Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Biology

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Summary

Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.

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Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

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Abstract

Microscopia de lapso de tempo de fluorescência tornou-se uma ferramenta poderosa no estudo de muitos processos biológicos ao nível de uma única célula. Em particular, os filmes que descrevem a dependência temporal da expressão gênica fornecer insights sobre a dinâmica de sua regulamentação, no entanto, existem muitos desafios técnicos para a obtenção e análise de filmes de fluorescência de células individuais. Descrevemos aqui um protocolo simples, usando um dispositivo de cultura microfluídicos disponível comercialmente para gerar esses dados e uma interface baseada em MATLAB gráfica do usuário (GUI) baseada em software para quantificar as imagens de fluorescência. Os segmentos de software e células pistas, permite ao usuário curadoria visualmente erros nos dados e automaticamente atribui linhagem e os tempos de divisão. A GUI analisa a série mais tempo para produzir vestígios de células inteiras, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo. Enquanto o software foi concebido para S. cerevisiae, a sua modularidade e versatilidade deve permitir que ele tó servir como uma plataforma para o estudo de outros tipos de células, com poucas modificações.

Introduction

Análise de uma única célula da expressão gênica tem promovido a nossa compreensão de muitos aspectos da regulação gênica. Instantâneos estáticos de expressão repórter fluorescente utilizando citometria de fluxo ou microscopia de fornecer informações úteis sobre a distribuição de expressão de uma única célula, mas falta a história ea evolução dos dados de séries temporais obrigados a informar diretamente a dinâmica de expressão gênica. Microscopia de lapso de tempo de fluorescência apresenta um meio para obter ambas as medições de uma única célula e sua história. As várias técnicas experimentais e analíticas foram desenvolvidos para a obtenção de filmes e quantificar a expressão de repórter fluorescente, comunicando assim insights características de regulação de genes (ver 1 para uma revisão), tais como variação de célula para célula de 2,3, a formação bacteriana persistidor 4, transcrição iniciação e alongamento 5, transcricional estourando 6,7, a dependência do ciclo celular 8,9 e herdabilidade 10. Contudo, obtaining qualidade séries cronológicas de fluorescência de uma única célula envolve desafios técnicos significativos, em cultura de uma monocamada de células em um ambiente controlado e quantificação de elevada capacidade de os filmes de fluorescência adquiridos. Aqui, descrevemos um procedimento para obter e analisar filmes de fluorescência de S. cerevisiae sem experiência requerida na fabricação do dispositivo de cultura de células ou no desenvolvimento de software (Figura 1).

Primeiro, vamos detalhar um protocolo de exemplo para gerar filmes de séries temporais de fluorescência para a levedura de brotamento expressar um ou mais repórteres fluorescentes. Embora câmaras cultura microfluídicos personalizados foram construídas e empregada com sucesso anteriormente 11-13, usamos um dispositivo micro disponível comercialmente a partir de CellAsic (Hayward, CA). As células do sistema limita-se a crescimento em monocamada e permite o controle permanente do meio ambiente de perfusão. O protocolo de microscopia que apresentamos é uma forma simples de se obter fluoresfilmes cia de levedura de brotamento, mas qualquer protocolo modificado experimental (um dispositivo de cultura personalizada, condições de mídias alternativas, etc.) produzindo dados do filme de fluorescência semelhantes de células de levedura único pode ser substituído.

A seguir, destacamos a análise dos filmes com uma interface gráfica de usuário (GUI) baseada em software em MATLAB (Mathworks, Natick, MA), apelidado de GUI para rápida análise de séries temporais de fluorescência (ENXERTOS), para extrair dados de séries temporais para células individuais. ENXERTOS tem características semelhantes ao versátil, open-source software pacote Cell-ID 14 na segmentação e rastreamento de células e na extração de intensidade de fluorescência e de informação geométrica. No entanto, os enxertos fornece recursos adicionais importantes. Primeiro, ela oferece edição interativa fácil de segmentação e acompanhamento dos resultados a fim de verificar a exatidão dos dados, ao invés de apenas gating estatística de traços região outlier após análise. Além disso, estende-se a análise para automatically designado linhagem e pontos de interesse da levedura de brotamento do ciclo celular. Determinar quando mãe e filha dividem para formar duas regiões de células independentes é crucial para determinar células inteiras (mãe incluindo qualquer broto conectado) medições ao longo do ciclo celular 8. A suite é composta por três módulos para realizar essas tarefas. As primeiras regiões celulares segmentos baseados no contraste entre as imagens de campo claro foco e fora de foco, e permite ao usuário definir e testar visualmente parâmetros de segmentação. O segundo faixas (. Usando Blair e implementação de Dufresne MATLAB do Crocker et al rotina IDL, disponível em: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) e medidas de regiões celulares através do tempo; atribui automaticamente linhagens, e permite a inspeção visual e correção de erros. A GUI plotagem simples é incluído para propriedades de uma única célula de consulta. O terceiro módulo atribui bud surgimento e divisão times, células inteiras e gera dados de séries de tempo, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo (como discutido em 9). O módulo de análise gera os dados como um arquivo de texto delimitado por espaço para o estudo subsequente no software estatístico de escolha. Assim, o pacote permite ao usuário extrair dados de alta qualidade da série de tempo através de uma interface gráfica. Nós temos utilizado este método para estimar as taxas de transcrição em tempo real em células individuais de levedura de brotamento como uma função do ciclo da célula 9. Embora os módulos foram optimizados para a levedura de brotamento, os parâmetros, ou, se necessário, o código livremente disponíveis podem ser adaptados para outros organismos e tipos de imagem. Segmentação, Seguimento e linhagem algoritmos de atribuição pode ser específica para tipos de imagem atribuída eo organismo em questão. Os algoritmos existentes poderia ser substituído, mas ainda mantêm a interface gráfica que permite inspeção user-friendly visual e correção de erros de segmentação e rastreamento que invariavelmente ocur com qualquer algoritmo.

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Protocol

1. Obter Filmes microscopia de fluorescência de células de levedura simples que crescem em uma Câmara Microfluidic

  1. Inocular 1 ml de meio SC (meio sintético definido, com 2% de glucose e complemento completo de aminoácidos) com células de uma placa recentemente crescente, e incubar a cultura durante a noite ~ 16 horas sobre um tambor de rolo a 30 ° C. Preparar a cultura de tal modo que o último é OD 600nm ~ 0,1 para um crescimento de fase log precoce.
  2. Dilui-se a cultura iniciadora, conforme necessário e crescerem de 1 ml num tubo de ensaio fresco um adicional de 6-8 horas a OD 600 nm = 0,1. Isto proporciona células que crescem em um nutriente rico em estado estacionário, com uma densidade adequada para carregar no dispositivo de microfluidos. (Alternativamente, substitua os passos 1,1-1,2 com o procedimento necessário para preparar as células conforme necessário para o experimento.)
  3. Prepare uma placa de cultura de microfluídica Y04C de CellAsic: remover a solução do transporte; lavar os poços com água estéril, e usando o fluxo do sistema de perfusão ONIXágua através de poços 1-6 em 6 psi por 5 min para liberar os canais. Em seguida, o fluxo do poço de carregamento de 8 a 6 psi durante 10 segundos (o canal de carregamento tem caudais muito mais elevados e devem ser lavados em separado).
  4. Remover a água de todos os poços e substituir com 250 ul SC na entrada poços 1-6 e 50 ul da cultura do passo 1.2 em células carregamento bem 8. (Alternativamente, coloque a mídia desejada nos poços de entrada 1-6 para experimentos que necessitam de troca entre diferentes condições.)
  5. Selar o colector ONIX para a placa, e começam priming dos canais e da câmara de cultura fazendo fluir entre a entrada de 6 poços 1-6 psi durante 2 min seguida por, pelo menos, 5 min a 6 psi a partir apenas da entrada bem que prendem os meios de comunicação a partir de experimento. Fluir isso continuamente até que o passo 1.7.
  6. Prepare o microscópio para o experimento. Nós usamos uma Zeiss Axio Observer.Z1 widefield microscópio com uma câmera II EMCCD retro-iluminado Cascade (Photometrics, Tucson, AZ) e um 200 arco de metal-halide Lumenlâmpada (científica prévia, Rockland, MA) para a excitação de fluorescência atenuada para 10% para evitar a fotodegradação. Para minimizar o tempo necessário para a aquisição de comutação de canais múltiplos fluorescentes, que par um único cubo de filtro de passagem de banda tripla dicróico de excitação / emissão de filtros adequados para PCP, YFP e RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; conjunto 89006) , em conjunto, a comutação rápida rodas de filtros externos (Produtos eletrônicos Ludl, Novato, CA).
  7. Coloque algumas gotas de fluido de imersão no objectivo (se necessário, usamos um microscópio Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 DIC óleo), e montar o dispositivo de microfluidos de forma segura na fase do microscópio invertido. Garantir a placa não muda nada no palco durante todo o experimento melhora o rastreamento de células durante a análise de dados. Nós simplesmente Tape o prato para a montagem de palco para impedir o seu deslocamento.
  8. Concentre-se na terceira da esquerda da primeira câmara de cultura (em que a altura da câmara é menor) com uma posição do embutidomarcadores ção. Desligue o fluxo de entrada de mídia também, e fluxo de célula de carga bem 8 a 6 psi em 5 seg rajadas. Mova o palco para olhar ao redor da câmara de cultura de células. Aumente o tempo de carregamento e pressão de fluxo até a densidade de células desejado seja alcançado, mas evitar sobrecarregar e entupindo a barreira mais à esquerda, onde novas mídias entra na câmara.
  9. Começará a fluir a partir da entrada de meios bem contendo os meios de comunicação a partir de 6 psi.
  10. Em MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ou outro software de automação de microscopia e controle, configurar uma aquisição multi-dimensional para tirar várias imagens em várias posições estágio ao longo do tempo. Defina o número de e intervalo entre os períodos. Selecione várias posições palco com ~ 10 células cada (mais irá sobrecarregar rapidamente). Normalmente usamos intervalos de 5 min e imagem até 16 posições, que exigem cada ~ 11 segundos para que a aquisição em cada momento.
  11. Configurar a aquisição de modo que em cada posição de fase em cada ponto ª vezprograma e vai: foco no campo brilhante luz transmitida (BF) imagem usando de MetaMorph método interno de focagem automática (que aplica o autofocus como um diário personalizado escrito no início de cada posição estágio proporciona maior controle sobre a precisão de foco); adquirir o BF imagem em um mM ao plano focal (fp); adquirir uma BF fora de foco (BFOOF) imagem em mM -4 ao fp (use revistas custom-escritas para mudar o foco, conforme exigido entre as imagens), e adquirir uma em tons de cinza imagem para cada repórter fluorescente no fp usando configurações otimizadas para a aquisição rápida de fotodegradação mínimo.
  12. Se necessário, obter as imagens de fundo e de sombreamento de correcção para cada repórter fluorescente em uma área de câmara de cultura sem células.
  13. Preparar o programa de fluxo para o experimento no software de controle ONIX. Simultaneamente iniciar o programa de aquisição de MetaMorph e o programa de fluxo no software de controlo ONIX.
  14. No fim do experimento, corrigir unmesmo fundo e sombreamento nas imagens fluorescentes (se necessário), e, opcionalmente, combinam as. tif para cada canal de imagem em cada posição de palco para um arquivo de filme. stk (por exemplo, criar BF, BFOOF, CFP, YFP e filmes de RFP para a posição 1 ).

2. Formato e Segmento de dados para rastrear Usando o FormatData GUI em MATLAB (Figura 2)

  1. Execute o arquivo FormatData.m em MATLAB para abrir a interface de entrada de dados. No topo, especificar ou navegue até a pasta que contém os arquivos de imagem para definir o diretório de dados, e então usar a interface gráfica para especificar os tipos de dados e arquivos de imagem gravados no experimento.
  2. À direita, selecione o botão de rádio ao lado de "Time-lapse" para indicar que tipo de análise para executar. "Time-lapse" vai tratar a série de imagens como uma série de tempo (por exemplo, um filme de células que crescem em uma câmara microfluídicos). "Static" vai tratar cada série de imagens como um conjunto de fotografias tiradas a partir de uma população (por exemplo, várias imagens tomadas em difdiferentes posições em uma única amostra de slides). Nesta versão enxertos dados de lapso de tempo para várias posições podem ser trabalhadas, mas como um arquivo separado para cada posição (veja o passo 2.14).
  3. Marque a caixa para registro de imagens para corrigir os movimentos de palco imprecisas, deslocando cada imagem nos filmes para minimizar o movimento aparente de células dentro do quadro. Recomendamos fortemente que isso, pois melhora de rastreamento (reduzindo o manual curadoria pista mais tarde), mas irá adicionar aleatórios, "ruído branco" valores de pixel para preencher onde as imagens foram transferidas na fronteira. Também poderia ser selecionado depois de visualização de imagens BF segmentadas no passo 2.7 ou em qualquer ponto até que o passo 2.13.
  4. Marque a caixa "brilhante Field" no painel "Data Channels". Clique em "Select" para a direita para carregar as imagens BF. Para *. TIF, selecione todas as imagens BF correspondentes a um único filme segurando a tecla Shift enquanto seleciona e clique em "Abrir". Para *. STK arquivos, basta selecionar a pilha BF de interesse. Se as imagens são sucessoplenamente reconhecidos, os nomes de arquivos serão listados no menu pop-up à direita no "dados reconhecidos" painel. Para *. TIF, certifique-se os nomes de arquivo aparecem na ordem correta (salvar arquivos com nomes sequenciais durante a aquisição - BF_t001, etc.)
  5. Marque a opção "Campo Bright (fora de foco)" caixa e use o botão "Select" como no passo 2.4 para carregar os arquivos BFOOF, que serão listados no pop-up para a direita. (BFOOF obtido como BF -4 mM em relação ao fp em 63X segmentos assim.)
  6. Marque a caixa "celular Mask". No painel "Mask Source", selecione o botão de opção ao lado de "Segmento BF". Pressione o botão "Parâmetros" para abrir a GUI segmentação. (Se preferir, selecione um filme de máscara pré-segmentado, selecionando o botão de opção ao lado do botão "Select Máscara File", pressionando o último, e selecionando o filme como no passo 2.4. Neste caso, um filme BFOOF não é necessário, e pode pular para o passo 2.8.)
  7. Definir os diferentes parâmetros de segmentação (descrições de cada um pode ser vistaed pressionando "As descrições dos parâmetros"), e testar a qualidade da segmentação, clicando em "Test" (Figura 3). Com sucesso regiões segmentadas será verde com magenta fronteiras. Certifique-se de usar o controle deslizante para verificar vários momentos do filme. Quando a segmentação é satisfatória, selecione "OK" para retornar os parâmetros de segmentação para o GUI FormatData.
  8. Verifique o "Color Images" caixa. Digite o nome da cor para o primeiro canal de imagem fluorescente na caixa de edição de texto e, em seguida, clique em "Adicionar e selecione" para carregar os arquivos de cores como no passo 2.4. O nome da cor será adicionado à caixa de lista à esquerda, e os nomes de arquivos serão adicionados à tabela à direita. Se for cometido um erro ao carregar os arquivos de cores, selecione o nome da cor na caixa de lista à esquerda e clique em "Remover Color" para remover os arquivos. Repita para cada canal de cor.
  9. Se mascara sub-região adicionais com base em uma das cores fluorescentes (por exemplo, marcado por fluorescência núcleo → nuclouvido máscara região) são desejados, marque a caixa "Color Mask". Se não, pule para o passo 2.12. No painel "Color Máscara Fonte", digite o nome máscara sub-região na caixa de edição de texto. Escolha uma cor no menu pop-up no painel "Color Máscara Fonte" (requer a cor ter sido adicionada no passo 6) e empurre "Parâmetros" para abrir um limiar testar GUI.
  10. Pressione o botão "Auto-limite" para determinar automaticamente o limiar utilizando o método de Otsu 15, ea imagem vai destacar as áreas preservadas acima do limiar (Figura 4). O limite pode ser ajustado manualmente usando a caixa de edição. Use a barra de rolagem para confirmar o limite é apropriado para todos os momentos. Quando estiver satisfeito, pressione "OK" para voltar o limite para o GUI FormatData.
  11. Empurre "Adicionar e Segmento" para gerar a máscara de sub-região usando o módulo limiar aplicado às imagens de cores selecionados. O nome da máscara de cor e fonte será exibido na tabela à esquerda, com o r relevantenomes de arquivos ecognized que aparecem na tabela à direita. (Alternativamente, aperte "Adicionar e selecione" para carregar arquivos de máscara de sub-região pré-fabricados).
  12. Na parte inferior, especificar ou navegue até a pasta desejada para ser usado como o diretório de salvamento.
  13. Pressione "Dados Format" para ler os arquivos de imagem (usando o código tiffread2.m desenvolvido por François Nedelec, disponível em: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), processar os dados e criar um * arquivo. mat na pasta especificada. Este arquivo servirá de entrada para o GUI ProcessTimeSeries.
  14. Repita o passo 2,4-2,13 para o conjunto de filmes para cada posição palco.

3. Células pista e linhagens através do tempo com ProcessTimeSeries GUI e Cura ID e Atribuições Lineage (Figura 5)

  1. Execute o arquivo ProcessTimeSeries.m em MATLAB para abrir a GUI de rastreamento. Defina os seguintes parâmetros após a abertura daGUI:
    • "Altura Secção" ("File I / O" painel superior esquerdo) - que indica a altura da câmara em que as células estão presos. É usado como um constrangimento na aproximação volume da célula como um elipsóide 3D ​​com base no eixo principal e secundária da região de célula como no ponto 8.
    • "MM / pixel" ("File I / O" painel) - o factor de conversão para calibrar a distância de pixel mM nas imagens de modo que a área de secção transversal e o volume pode ser calculada de 2 mM e 3 mM, respectivamente.
    • "Painel Filters" (abaixo de "Arquivo I / O" painel) - conjunto mínimo e parâmetros máximos para filtrar regiões lixo na máscara: "Area" - Área de região em pixels; "Eclesiastes" - fator de excentricidade, mais circular como → 0 , "SF" - fator de forma, mais circular como → 1.
  2. Clique em "Carregar imagens" no "File I / O" painel, e selecione o arquivo de saída interesse pela GUI FormatData dados *. Mat. A máscara região (e quaisquer máscaras sub-região) é aplicada a cada canal de cor, E um certo número de diferentes medidas são feitas (Tabela 1). O arquivo de dados é então guardada. (Se estiver carregando um arquivo em ProcessTimeSeries de uma sessão anterior, ele vai perguntar se a análise deve ser reiniciado desde o início CUIDADO:.. Isto irá apagar qualquer curadoria pista já concluída e tratar os dados como se fosse fresco do GUI FormatData Se acidentalmente reiniciado, rapidamente pressione Ctrl + C na janela de comando do MATLAB para evitar o * anteriormente com curadoria de arquivo. mat de ser substituído.)
  3. Em seguida, rastrear as células. No painel "Pista Cells" (ao lado do painel "Filters"), defina os seguintes parâmetros:
    • "Max Deslocamento" - a distância máxima em pixels de uma célula podem viajar entre as imagens adjacentes antes de ser rotulado como uma célula diferente. Deslocamento maior significa que o algoritmo pode ser responsável por células que se deslocam mais, mas também aumenta a complexidade do correspondente regiões celulares em multidões. Começamos com 12 e diminuir se ocorrer um erro no rastreamento (consulte a etapa 30,4).
    • "Comprimento mínimo" - número mínimo de ocorrências para um traço de célula a ser considerada uma série de dados válido. Nós usamos uma para impedir a remoção de quaisquer vestígios reais, mas isso pode ser aumentada se os resultados de segmentação em breves traços, região espúrias.
    • "Memória Frame" - número máximo de quadros consecutivos de uma região celular pode desaparecer e ser dado o mesmo ID, quando ele retorna. Se ele desaparecer por mais de "Memória Frame", será dado um novo ID ao retornar. Usamos dois para permitir que as regiões para ser desperdiçada por segmentação por 2 quadros antes de retornar.
  4. Clique em "Células Track" para controlar regiões de um quadro para a próxima usando a região centroids (Blair e Dufresne implementação MATLAB de Crocker, Grier e semanas rotina IDL, disponível em: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , para atribuir linhagens para recém aparecem botões, e para guardar os dados. Linhagens são atribuídos automaticamente por minimizing distâncias entre as papilas putativos e mães em potencial em cada quadro. (Se aparecer um erro na janela de comando do MATLAB devido a "combinatória difíceis", diminuir "Max Deslocamento" e repita rastreamento.) Alterar parâmetros nas janelas pop-up, conforme necessário para seus dados.
  5. Curador regiões mal segmentadas e erros no ID ou atribuições linhagem utilizando as diversas ferramentas GUI ou teclas de atalho (mostrado em uma janela pop-up pressionando o botão acima do painel "Informações sobre a célula selecionada").
    • Slider, "Prev Imagem", "Next Imagem" (Ctrl + esquerda / direita) - usado para exibir e mover-se entre os quadros da série de imagem.
    • "Imagem #" - mostra o número do quadro da imagem atual nos eixos direito e esquerdo. Mover-se para um quadro especificado, digitando seu número na direita "Imagem #" caixa de edição.
    • "Delta frame" - mostra a diferença no número de quadros entre os eixos direito e esquerdo (Δ = direita - esquerda).
    • "Ocultar texto" (Ctrl + T) - alterna entre exibir os IDs de células emos eixos certo ou não.
    • "Ocultar rótulos" (Ctrl + L) - alterna entre exibir os IDs de celulares nos eixos da esquerda ou não.
    • "Mask" no menu pop-up - escolher entre exibir nenhuma máscara, a máscara de celular, ou qualquer sub-máscaras definidas pelo usuário para exibição no painel esquerdo.
    • Menu "Overlay" popup (Ctrl 1-9) - escolher exibir BF e camadas de cor no quadro à esquerda. Mostrar BF é o único que alterna a camada BF ligado ou desligado em ambos os eixos. Alternar entre a exibição ou não, selecionando o nome da sobreposição no menu novamente ("*" denota sobreposição é exibida). Ctrl +1 alterna BF sobreposição, com 2-9 alternando as camadas de cor em ordem.
    • "Definir Cores" - usado para determinar a cor para a exibição de sobreposição. Uma janela pop-up irá consultar qual o canal de fluorescência para definir e, em seguida, a paleta de cores aparecerá para definição do usuário.
    • "Modificar Regiões e Tracks" do painel - estes controla as alterações do efeito sobre a máscara região celular e informações de rastreamento:
      • "Update faixas" (Ctrl + U) - usar para reatribuir IDs de células. Se não houver células são selecionadas em certos eixos, o GUI vai solicitar uma ID de célula a mudar. Quando ID X é alterado para Y, todas as ocorrências futuras de X será alterado para Y, e todas as instâncias futuras do Y atual, vai ser transferido para X. (ocasionalmente uma célula irá alternar entre dois IDs, repetidamente. Este é devido ao rastreamento tentando acomodar vários IDs em uma região oversegmented ao invés de um erro na função ID atualização.) Múltiplas células podem ser selecionadas e seus IDs mudou ao mesmo tempo, mas não se esqueça de dar a cada um ID único. Para atribuir uma região com um ID que não existe no arquivo atual, digite "0" e será gerada. Use Ctrl + W para trocar os IDs de duas células em destaque.
      • "Delete Tracks Selecionados" (Ctrl + D) - usado para eliminar a célula selecionada ou várias regiões celulares no atual quadro eixos direita. (Se não houver células são selecionadas, pedirá ID.) Para apagar permanentemente todas as instâncias de um traço de identificação, marque a caixa ao lado do Delete botão faixas selecionadas (texto mudará para "Delete ALL"). Isso é útil para se livrar das regiões lixo persistentes, mas verifique primeiro futuros quadros para garantir que o ID não muda para uma célula válida ou região raiz.
      • "Mesclar Regiões" (Ctrl + A ou M) - suaviza e combina regiões celulares. Clique em uma célula ou células nos eixos a direita para seleccionar (região ficará vermelho, quando selecionado). Mesclando em uma região morfologicamente fechar para preencher rachaduras ou pequenos pedaços faltantes, usando um elemento em forma de disco. A fusão de duas ou mais regiões próximas irá combiná-los em uma região e dar o menor ID para a nova região. Isso é útil para regiões mais segmentados (muitas vezes quando as células têm grandes vacúolos).
      • "Draw região" - use o mouse para desenhar uma região nos eixos a direita onde desejadas e clique duas vezes para terminar. Fornecer um ID único não presente no conjunto de dados (entre 1 e 65535). Cancelar pressionando Delete no teclado.
    • "Lineage Rastreamento" painel - depois de rastreamento,atribuições linhagem são gerados automaticamente. Quando novas regiões ID aparecer, a nova ID de célula aparece na cor rosa e uma linha vermelha é atraída para a região da mãe. Novas regiões muito grandes para serem botões ou muito longe de potenciais mães aparecem em verde e é atribuído um ID mãe de "NaN" ("não é um número", ver Tabela 2). Regiões existentes no primeiro momento ter um ID mãe de "0". Para corrigir trabalhos individuais, entre a mãe e IDs broto nos campos de edição de texto e clique em "Fix". Para apagar a mãe de uma célula, insira "0" como sua mãe. Um método mais rápido é selecionar duas regiões na imagem da direita e pressione Ctrl + F. Isso irá atribuir automaticamente a região mais velho como a mãe ea região como a filha mais nova, ao apagar quaisquer atribuições de mãe previamente existentes para a célula filha. ATENÇÃO: Quando você clica em "Calcular Linhagens" a qualquer momento vai recalcular todas as atribuições de linhagem, incluindo aqueles que o usuário tenha previamente curadoria.
    • Painel "informações selecionadas celular" - "Get Info "irá mostrar algumas medições das regiões selecionadas nos eixos certos." Medidas ... "permite ao usuário determinar quais as medidas serão exibidas (bem como definir a lista padrão para outras operações, como" Exportar Dados "). Pode ser usado para determinar IDs e linhagens (por exemplo, se a célula X tem um botão no tempo t, é muito provável que não tem outro botão no tempo t + 5 min) corretos.
    • "Salvar alterações" (Ctrl + S) - atualiza o arquivo * mat para refletir as alterações do usuário.. Utiliza frequentemente (não há nenhuma função desfazer)!
    • "Gerar gráficos" - abre a GUI GeneratePlots. Usado para traçar rapidamente a informação variável selecionada e cálculos simples para regiões unicelulares destacados nos eixos direita do ProcessTimeSeries GUI, sua média, ou a média de todas as regiões em cada quadro. Esta GUI pode calcular derivadas primeiras difíceis, mas não se esqueça de especificar o intervalo de tempo correto, na parte superior esquerda. Parcelas pode ser a saída para uma figura para salvar pressionando "Gerar Figure".
    • Para curadoria dados corretamente: fundir quaisquer regiões oversegmented; excluir quaisquer regiões não captura toda a célula, não se esqueça relações mãe-broto estão devidamente atribuído (a linha vermelha aparece entre eles no momento da gema de emergência, quando o ID do botão é rosa, ver Tabela 2), e eliminar todos os IDs verdes fixando o ID, atribuindo a região a mãe, atribuindo nenhuma mãe ("0"), ou apagar a região. Dados Bud será adicionado ao da mãe durante a análise final, então não fundir a região bud a sua mãe (que vai levar a uma estimativa de volume imprecisa).
    • Inspecione visualmente os dados de cada quadro até o último momento de interesse, mas não é exigido de toda a série se não estiver usando os quadros posteriores.
    • Não se esqueça de salvar as alterações.
    • Repita os passos de 3,1-3,7 para o arquivo *. Mat para cada posição palco.

4. Exportação de dados para Análise

  1. Para simplesmente exportar medições região matérias para cada célula através time, empurre "Exportar Dados". As medidas de interesse pode ser selecionado na GUI que se abre, e eles vão ser produzidos em um espaço delimitado *. Txt com nomes de variáveis ​​como cabeçalhos de coluna.
  2. Para analisar a série histórica para células inteiras ao longo do tempo, calcular as informações do ciclo celular, e tomar derivados, empurre "Análise de Séries Temporais". Uma janela será aberta permitindo a seleção das medidas de interesse e de entrada dos parâmetros da análise (Figura 6).
  3. Digite o último ponto de curadoria no GUI (todos os quadros subseqüentes serão ignorados). Os parâmetros de atribuição de alisamento e do ciclo celular padrão funcionam bem para a estirpes diplóides e haplóides fotografada em intervalos de 5 min, mas estes podem necessitar de ser variado para obter os melhores resultados. (Verificar que os valores dos parâmetros são apropriados por meio da determinação do tempo de brotamento manualmente e para a divisão de um conjunto de dados de teste e comparando o desempenho do algoritmo automatizado.)
  4. Quando todos os parâmetros são definidos, empurre "Analisar" para:
    1. Contrastruct matrizes para cada medição bruta e subtrair o fundo (medido como a intensidade média da zona sem células da primeira moldura em cada filme fluorescente, ou pode ser especificada para contabilizar autofluorescência média por célula de pixel).
    2. Montar uma spline alisando com as medidas selecionadas para eliminar o ruído de medição de alta freqüência (como discutido no 9).
    3. Determinar automaticamente surgimento gemas e os tempos de divisão celular para cada célula com base em mudanças na inclinação da série temporal de volume como discutido em 9. As medições bud será então adicionado às medições da matriz entre a emergência e cada ciclo de divisão para uma série temporal de células inteiras contíguo. A progressão do ciclo celular normalizado também será calculada variando de 0 a 2 de divisão para divisão.
    4. Montar um alisamento spline para tomar estável 1 ª e 2 ª derivados das medições selecionados. (Para efeitos de derivados bem definidas, séries temporaissão feitos através da divisão contínua, deslocando os dados para o seguinte ciclo celular para cumprir o terminal para o ciclo anterior).
    5. Saída de séries temporais diferenciada série temporal suavizada em bruto e para todas as regiões, e suavização da célula inteira, contínuo, e como uma matriz para cada medição. O primeiro elemento é um índice de cor para subtracção de fundo, o resto da primeira linha de células mantém identificações, o resto da primeira coluna é o número de quadros, e os restantes elementos segurar a série tempo para cada célula em uma coluna com cada linha correspondente à armação na primeira coluna. Um conjunto similar de ciclo celular série tempo de evolução e as informações de linhagem também estará de saída. A matriz "LineageArray" contém uma tabela com cada linha representando uma relação mãe-bud e do primeiro ao quinto colunas são ID mãe, broto ID, quadro da região primeiro botão, quadro de brotamento estima, e um quadro divisão estimado. Os dados são exportados para um arquivo *. Mat (arquivo de dados do MATLAB).

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Representative Results

Uma experiência realizada com sucesso e analisados ​​trará séries temporais principalmente contínuo para células inteiras individuais com surgimento bud realisticamente atribuído e os tempos de divisão. Como exemplo, foi realizado o protocolo anteriormente referido, com uma estirpe haplóide de levedura expressando uma cópia integrada de proteína fluorescente Cerúlea (PCP), impulsionada pela constitutivo promotor ADH1 observar como o crescimento e expressão global pode variar ao longo do tempo em células individuais (Tabela 4, Y47 ). Fizemos a análise de séries de tempo para obter um conjunto de células (Figura 7A) medidas ao longo do tempo, e uma dependência do ciclo celular resulta em volume e de expressão como os encontrados em 9. Após a formação de gemas, o volume total combinado (mãe + botão) aumenta mais rapidamente do que antes botão de emergência (consistente com 8,16), enquanto que a concentração de proteína, ou a intensidade média, diminui ligeiramente (Figuras 7B e 7C). O aumento do combinado integraproteína ted (concentração de volume x, neste caso) também acelera depois de brotamento (Figura 7D). Comparando com a região a mãe sozinha (Figura 7B & D), estes resultados demonstram a importância de incorporar adequadamente as contribuições broto à medida célula inteira e destacar a necessidade de formação de gemas adequado e atribuições divisão de tempo. Como já relatado 9, podemos usar a série de tempo diferenciado para calcular uma relação instantânea mRNA nível M (t) e taxa de transcrição A (t), que ambos também aumentar após brotamento (Figura 7E e 7F):

Equação 1
onde P (t) é a proteína total no momento t e γ M é a taxa de degradação do mRNA 0,04 min -1

A capacidade de gerar derivados de séries de tempo de medição de tempo estável beneficia também estudos cinéticos. Nós usamos uma cepa de levedura expressando, um fator de transcrição quimérica observável com a atividade de transcrição comutável (Tabela 4, Y962). O fator de transcrição mestre da via fome fosfato, Pho4p, é controlado através de localização nucleo-citoplasmático em resposta a concentratio fosfato extracelular n 18. Nós substituímos o domínio de ligação ao ADN de Pho4p com tetR, o qual vincula o operão tet (tetO) e C-terminal fundidos o novo factor de transcrição de uma proteína fluorescente verde para criar pho4-tetR-YFP 9. Ao mudar o nível de fosfato no meio de perfusão, que poderia, então, alternar a expressão de um PCP integrado dirigido por um promotor sintético composto por sete locais de ligação a tetOnd a CYC1 promotor mínimo (7xtetOpr-PCP). A análise das séries de tempo mostra que o factor de transcrição está localizada no núcleo (usando uma fusão de RFP e Nhp2p proteína nuclear para criar uma sub-máscara nuclear baseada RFP como no passo 2,9-10) e, quando o gene alvo e inicia a transcrição pára (Figura 8). Ao analisar a série derivada ao longo do tempo, os tempos de activação e desactivação do promotor-alvo, em cada célula pode ser inferida, mesmo quando a concentração do repórter fluorescente estável é elevado.

Figura 1
Figura 1. Esquema de protocolo. O protocolo descreve os passos para 1) cultura de microfluídica, 2) fluorescência, microscopia de lapso de tempo, 3) análise de dados e

Figura 2
Figura 2. GUI FormatData. A interface é usado para importar, o formato e os dados de imagem do segmento para cálculos posteriores e inspeção visual. Os números indicam a etapa de protocolo correspondente a cada componente. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 3
Figura 3. SegTest GUI. A interface é utilizada para testar células segmento ation parâmetros e confirmar visualmente a precisão de segmentação como no passo 2.7.

Figura 4
Figura 4. ColorThreshTest GUI. A interface é utilizada para testar o limiar de intensidade necessária para criar uma máscara subcelular do canal de fluorescência escolhido como no passo 2.10.

Figura 5
Figura 5. GUI ProcessTimeSeries. A interface é usado para medir, monitorar, inspecionar visualmente e editar regiões celulares e atribuições linhagem. Os números indicam o passo de protocolo correspondente a cada componente.target = "_blank"> Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 6
Figura 6. GUI AnalysisParams. A interface é usado para introduzir os parâmetros necessários para a análise de séries temporais como nas etapas 4.3 e 4.4.

Figura 7
Figura 7. Séries temporais de uma única célula de uma levedura haplóide expressar ADH1 pr-PCP na cultura microfluídicos ao longo de várias gerações. (A) campo Bright (linha superior) e PCP (linha inferior) micrografias são apresentadas nos pontos de hora indicada para uma célula ao longo do experimento . Para a célula mãe segmentado (azul outline) e seus botões (contorno verde), a célula inteira contígua está destacado em vermelho. (C), séries de tempo da concentração de proteína mãe bruto e botão de volume (B), e foram ajustados para remover o ruído de medição, e (D) fluorescência integrada PCP foi calculado como o produto do volume e concentração. A célula inteira (vermelho) traço é estendido divisão passado para manter uma execução total que é fácil de caber a uma spline suavização diferenciável em todas as divisões (B e D). A (E) o nível relativo de ARNm e (F), taxa de transcrição instantânea são calculadas usando as equações (1-2) e o encaixe na ranhura (D).

Figura 8
Figura 8. Promotor resposta taxa de transcrição de nucleo-citoplasmáticovaivém de uma fusão pho4-YFP em células de levedura individuais. (A) Micrografias dos quatro canais de aquisição indicados são apresentados para uma célula com um comutável YFP-fundido pho4-tetR transactivador que (B) se localiza no núcleo RFP-marcado em resposta para baixo de fosfato e (C) expressão unidades de um repórter 7xtetOpr-PCP. (D) As alterações na taxa de transcrição inferidos com localização em média (linha preta) e ao nível de uma única célula (linhas magenta e vermelho, onde representa o vermelho contígua região célula destacado em vermelho na A). Quedas acentuadas na expressão PCP em B coincidem com a divisão celular quando alguma proteína é perdida para a célula filha.

Nome de medição Descrição
Tempo Número do quadro da Imagem
Área O número totalf pixels que compõem a região
Volume (4/3) πabc, em que a = ½ comprimento do eixo principal da região, b = ½ comprimento do eixo menor e, b ou c = ½ "altura Secção" (conforme o que for mais pequeno)
(X) _ (Y) significa Intensidade de pixel significa para a máscara região (Y) no canal de cor (X)
(X) _ (Y) mediano Mediana de intensidade de pixel para a região da máscara (Y), no canal de cor (X)
(X) _ (Y) std Desvio padrão da intensidade dos pixels da máscara região (Y) no canal de cor (X)
(X) _ (Y) IQR Intervalo interquartil de intensidade dos pixels para a máscara região (Y) em canal de cor (X), percentil 75 - 25 º percentil
(X) _ (Y) T20pct Intensidade para os 20% de intensidade de pixel para máscara região (Y) no canal de cor (X) significa. Usarful em comparação com a medição seguinte para determinar a localização subcelular, sem um sub-máscara.
(X) _ (Y) B80pct Intensidade para o fundo de 80% da intensidade dos pixels de máscara região (Y) no canal de cor (X) significa. Útil em comparação com a medição anterior, para determinar a localização subcelular, sem um sub-máscara.
(X) _ (Y) M50pct Intensidade média para a média 50% de intensidade de pixel para máscara região (Y) no canal de cor (X)
(X) _cellint Integrado fluorescência de canal de cor (X) (média intensidade de pixel x volume) para toda a célula (mãe e qualquer broto conectado)
(Z) Raw Tempo de saída de dados Raw série, "Análise de Séries Temporais" para a variável (Z)
(Z) suave Spline-alisou séries temporais de saída de dados brutos por "Análise de Séries Temporais" para a variável (Z)
(Z) Whole Célula inteira (moutro + anexo bud séries temporais de saída (Z) Rawsmooth) dados por "Análise de Séries Temporais" para a variável (Z)
(Z) Cont Whole celulares dados de séries temporais fez contínua em divisões ("total de execução"), a produção em "Análise de Séries Temporais" para a variável (Z)
(Z) WhSmooth Spline suavização (Z) Tempo de saída da célula inteira série de dados por "Análise de Séries Temporais" para a variável (Z)
(Z) ddt Primeira vez, derivado de estrias suavização (Z) Tempo de saída da célula inteira série de dados por "Análise de Séries Temporais" para a variável (Z)
(Z) d2dt2 Segundo tempo derivado de estrias suavização (Z) Tempo de saída da célula inteira série de dados por "Análise de Séries Temporais" para a variável (Z)

Tabela 1. Medição nomenclatura variável em GUI ProcessTimeSeries.

Cor ID celular Estado Lineage
amarelo mãe atribuído
rosa broto novo (linha vermelha traçada a mãe atribuído)
verde nenhuma mãe atribuído

Tabela 2. Celular código de cores para identificação status de atribuição linhagem.

Nome do arquivo Descrição
FormatData.m GUI de entrada de dados que formata filmes e segmentos BF imagens para processamento por ProcessTimeSeries.m
FormatData.fig FormatData layout da janela GUI
BFsegment.m Módulo de segmentação BF, com extractregions2.m e segmentregions.m
SegTest.m Segmentação qualidade GUI testes
SegTest.fig SegTest layout da janela GUI
extractregions2.m Primeiro componente do módulo de segmentação BF para identificar regiões
segmentregions.m Segundo componente do módulo de segmentação BF para regiões separadas de células e limpo
color2submask.m Módulo de segmentação submáscara Fluorescência baseada
ColorThreshTest.m Limiar máscara GUI testes baseados em fluorescência
ColorThreshTest.fig ColorThreshTest layout da janela GUI
tiffread2.m Extrai dados *. TIF ou arquivos *. STK para uso em MATLAB
imalign.m Registro de imagem usando correlação cruzada 2D
ProcessTimeSeries.m Processamento de dados GUI que rastreia as regiões, atribui linhagens, e permite a correção visual de erros. Também fornece a capacidade de diagramação baseada em GUI e saídas de dados de séries temporais de células inteiras
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries layout da janela GUI
cleanMask.m Elimina regiões máscara com base em parâmetros de GUI ProcessTimeSeries
track.m Faixas regiões celulares baseados em centróides região
OptimizeLineages.m Módulo de atribuição Lineage determina as relações ótimas mãe brotamento com base na distância física e eventos de brotamento passado e futuro
getClosestObjects.m Encontra células vizinhas para cada novo ID de célula (BUD)
SelectVariables.m Medição seleção GUI para a escolha de variáveis ​​de interesse
SelectVariables.fig SelectVariables layout da janela GUI
GeneratePlots.m Plotagem GUI para os dados na janela ProcessTimeSeries
GeneratePlots.fig GeneratePlots layout da janela GUI
AnalyzeCellSeries.m Módulo de análise de séries temporais determina o tempo de divisão celular e produz medições de células completas, tal como descrito no texto
assignDivisionsInf2.m Atribui broto e os tempos de divisão celular
AnalysisParams.m Tempo de entrada de parâmetro de análise de séries celular
AnalysisParams.fig AnalysisParams layout da janela GUI

Tabela 3. ENXERTOS apresentar descrições.

Strain ID Genótipo (W303-based) Referência
Y47 MAT um leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19
Y962 MAT uma ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-PCP 9

Tabela 4. As estirpes de levedura utilizadas neste estudo.

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Discussion

O protocolo acima descreve um método simples de se obter e analisar fluorescência dados de séries temporais com experiência limitada em microfluídica ou no desenvolvimento de software. Ele permite a obtenção de time-lapse filmes de fluorescência das células de levedura de solteiro; extrair o tamanho da célula relevante e medições de expressão; rastreamento cura e atribuições da linhagem, e analisar o comportamento de células inteiras ao longo do tempo usando um dispositivo cultura microfluídicos comercialmente disponíveis e uma interface gráfica versátil Interface (GUI). Enquanto o experimentais, segmentação e rastreamento passos foram abordados de várias formas anteriormente 11,13,14, o procedimento acima é projetado para tornar essas técnicas mais acessíveis a um subconjunto mais amplo da comunidade de biologia. Enquanto que o procedimento acima é optimizado para um dispositivo de cultura de microfluidos particular, a análise global pode ser adaptado a dispositivos similares como off-the-shelf microfluídicas As técnicas de cultura se tornam mais barato e mais personalizada. FundamEntally, a segmentação e algoritmos de medição região que empregam são semelhantes aos métodos existentes 13,14, mas o software ENXERTOS adiciona a capacidade de curadoria visualmente rastreamento região e atribuições de linhagem e de atribuir as fases do ciclo celular com precisão. Ambos os recursos são cruciais para calcular com precisão o tempo-derivados de séries de dados.

Existem várias etapas no protocolo que impactam significativamente a qualidade dos dados de séries temporais resultantes. Inicialmente sobrecarregar a câmara de cultura com células diminui a perfusão na câmara (especialmente visível em experimentos cinéticos câmara onde o tempo de atualização é importante), e crescimento excessivo ocorrerá no início do curso de tempo experimento. Isto pode ser melhor evitadas, começando com menor pressão de carga da célula para os tempos mais curtos e ir aumentando gradualmente até que um ou ambos de uma densidade de células adequada é alcançada. Selecção de posição palco para a imagem latente é uma consi relacionados e igualmente importanteração. Conhecendo o tempo de duplicação da linhagem, o plano de quantas células estará no quadro de imagem ao longo do tempo e prever como aglomeração afectará meios de difusão. Dez células dispersas irão crescer em dez microcolónias, mas dez células inicialmente agrupadas vão crescer num único e grande colónia (notamos limitações de difusão de nutrientes em 6 psi para o centro de uma colónia quando é superior a ~ 14 células de diâmetro) . Esforço extra nas etapas de protocolo de upstream também facilita a curadoria manual de dados mais tarde, e melhora a série temporal de saída. Verifique se o prato está firmemente montado no palco e usar a opção de registro de imagens na GUI FormatData para melhorar substancialmente a precisão de rastreamento automaticamente células individuais ao longo do tempo. Passe algum tempo na escolha dos melhores parâmetros possíveis de segmentação também para reduzir o número de erros que requerem atenção. O software de rastreamento funciona melhor com ligeira oversegmentation das regiões celulares em vez de undersegmentation porque remerging umdivisão celular é uma tarefa simples do que o desenho de linhas para dividir regiões, contudo, o aumento da oversegmentation aumenta erros nas atribuições de linhagem, devido à presença de falsos, novas regiões. Além disso, certifique-se de que todas as relações mãe-broto estão devidamente designado para que as medidas para a célula inteira será preciso. Se um broto é perdida pela segmentação ou cresce fora do limite da imagem, considere terminando série de dados da mãe para evitar resultados falsos. Isso é feito facilmente, alterando a região de mãe para uma identificação única (ID entrar de "0") no quadro errôneo, e usando o "Delete ALL" recurso para remover todas as ocorrências futuras da nova ID. Muita atenção para estas etapas vai aumentar muito a precisão dos dados de séries temporais matérias.

Para estabelecer a interpretação válida da saída de dados pressionando "Análise de Séries Temporais", recomendamos algumas perguntas adicionais. Verifique surgimento gemas e os tempos de divisão são precisamente determinado com base no usuário inpuparâmetros t. Registrar manualmente vezes brotamento e divisão de um set de filmagem de teste e comparar com os resultados do algoritmo. Para estimar visualmente o tempo cytokinesis completa entre uma mãe e filha, olha para o seu limite de estreito e escurecer. (NB:. Uma estirpe de ensaio com ajudas núcleo fluorescente marcadas em observação o manual de divisão de tempo Outro método seria fluorescente-marcar a membrana plasmática e olhar para o espaço entre as células mãe e filha para fechar.). Além disso, verificar se a fluorescência total de uma célula é bem calculado como a intensidade média da região multiplicada pelo volume (quando a luz captada se origina a partir de uma fina secção transversal da célula), ou como a fluorescência integrada ao longo da região (quando a luz captada origina toda a célula). Se o perfil de fluorescência através de uma célula corresponde à curva de uma semi-elipse descrita pelos eixos maior e menor da região 7, luz captada se origina a partir da célula inteira, e total de fluorescência should ser calculado como (média intensidade) x (área). No nosso caso a 63X com uma profundidade de campo e muito menos do que a altura da pilha, o perfil de fluorescência é relativamente plano e de fluorescência total é calculado como (intensidade média) x (em volume). Outra consideração é o fotobranqueamento do fluoróforo. O software não considerar a fotodegradação na análise e, portanto, a saída série do tempo de fluorescência representa apenas ao repórter observável. Fotobranqueamento processos dependem fortemente das configurações de aquisição e intervalo de tempo utilizada para obter imagens de fluorescência, a natureza do fluoróforo, e vários outros parâmetros específicos da experiência. Fotodegradação também pode não ser bem descrita por uma expressão simples de velocidade de primeira ordem, o que impede que um algoritmo geral para seu tratamento. Por isso, não conta para a fotodegradação na saída séries de tempo, mas o método de análise pode ser utilizado para medir a cinética de este processo para facilitar a interpretação do utilizador. Por fim, escolha smoothing parâmetros adequados para a série temporal observada. Idealmente, as estrias de alisamento vai eliminar o ruído de medição de alta frequência, enquanto preservando as características reais nos dados. Os parâmetros necessários para atingir este depende das características da série de tempo particular e pode variar entre experiências.

O software foi concebido para ser flexível para a análise de vários dados de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Qualquer número de canais de cor podem ser incluídas e qualquer podem ser utilizados para criar uma máscara de sub-região. Enquanto os algoritmos funcionam bem para filmes de células de levedura de brotamento, muitas das funcionalidades deve estender-se filmes de outros organismos, bem. Medição região (com exceção de volume), rastreamento e curadoria depende apenas da máscara de células e são, portanto, adaptável. A segmentação, atribuição linhagem, a determinação de divisão celular, e os módulos de análise de séries temporais podem ser modificados de forma independente para se adequar a necessidades específicas. Além disso, em vez de usar a si incluídogmentation módulo, uma máscara de filme pré-segmentado podem ser introduzidas, e de contraste de fase de interferência diferencial, ou imagens de contraste pode ser substituído para o campo luminoso. O GUIs pode então ser usado principalmente para controlar e curador ID e atribuições linhagem.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

Agradecemos Emily Jackson, Joshua Zeidman, e Nicholas Wren para comentários sobre o software. Este trabalho foi financiado pelo GM95733 (para NM), BBBE 103.316 e MIT fundos de inicialização (para NM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

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References

  1. Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307, (5717), 1962-1965 (2005).
  3. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  4. Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8, (5), 431-433 (2012).
  5. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332, (6028), 475-478 (2011).
  6. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123, (6), 1025-1061 (2005).
  7. Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332, (6028), 472-474 (2011).
  8. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38, (8), 2676-2681 (2010).
  9. Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. Submitted (2013).
  10. Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5, (9), e239 (2007).
  11. Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1, (1), 2005.0024 (2005).
  12. Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, (7131), 46-51 (2007).
  13. Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3, (1), e1468 (2008).
  14. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4, (2), 175-181 (2007).
  15. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9, (1), 62-66 (1979).
  16. Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23, (12), 1408-1422 (2009).
  17. To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327, (5969), 1142-1145 (2010).
  18. O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271, (5246), 209-212 (1996).
  19. Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304, (5678), 1811-1814 (2004).

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