,当它返回时,被赋予相同的ID。如果它消失长于“帧存储器”,它会被给予一个新的ID后返回。我们使用2允许返回前2帧分割区域不容错过。
  4. 点击“跟踪单元格格式”跟踪区域,从一帧到下一区域的重心(布莱尔和克罗克的杜弗兰MATLAB实现,格里尔和周IDL常规,提供: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ )分配谱系新出现的芽,并保存数据。宗族自动分配分钟在每一帧imizing假定芽和潜在的母亲之间的距离。 (如果有错误出现在MATLAB命令窗口,由于“困难的组合数学”,降低“最大排量”,并重复跟踪)。更改参数,为您的数据需要在弹出的窗口。
  5. 牧师分段不佳的地区和错误的ID或沿袭分配使用各种GUI工具或快捷键(按上面的按钮“选择小区信息”面板,在弹出窗口中显示)。
    • 滑块,“上一张图片”,“下一张图像”(按Ctrl +左/右) - 用于显示和移动帧之间的图像系列。
    • “图片号码” - 的显示的左,右轴中的当前图像的帧号。 #“编辑框中输入其在右边的”图片移动到指定的帧。
    • “三角洲框架” - 显示左,右轴(Δ=右 - 左)车架号码之间的差异。
    • “隐藏文字”(Ctrl + T键) - 显示小区ID之间切换右轴与否。
    • “隐藏标签”(Ctrl + L键) - 显示在左边的轴或小区ID之间切换。
    • “面具”弹出菜单 - 选择显示没有口罩,细胞面膜,或任何用户定义的显示在左侧面板中的子口罩。
    • “叠加”弹出菜单(CTRL +1-9) - 选择要显示在左框架中的BF和彩色层。显示BF是唯一一个高炉层切换或关闭在两个轴上。之间切换显示或不选择覆盖在菜单的名称(“*”表示显示叠加)。按Ctrl +1切换BF叠加,与2-9切换颜色叠加。
    • “设置颜色” - 用它来确定颜色叠加显示。一个弹出窗口将查询设置荧光频道,然后会出现用户定义调色板。
    • “修改地区和轨道”面板 - 这些细胞区域遮罩和跟踪信息控制有明显的变化:
      • “更新曲目”(CTRL + U) - 使用重新分配小区ID。如果没有选择单元格右侧轴,GUI会提示小区ID更改。当ID X的改变为Y,X的所有未来实例将被改变为Y,和当前Y的任何将来的实例,将被切换到X(有时候一个小区,将切换之间来回2的ID,重复这是由于跟踪试图容纳多个ID更新ID功能,而不是一个错误的oversegmented地区)多细胞可以选择,同时改变其ID,但一定要给每一个唯一的ID。要指定一个区域在当前文件中不存在的ID,输入“0”,一个将被生成的。使用Ctrl + W来交换两个突出的细胞的ID。
      • “删除选定的曲目”(CTRL + D) - 右轴架在当前删除选定的单元格或多个单元区域。 (如果没有细胞被选中时,会提示ID)要永久删除所有实例的ID跟踪,检查框旁边的德勒特选定的曲目按钮(文字更改为“全部删除”)。摆脱持久垃圾区域,这是非常有用的,但未来帧先检查,以确保不切换到一个有效的电池或芽区域的ID。
      • “合并区”(Ctrl + A键或M) - 平滑,并结合细胞区域。单击一个或多个单元格在右边的轴选择(如果选中区域将变成红色)。合并的一个区域上的形态附近的填写使用的盘形元件的裂缝或小的缺失数据块。合并两个或两个以上的邻近地区,将它们合并成一个区域ID最低的新区域。这是非常有用的过度分割区域(通常当细胞有大空泡)。
      • “绘制区域” - 用鼠标画出一个区域,在右边的轴在需要的地方,并双击来完成。提供一个唯一的ID中不存在的数据集(1到65535之间)。取消按键盘上的删除。
    • “天堂”面板跟踪 - 跟踪后,自动生成血统分配。当出现新的ID区域,新的小区ID出现在粉红色和母亲的区域绘制一条红线。新的区域太大,芽或距离太远潜在母亲显示为绿色,被分配了一个“南”(“不是一个数字”, 见表2)母亲的ID。上面的第一时间点存在的区域有一个母亲的ID为“0”。要解决个别的任务,进入母亲和芽在文本编辑框的ID,然后点击“修复”。要删除一个单元格的母亲,输入“0”作为它的母亲。更快的方法是选择这两个地区在对图像进行按Ctrl + F这将自动分配旧的区域作为母亲和女儿的新区域,同时删除以前存在的任何母亲分配的子细胞。注意:单击“计算宗族”在任何时间将重新计算所有的血统任务,包括那些用户已经预先策划。
    • “所选单元格信息”面板 - “我数据资源系统“将显示区域中选择合适的轴的一些测量。”测量“允许用户以确定测量值显示(以及其他操作,例如”导出数据“中定义的默认列表),可用于以确定正确的ID和谱系( 例如,如果单元X在时间t的花蕾,它最有可能不会有另一个芽在时间t + 5分钟)。
    • “保存更改”(按Ctrl + S) - *。mat文件更新以反映用户的变化。经常使用(有没有撤消功能)!
    • “生成图” - 的打开GeneratePlots GUI。用于快速绘制选择变量信息和简单的计算,强调在正确的,他们的平均ProcessTimeSeries GUI或各地区的平均值在每帧轴的单细胞地区。这个GUI可以先粗略计算的衍生工具,但一定要指定正确的时间间隔,在左上角。情节可能会输出一个数字按“生成图”保存。
    • 要正确牧师数据:合并任何oversegmented的区域;删除整个小区没有捕捉到任何地区;是确保母芽正确分配关系(它们之间出现一条红线,在现蕾时间,当芽ID是粉红色的,请参阅表2),并消除任何绿色的ID固定的ID,分配给该地区的母亲,没有母亲(“0”),分配或删除区域。芽数据将被添加在最后的分析中,这样的母亲不合并其母亲(这将导致不准确的量估计)一芽区域。
    • 目视检查数据,为每个帧的最后一个感兴趣的时间段,但它不是必需的,如果不使用整个时间序列购买帧。
    • 一定要保存更改。
    • 重复步骤3.1-3.7 *。mat文件中每个阶段的位置。

4。导出的数据分析

  1. 只是出口原材料的地区测量每个单元通过添E,推“导出数据”。在打开的图形用户界面,可以选择感兴趣的测量,他们会以空格分隔输出*。txt文件与列标题的变量名。
  2. 随着时间的推移整个细胞的时间序列分析,计算细胞周期的信息,并采取衍生物,推“时间序列分析”。将打开一个窗口,允许选择的兴趣和输入分析参数测量( 图6)。
  3. 输入策划的最后一个时间点,在GUI(所有后续的帧将被忽略)。默认情况下,平滑处理和细胞周期分配参数单倍体和二倍体菌株在5分钟的间隔成像很好的工作,但这些可能需要被改变以获得最佳效果。 (检查的参数值是适当的萌芽和分裂时间通过手动确定一个测试数据集,并自动算法的性能比较。)
  4. 当所有的参数设置,按“分析”:
    1. 缺点truct阵列的每个原始测量减去背景(测量作为非细胞荧光电影的第一帧中的每一个区域的平均强度,或可以被指定为占每个单元像素的平均自发荧光)。
    2. 安装平滑样条选定的测量,以消除高频测量噪声(9)讨论。
    3. 自动确定现蕾9卷时间序列的斜率变化的基础上为每个细胞和细胞分裂的时间。芽测量将被添加到母亲的出现和分裂每个周期之间的一个连续的整体细胞的时间序列测量。归一化的细胞周期进程也将被计算范围从0到2师师。
    4. 适合平滑曲线稳定的第一第二衍生物选定的测量。 (如果在明确定义的衍生物,时间序列的目的是由连续的除以变速为下列细胞周期的数据,以满足前一个周期的终结点。)
    5. 输出原料和平滑时间序列的所有地区,全细胞平滑,连续的,差异化的时间序列作为一个数组每个测量。第一个元素是背景相减的颜色指数为,在第一行的其余部分持有小区ID,第一列中的其余部分的帧号,和其余的元素保持在一列中,每行的每个单电池的时间序列。对应于在第一列中的帧。一系列类似的细胞周期的时间序列和谱系信息也将被输出。阵列“LineageArray较母芽的关系和第一至第五列,每行包含一个表,母亲ID,芽ID,帧的第一花苞区,估计出芽帧,和估计的时分帧。数据导出到一个*。mat文件(MATLAB数据文件)。

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Representative Results

成功完成和分析的实验将产生大多是连续的时间序列与实际分配的芽和分裂次数的单全细胞。作为一个例子,我们履行上述协议ADH1启动子组成,观察增长和全球表现可能会有所不同随着时间的推移在单细胞( 表4,Y47带动表达天蓝荧光蛋白(CFP)的整合拷贝单倍体酵母菌株)。我们跑了时间序列分析,获得整个细胞( 图7A)测量随着时间的推移,9音量及表情都发现一个依赖于细胞周期出现。花蕾形成后,合并总体积(母亲+芽)增加速度比现蕾前(8,16),而蛋白质的浓度,或平均强度略有下降( 图7B和7C)。联合集成的崛起TED蛋白质(在这种情况下,数量×浓度)后,也加速萌芽( 图7D)。母亲的区域( 图7B&D)相比,这些结果表明适当地把芽整个小区测量的贡献,并强调需要适当的花芽形成和分裂时间分配的重要性。正如我们已经报道9日 ,我们就可以使用差异化的时间序列计算瞬时相对mRNA水平为m(t)和转录率A(T),这也增加出芽后( 图7E和7F):

公式1
其中,P(t)是在时间tγ 中号的总蛋白是0.04分钟-1的mRNA的降解率

产生稳定的时间导数的测量时间序列的能力,也有利于动力学研究。我们使用的酵母菌株表达观察到的,空想切换转录活性的转录因子( 表4,Y962)。磷饥饿的途径,Pho4p,主转录因子控制响应通过核质本地化的外磷酸concentratio的N 18。取代的DNA结合结构域的Pho4p与TETR,其中结合的四环素操纵子(TETO),和C末端融合的新的转录因子,黄色荧光蛋白创建PHO4 TETR的-YFP 9。通过灌注媒体切换磷酸盐水平,我们可以切换7 TETO结合网站组成的一种人工合成的启动子驱动的集成CFP表达第二CYC1最小的子(7xtetOpr-CFP)。的时间序列的分析表明,当定位到细胞核(在步骤2.9-10创建一个基于RFP-核子网掩码的RFP和核蛋白质Nhp2p的融合),以及靶基因的转录启动和停止时,转录因子( 图8)。通过分析衍生系列随着时间的推移,在各单体电池的目标启动子的激活和失活时间可以推断出,即使在高浓度的稳定的荧光报道。

图1
图1。示意图协议。协议描述的步骤1)微文化,2)荧光,时间推移显微镜,3)数据分析,

图2
图2。 FormatData GUI接口是用来导入,格式和段图像数据后计算和视觉检查。数字表示每个组件对应的协议步骤点击这里查看大图

图3
图3。 SegTest GUI接口是用来测试细胞分类振动性参数和视觉上确认在步骤2.7中,分割精度。

图4
图4。图形用户界面。ColorThreshTest接口是用来测试需要,以建立亚细胞掩模,在步骤2.10中,从所选择的荧光信道的强度阈值。

图5
图5。 GUI ProcessTimeSeries。使用该接口来衡量,跟踪,目视检查和编辑的单元区域和宗族分配。数字表示每个组件对应的协议的步骤。目标=“_blank”>点击这里查看大图。

图6
图6。 AnalysisParams GUI。此接口用于输入参数所需的时间序列分析在步骤4.3和4.4。

图7
图7。 ADH1 PR-CFP微文化表达了几代人的单倍体酵母单细胞的时间序列(A)明场(上排)和CFP(下排)显微照片显示在指定的时间点为一个单元,在整个实验。对于分段的母细胞(蓝色outliNE)和芽(绿色的轮廓),连续的全细胞中概述了红色。生的母亲和芽量(B)(C)蛋白浓度的时间序列进行平滑,以消除测量噪声,及(D)集成CFP荧光产品的体积和浓度计算。整个细胞(红色)跟踪延伸过去的部门保持运行总计,很容易以适应一个跨部门的微平滑样条(B和D)。 (E)的相对mRNA水平和(F)的瞬时转录率的计算使用公式(1-2)和(D)中的样条拟合。

图8
图8。启动子的转录率应对核质穿梭的PHO4-YFP的融合在单个酵母细胞(A)指示从四个采集通道的显微照片所示为一个可切换的YFP的稠合的PHO4 TETR的反式激活的细胞(B)定位的RFP-标记的细胞核响应(D)低磷酸盐和(C)驱动器表达的7xtetOpr CFP记者。推断转录率平均本地化(黑线),并在单细胞水平的变化(红色和紫红色线,其中红色代表连续单元区域中的红色A)。急剧下降CFP表达在B细胞分裂时,配合一些蛋白质丢失的女儿细胞。

测量名称 描述
时间图像帧号
区域总数包括该地区的f像素
(4/3)πabc=半长轴长度的区域,=半短轴长度, c = b的或½“室高度”(两者中的较小值)
(X)(Y)的意思平均像素强度区域屏蔽颜色通道(Y)(X),
(X)_(Y)中位数平均像素强度区域面具颜色通道(Y)(X)
(X)(Y)STD 标准偏差像素强度区域遮罩颜色通道(Y)(X),
(X)_(Y)IQR 四分位数间距像素强度区域遮罩颜色通道(X),75 百分点- 25 百分位值(Y)
(X)_(Y)T20pct 区域屏蔽颜色通道(X)(Y)的像素强度最高的20%的平均强度。使用有用比较,与下一个测量,以确定没有子网掩码的亚细胞定位。
(X)_(Y)B80pct 底部80%的区域的掩模的颜色通道(X)(Y)的像素强度的平均强度。有用比较,与以前的测量,以确定没有子网掩码的亚细胞定位。
(X)_(Y)M50pct 平均强度为中间的50%的像素强度区域屏蔽颜色通道(Y)(X)
(X)_cellint 集成荧光的颜色通道(X)(平均像素强度X宗卷),整个小区(母亲和任何连接的芽)
(Z)的原料。 “时间序列分析”原始时间序列数据的输出变量(Z)
(Z)平滑样条平滑的原始时间序列数据“时间序列分析”的输出变量(Z)
(Z)全所有细胞(M其他+附件花蕾(Z)Rawsmooth)时间序列数据输出变量“时间序列分析”(Z)
(Z)续全细胞的时间序列数据连续师(“运行总计”)输出“时间序列分析”的变量(Z)
(Z)WhSmooth。 样条平滑(Z)全细胞的时间序列数据输出变量“时间序列分析”(Z)
(Z)滴滴涕第一次衍生样条平滑(Z)全细胞的时间序列数据输出变量“时间序列分析”(Z)
(Z)d2dt2。 第二次衍生样条平滑(Z)全细胞的时间序列数据输出变量“时间序列分析”(Z)

表1中。测量可变命名在ProcessTimeSeries GUI。

小区ID颜色 传承状态
黄色母亲分配
粉红色新芽(红线绘制到指定的母亲)
绿色没有母亲分配

表2中。小区ID颜色代码血统分配状态。

文件名 描述
FormatData.m 数据输入格式的图形用户界面,电影和BF段图像处理ProcessTimeSeries.m
FormatData.fig FormatData GUI窗口布局
BFsegment.m BF分割模块,与extractregions2.m segmentregions.m
SegTest.m 分割质量检测界面
SegTest.fig GUI窗口SegTest的布局
extractregions2.m 第一部分BF分割模块识别区域
segmentregions.m 高炉分割模块到单独和清洁单元区域的第二个组成部分
color2submask.m 基于荧光子网掩码分割模块
ColorThreshTest.m 基于荧光阈值模板测​​试GUI
ColorThreshTest.fig GUI窗口ColorThreshTest的布局
tiffread2.m 提取数据*。TIF或*。STK文件用于在MATLAB
imalign.m 使用二维互相关的图像配准
ProcessTimeSeries.m 数据处理GUI,跟踪区域,分配谱系,使视觉改正错误。还提供了基于GUI绘图能力和​​输出全细胞的时间序列数据
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUI窗口布局
cleanMask.m 消除参数的基础上屏蔽区域在ProcessTimeSeries GUI
track.m 跟踪单元区域根据区域的重心
OptimizeLineages.m 天堂分配模块确定最佳母芽关系的基础上的物理距离和过去和未来的萌芽事件
getClosestObjects.m 查找相邻小区为每个新小区ID(BUD)
SelectVariables.m 选择感兴趣的变量的测量选择GUI
SelectVariables.fig SelectVariables GUI窗口布局
GeneratePlots.m 数据在ProcessTimeSeries窗口中绘制图形用户界面
GeneratePlots.fig GeneratePlots GUI窗口布局
AnalyzeCellSeries.m 时间序列分析模块确定细胞分裂时间,并输出全细胞测量,如在文本中描述
assignDivisionsInf2.m 分配芽萌动和细胞分裂的次数
AnalysisParams.m 电池时间序列分析参数输入
AnalysisParams.fig AnalysisParams GUI窗口布局

表3中。移植文件说明。

应变ID 基因型(W303) 参考
Y47 LEU2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: KanR表:: hisG 19
Y962 MAT 一个 ADE + NHP2 :: RFP-NATspl2Δ的:: LEU2 PHO4 :: TRP1pho84Δ::klura3 phm4 :: HIS3MX6leu2Δ:: TEF1m7prPHO4ΔP2TETR的cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9

表4中。本研究中使用的酵母菌株。

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Discussion

上述协议描述了一个简单的方法来获取和分析经验有限,在微流或在软件开发的的荧光时间序列数据。它允许一个取得时移荧光电影单个酵母细胞中提取相关的细胞大小和表达测量;牧师跟踪和血统分配和整个细胞的行为进行分析,随着时间的推移,使用市售的微流体培养装置和一个多功能的图形用户界面(GUI)。实验,分割和跟踪步骤已经以各种方式以前11,13,14接近,上面的程序的目的是使这些技术更容易获得更广泛的子集的生物群落。虽然在上述操作的优化为特定的微流体培养装置,可以适应类似的,现成的微流体培养技术变得更便宜和更可定制的装置的总体分析。 Fundamentally,分割和地区测量算法,我们采用类似于现有方法13,14,,但移植软件将能够以可视化的牧师地区跟踪和血统分配的,并指派细胞周期各阶段准确。这两项功能是至关重要的,准确地计算时间的数据系列的衍生。

在协议中,有几个步骤,从而显着影响所得到的时间序列数据的质量。最初超载与细胞培养室,将减少灌注室(尤其明显,在动力学实验室刷新时间是很重要的),和增生在实验的时间当然会更早。这可以最有效地避免与下部单元的加载压力为更短的时间,并开始逐渐增加的一个或两个,直到一个合适的细胞密度来实现。成像舞台位置的选择是相关的,同样重要的consid忧思。了解应变计划倍增时间多少细胞图像帧中随着时间的推移,预计拥挤会影响媒体的扩散。 10个分散的细胞,将成长为10个菌落,但会成长为一个单一的,大型的殖民地(我们已注意到养分扩散限制在6 psi时,它是一个殖民地的中心〜14个细胞的直径大于10细胞的最初组合在一起) 。在上游的协议步骤的额外的努力也有利于手动数据策展后,提高了输出的时间序列。确保板牢固地安装在舞台和FormatData GUI选项中使用的图像配准精度大大提高,在自动跟踪单细胞,通过时间。花时间在选择的最可能的分割参数也减少错误警告的数目。跟踪软件工程最轻微oversegmentation细胞区域,而不是undersegmentation,因为remerging一个拆分单元是一个简单的任务比画线划分区域,但是,增加oversegmentation增加谱系分配错误,由于假的,新的区域的存在。此外,要确保所有的母芽的关系是正确的分配,所以整个小区的测量将是准确的。如果错过一芽分割或增长对图像的边界之外,考虑结束母亲的数据系列,以防止虚假的结果。这很容易通过改变母亲区域上面的错误帧的一个唯一的ID(输入为“0”的ID),并使用“删除全部”功能来删除新的ID的所有未来实例。密切关注这些步骤将大大增加原始时间序列数据的准确性。

要建立有效的解释,按“时间序列分析”的数据输出,我们推荐一些额外的查询。验证现蕾和分裂时间准确地确定用户INPU-t参数。测试影片集手动记录的萌芽和分裂时间和算法的结果进行比较。为了在视觉上估计的时间的胞质完成一个母亲和女儿之间,看起来边界狭窄,变暗。 (注:测试应变分工人工观测与荧光标记的细胞核辅助。另一种方法是将荧光标记质膜看看母亲和女儿的细胞之间的间隙关闭。)此外,检查是否为单元格的总荧光更好的计算区域的平均强度乘以体积(源于细胞的薄的横截面时,捕获的光),或超过该区域的集成荧光(时,捕获的光来源于整个细胞)。如果荧光跨细胞的档案相匹配的曲线的半椭圆的长轴和短轴的区域7所描述的,捕获的光从整个细胞的起源,和总荧光笑ULD计算(平均强度)×(区)。在我们的情况下63X字段的深度远小于单元格的高度,荧光的配置文件是相对平坦的,并且被计算为总荧光(平均强度)×(体积)。另一个考虑是光漂白的荧光基团。该软件不考虑光在分析和的荧光时间序列输出只占观察记者。漂白过程在很大程度上依赖于采集设置和使用的时间间隔取得的荧光图像的荧光基团的性质,以及其他各种特定实验参数。漂白,也可能不能很好地说明了一个简单的,一阶速率表达式,防止其治疗一般算法。因此,我们不占漂白时间序列中的输出,但是可以被用来测量在此过程中的动力学分析方法,以帮助用户解释。最后,选择smoothi​​“纳克适合观测到的时间序列的参数。理想的情况下,平滑样条曲线将消除高频测量噪声,同时保持数据的真实面目。所需的参数来实现,这取决于特定的时间序列的特征,实验之间可能会发生变化。

该软件是在不同的时间推移的荧光显微镜数据的分析,意在灵活。可以包括任意数量的颜色通道,和任何可用于创建一个子区域的掩模。虽然算法芽殖酵母细胞的电影,很多的功能应该延伸到其他生物的电影。地区(除外量)的测量,跟踪,以及策划,只依赖于细胞面具,因此适应性。分割,宗族分配,细胞分裂的决心,和时间序列分析模块可以独立修改,以满足特定需求。此外,而不是使用包括本身预先分割遮罩影片gmentation模块,可以是输入,明场和相衬或微分干涉对比的图片可被取代的。然后,可以使用图形用户界面可以主要,,跟踪鉴定和ID和血统分配。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益。

Acknowledgements

我们感谢刘慧卿杰克逊,约书亚蔡德曼,和尼古拉斯·雷恩对软件的意见。这项工作是由GM95733(NM),BBBE 103316和麻省理工学院的启动资金(NM)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

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References

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