Erhvervelse Fluorescens Time-lapse film fra Spirende Gær og analysere encellede Dynamics hjælp poder

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi præsenterer en simpel protokol til at opnå fluorescensmikroskopi film af voksende gærceller, og en GUI-baseret software pakke til at udtrække encellede tidsseriedata. Analysen omfatter automatiserede afstamning og division tid opgave integreret med visuel inspektion og manuel datasikring sporede data.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescens time-lapse mikroskopi er blevet et magtfuldt redskab i studiet af mange biologiske processer på enkelt-celle niveau. Især giver film skildrer den tidsmæssige afhængighed af genekspression indsigt i dynamikken i dens regulering, men der er mange tekniske udfordringer til at indhente og analysere fluorescens film af enkelte celler. Vi beskriver her en simpel protokol ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt mikrofluid kultur-enhed til at generere disse data, og et Matlab-baseret, grafisk brugergrænseflade (GUI)-baseret softwarepakke til at kvantificere de fluorescens billeder. Den software segmenter og spor celler, giver brugeren mulighed for at visuelt kuratere fejl i data, og tildeler automatisk afstamning og division tider. GUI yderligere analyserer tidsserier til at producere helcelle spor såvel som deres første og anden gang derivater. Mens softwaren blev designet til S. cerevisiae, bør dens modulopbygning og alsidighed tillader det to fungere som en platform for at studere andre celletyper med få modifikationer.

Introduction

Single-cell analyse af genekspression har fremmet vores forståelse af mange aspekter af genregulering. Statiske snapshots af fluorescerende reporter udtryk ved hjælp af flowcytometri eller mikroskopi giver nyttige oplysninger om fordelingen af ​​encellede udtryk, men mangler den historie og udviklingen af ​​tidsseriedata, der er nødvendige til direkte at underrette genekspression dynamik. Fluorescens time-lapse mikroskopi præsenterer et middel til at opnå både encellede målinger og deres historie. Forskellige eksperimentelle og analytiske teknikker er blevet udviklet til at opnå og kvantificere film af fluorescerende reporter udtryk, og dermed bibringe indsigt i genregulering funktioner (se 1 for en gennemgang) såsom celle-til-celle variation 2,3, bakteriel persister formation 4, transskription initiering og forlængelse 5, transcriptional sprængfyldt 6,7, celle-cyklus afhængighed 8,9 og heritabilitet 10. Men OBTaining kvalitet encellede fluorescens tidsserier indebærer betydelige tekniske udfordringer i dyrkning et monolag af celler i en kontrollerbar miljø og i high-throughput kvantificering af de erhvervede fluorescens film. Her beskriver vi en procedure for at opnå og analysere fluorescens film af S. cerevisiae med ingen krævede erfaring i cellekultur enhedens fremstilling eller i software udvikling (figur 1).

Først, vi detalje et eksempel protokol til at generere fluorescens tidsserier film spirende gær udtrykker én eller flere fluorescerende journalister. Selvom tilpassede mikrofluid kultur kamre er blevet bygget, og med held tidligere 11-13, bruger vi en kommercielt tilgængelig mikrofluid enhed fra CellAsic (Hayward, CA). Systemet begrænser celler til monolag vækst og muliggør kontinuerlig kontrol af perfusion miljø. Det mikroskopi-protokollen præsenterer vi er en enkel måde at opnå fluorescerENCE film af spirende gær, men enhver ændret forsøgsprotokol (en tilpasset kultur-enhed, alternative medieforhold, osv.) yder det samme fluorescens filmdataene af enkelt gærceller kan erstattes.

Dernæst vi skitsere en analyse af de film ved hjælp af en grafisk brugergrænseflade (GUI)-baseret softwarepakke i MATLAB (Mathworks, Natick, MA), døbt GUI til hurtig analyse af fluorescens Time Series (Transplantater), at udtrække tidsseriedata til enkeltceller. Poder har lignende funktioner til den alsidige, open-source software-pakke celle-ID 14 i segmentere og sporing celler og i udvinding fluorescens intensitet og geometriske oplysninger. Men poder giver vigtige ekstra funktioner. For det første giver nem interaktiv redigering af segmentering og sporing resultater at kontrollere data nøjagtighed, snarere end blot statistisk gating af outlier regionens spor efter analyse. Desuden udvider analyse automatically designerede afstamning og celle-cyklus punkter af interesse for spirende gær. Bestemme, hvornår mor og datter deler at danne to uafhængige celle regioner er afgørende at afgøre helcelle (mor herunder eventuelle tilsluttede hovedtelefoner) målinger gennem hele cellecyklus 8.. Suiten består af tre moduler til at udføre disse opgaver. De første segmenter celle regioner baseret på kontrasten mellem fokuseret og ufokuseret lyse field billeder, og giver brugeren mulighed for at definere og visuelt teste segmentering parametre. Den anden spor (. Bruger Blair og Dufresne s MATLAB implementering af Crocker m.fl. IDL rutine, findes på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) og måler celle regioner gennem tiden, tildeler automatisk slægter, og muliggør visuel inspektion og fejlretning. En simpel plotte GUI er medtaget for at query encellede egenskaber. Det tredje modul tilskriver opløbet opståen og division TImes, og udsender helcelle tidsseriedata såvel som deres første og anden gang derivater (som omtalt i 9). Analysen modulet udlæser dataene som en mellemrums-adskilt tekstfil til senere undersøgelse i den statistiske software valg. Således pakke aktiverer brugeren til at udtrække høj kvalitet tidsseriedata via en grafisk brugerflade. Vi har anvendt denne metode til at estimere realtid transskriptionshastigheder i enkelte spirende gærceller som en funktion af cellecyklus 9.. Mens modulerne er blevet optimeret til spirende gær, parametrene eller om nødvendigt, den frit tilgængelige koden kan tilpasses til andre organismer og billedtyper. Segmentering, sporing og slægt overdragelse algoritmer kan være specifik for typer af tildelte billedbehandling og den pågældende organisme. De eksisterende algoritmer kunne erstattes, men stadig bevare den grafiske interface, der tillader brugervenlig visuel inspektion og korrektion af segmentering og sporing af fejl, der uvægerligt erhvervspsykolor med enhver algoritme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Opnå fluorescensmikroskopi film fra Single Gærcellers Dyrkning i et Mikrofluid afdeling

  1. Inokulere 1 ml SC medier (syntetisk definerede medier med 2% glucose og komplet komplement af aminosyrer) med celler fra en frisk voksende plade, og inkubér kulturen natten over ~ 16 timer på en rulle tromlen ved 30 ° C. Forbered kulturen sådan, at den endelige OD 600nm er ~ 0,1 for tidlig log-fase vækst.
  2. Fortynd syrevækkerkulturen efter behov og regrow 1 ml i en frisk reagensglas yderligere 6-8 timer til OD 600nm = 0,1. Dette giver celler vokser i en næringsrig steady state ved en densitet egnet til læsning i mikrofluid enhed. (Alternativt, udskift trin 1,1-1,2 med den procedure, der er nødvendige for at forberede celler som kræves for eksperimentet.)
  3. Forbered en Y04C microfluidic kultur pladen fra CellAsic: Fjern shipping løsningen; skylles brøndene med sterilt vand, og bruge ONIX perfusionssystemet flowvand gennem boringer 1-6 ved 6 psi for 5 min at skylle kanaler. Derefter flow fra lastning godt 8 ved 6 psi for 10 sek (opsamlerkanalen har meget højere flow og skal skylles separat).
  4. Fjerne vand fra alle brønde og erstatte med 250 ul SC i fjorden brøndene 1-6 og 50 ul af kulturen fra trin 1.2 i celle lastning godt 8. (Alternativt kan de ønskede medier placere i indløbet brønde 1-6 for forsøg, der kræver skift mellem forskellige betingelser.)
  5. Forsegl ONIX manifold til pladen, og begynde priming kanaler og kultur kammer ved at strømme fra indløb brøndene 1-6 ved 6 psi i 2 min efterfulgt af mindst 5 min ved 6 psi fra kun indløbet godt holder de startende medier til eksperiment. Flow dette kontinuerligt indtil trin 1.7.
  6. Forbered mikroskopet til eksperimentet. Vi bruger en Zeiss Axio Observer.Z1 Widefield mikroskop med en Cascade II back-belyste EMCCD kamera (Photometrics, Tuscon, AZ) og en Lumen 200 metalhalogen buelampen (forudgående videnskabelig, Rockland, MA) til fluorescens excitation svækket til 10% for at forhindre fotoblegning. For at minimere den skifter tid, der kræves for at erhverve flere fluorescerende kanaler, vi parret en enkelt, triple-bandpass dichroic filter terning passende excitation / emission filtre til den fælles fiskeripolitik, YFP og RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, sæt 89006) sat i eksterne, hurtigt skifte filter hjul (Ludl elektroniske produkter, Novato, CA).
  7. Placer et par dråber fordybelse væske på målsætningen (om nødvendigt, bruger vi en Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC), og monter mikrofluid enhed sikkert i den fase af inverteret mikroskop. Sikring pladen ikke bliver vendt i den fase hele eksperimentet forbedrer celle sporingen under dataanalyse. Vi har simpelthen tape pladen til scenen mount at forhindre dens skiftende.
  8. Fokus på den yderste venstre tredjedel af den første kultur kammer (hvor kammeret højden er mindst) ved hjælp af en af ​​de indlejrede position markører. Sluk strømmen fra medierne indløb godt, og flow fra celle lastning godt 8 ved 6 psi i 5 sek brister. Flyt scenen til at kigge rundt i kulturen kammer til cellerne. Øg lastning flow tid og tryk, indtil den ønskede celletæthed er opnået, men undgå overbelastning og tilstopning længst til venstre barriere, hvor friske medier kommer ind i kammeret.
  9. Begynd flyder fra medierne indløb brønd indeholdende udgangspunkterne medier på 6 psi.
  10. I MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) eller andre mikroskopi automatisering og kontrol software, opsætning en multi-dimensional erhvervelse at tage flere billeder på flere fase positioner over tid. Angiv antallet af og intervallet mellem tidspunkter. Vælg flere stage stillinger med ~ 10 celler hver (flere vil overcrowd hurtigt). Vi bruger typisk 5 min intervaller og image op til 16 positioner, hvor hver kræver ~ 11 sekunder for erhvervelse på hvert tidspunkt.
  11. Opsætning erhvervelsen så der på hvert trin position på hvert tidspunkt the program vil: fokus på det transmitterede lys lyse felt (BF) billedet ved hjælp MetaMorph indbyggede autofokus metoden (om gennemførelse af autofokus som en brugerdefineret-skrevet journal ved starten af ​​hver etape position giver større kontrol over fokuspræcision) erhverve BF billede ved en um til brændplanet (fp), erhverve en BF ude af fokus (BFOOF) billede på -4 um til fp (brug custom-skriftlige tidsskrifter til at ændre fokus som kræves mellem billederne), og erhverve en gråtoneskala billede for hvert fluorescerende reporter på fp med indstillinger optimeret til hurtig overtagelse med minimal fotoblegning.
  12. Hvis det er nødvendigt, få baggrund og skygge korrektion billeder for hver fluorescerende reporter i et område af kulturen kammer uden celler.
  13. Forbered flow programmet for eksperiment i ONIX kontrol software. Samtidig begynder købet programmet MetaMorph og strømmen program i ONIX kontrol software.
  14. Ved afslutningen af ​​forsøget, rette unendda baggrund og skygge i de fluorescerende billeder (om nødvendigt), og eventuelt kombinerer. tif-filer for hvert billede kanal på hvert trin position i en. stk filmfil (fx skabe BF, BFOOF, den fælles fiskeripolitik, YFP og RFP-film for position 1 ).

2.. Format og segmentoplysninger for Tracking Brug af FormatData GUI i Matlab (figur 2)

  1. Kør FormatData.m fil i Matlab til at åbne data input GUI. Øverst specificere eller gå til den mappe, der indeholder billedfiler til at indstille data biblioteket og derefter bruge GUI til at angive de datatyper og billedfiler optaget i eksperimentet.
  2. Til højre på alternativknappen ved siden af ​​"Time-lapse" for at indikere hvilke analyser typen til at udføre vælger. "Time-lapse" vil behandle billedet serien som en tidsserie (fx en film af celler vokser i en mikrofluid kammer). "Static" vil behandle hvert billede serien som et sæt af snapshots taget fra en population (f.eks flere billeder taget på DIFskellige positioner på et enkelt dias prøve). I denne Transplantater version, kan time-lapse data for flere positioner behandles, men som en separat fil for hver position (se trin 2.14).
  3. Marker afkrydsningsfeltet for billedet registrering for at korrigere for upræcise stage bevægelser ved at flytte hvert billede i den film at minimere synlige celle bevægelighed inden for rammen. Vi anbefaler dette, da det i høj grad forbedrer sporing (reducere manuel track datasikring senere), men vil tilføje tilfældige, "hvid støj" pixelværdier at udfylde, hvor billederne er blevet flyttet ved grænsen. Det kunne også vælges efter visning segmenterede BF billeder i trin 2.7 eller på ethvert tidspunkt indtil trin 2.13.
  4. Check "Bright Field"-boksen i "Data Channels" panel. Klik på "Select" til højre for at indlæse BF billeder. For *. TIF-filer, alle BF billeder, der svarer til en enkelt film ved at holde Shift-tasten nede mens du vælger vælg og klik på "Åbn". For *. STK filer, skal du vælge netop den BF stak af interesse. Hvis billederne er succesanerkendes fuldt ud, vil filnavnene være opført i popup-menuen til højre i "anerkendte data" panel. . For * TIF filer, skal du sørge for filnavne vises i den rigtige rækkefølge (gemme filer med sekventielle navne under anskaffelse - BF_t001 osv.).
  5. Check "Bright Field (ude af fokus)" boksen og bruge "Select" knappen som i trin 2.4 for at indlæse BFOOF filer, som vil blive opført i popup til højre. (BFOOF opnået som BF -4 um i forhold til fp på 63x segmenter godt.)
  6. Check "Cell Mask"-boksen. I "Mask Source" panel, skal du vælge alternativknappen ved siden af ​​"Segment BF". Tryk på "Parametre" knappen for at åbne segmentering GUI. (Alternativt kan du vælge en pre-segmenteret mask film ved at vælge alternativknappen ved siden af ​​"Select Mask File"-knappen, trykke på sidstnævnte og vælge filmen som i trin 2.4. I dette tilfælde er en BFOOF filmen ikke er nødvendigt, og kan springe til trin 2.8.)
  7. Indstil forskellige segmentering parametre (beskrivelser af hver kan seed ved at trykke på "Parameterbeskrivelser"), og teste segmentering kvaliteten ved at klikke på "Test" (Figur 3). Succesfuld segmenterede regioner vil være grøn med magenta grænser. Vær sikker på at bruge skyderen til at kontrollere forskellige tidspunkter i filmen. Når segmentering er tilfredsstillende, skal du vælge "Udført" for at vende tilbage segmentering parametre i FormatData GUI.
  8. Check "farvebilleder" boksen. Indtast farven navn for den første fluorescerende billedet kanal i teksten redigeringsfeltet, og tryk derefter på "Tilføj og Vælg" for at indlæse den farve filer som i trin 2.4. Farven navn vil blive føjet til listen til venstre, og filnavnene vil blive tilføjet i tabellen til højre. Hvis der laves en fejl i indlæsning farven filer, skal du vælge farven på listen til venstre og klik på "Fjern Color" for at fjerne filerne. Gentag for hver farvekanal.
  9. Hvis yderligere sub-region masker baseret på en af de fluorescerende farver (f.eks fluorescensmærkes kerne → Nucløreregionen maske) ønskes, skal du kontrollere "Color Mask"-boksen. Hvis ikke, gå til trin 2.12. I "Color Mask Source" panel, skal du indtaste sub-region maske navn i teksten redigeringsfeltet. Vælg en farve fra popup-menuen i "Color Mask Source" panel (kræver farven er blevet tilføjet i trin 6), og skub "Parametre" for at åbne en tærskel test GUI.
  10. Tryk på "Auto-threshold"-knappen for automatisk at bestemme tærsklen hjælp Otsu metode 15, og billedet vil fremhæve de områder bevaret over tærskelværdien (Figur 4). Tærsklen kan justeres manuelt ved hjælp redigeringsboksen. Brug rullepanelet til at bekræfte tærsklen er passende for alle tidspunkter. Når du er tilfreds, tryk på "Udført" for at vende tærsklen til FormatData GUI.
  11. Push "Tilføj og Segment" til at generere den sub-region maske hjælp tærsklen modulet anvendes på de valgte farvebilleder. Farven maske navn og kilde vil blive vist i tabellen til venstre, med de relevante recognized filnavne i skemaet til højre. (Alternativt, tryk på "Tilføj og Vælg" for at indlæse pre-made sub-regionens maske filer.)
  12. Nederst angives eller gennemse den ønskede mappe, der skal bruges som save bibliotek.
  13. Tryk "Format Data" for at læse billedfiler (ved hjælp af tiffread2.m kode udviklet af Francois Nedelec, findes på: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), at behandle data, og oprette en * . mat-fil i den angivne mappe. Denne fil vil fungere som input til ProcessTimeSeries GUI.
  14. Gentag trin 2,4-2,13 for det sæt af film for hver etape position.

3.. Spor Celler og slægter gennem tiden med ProcessTimeSeries GUI og krofatter id og Lineage Opgaver (figur 5)

  1. Kør ProcessTimeSeries.m fil i Matlab for at åbne sporing GUI. Indstil følgende parametre efter åbning afGUI:
    • "Chamber højde" ("File I / O" panel, øverst til venstre) - dette indikerer højden af ​​det kammer, hvor cellerne er fanget. Det bruges som en begrænsning i tilnærme celle volumen som en 3D ellipsoide baseret på større og mindre akse af cellen regionen 8.
    • "Um / pixel" ("File I / O" panel) - omregningsfaktoren at kalibrere pixel til um afstand i billederne så tværsnitsareal og volumen kan beregnes på um 2 og um 3, hhv.
    • "Filtre panel" (under "File I / O" panel) - set minimum og maksimum parametre bortfiltrere junk regioner i masken: "Area" - region område i pixel, "Ecc" - excentricitet faktor mere cirkulær som → 0 , "SF" - formfaktoren, mere cirkulær som → 1.
  2. Klik på "Hent billeder" i "File I / O" panel, og vælg *. Måtten datafil af interesse output ved FormatData GUI. Regionen masken (og eventuelle sub-regionens masker) gælder for hver farvekanal, Og en række forskellige målinger er foretaget (tabel 1). Datafilen er derefter gemt. (Hvis du ilægger en fil i ProcessTimeSeries fra en tidligere session, vil den spørge, om analysen skal genstartes fra starten ADVARSEL:.. Dette vil slette ethvert spor datasikring allerede afsluttet og behandle data, som om det var frisk fra FormatData GUI Hvis uheld genstartes hurtigt Ctrl + C i MATLAB kommando vinduet for at forhindre tidligere kurateret *. mat fil fra at blive overskrevet.)
  3. Dernæst spore cellerne. I "Track Cells" panel (ved siden af ​​"filtre" panel), skal du indstille følgende parametre:
    • "Max Displacement" - den maksimale afstand i pixels en celle kan rejse mellem tilstødende billeder, før at blive stemplet som en anden celle. Højere forskydning betyder algoritmen kan redegøre for celler bevæger sig mere, men det øger også kompleksiteten i matchende celle regioner folkemængder. Vi starter ved 12, og falde, hvis der opstår en fejl i at spore (se trin 3.4).
    • "Minimum Length" - minimum antal forekomster for en celle spor at blive betragtet som en gyldig dataserier. Vi bruger 1 for at forhindre fjernelse af nogen reelle spor, men dette kan forhøjes, hvis segmentering resultater i kortvarige, falske region spor.
    • "Frame hukommelse" - maksimalt antal på hinanden følgende frames en celle region kan forsvinde og gives samme id, når det vender tilbage. Hvis det forsvinder i længere tid end "Frame hukommelse", vil det blive givet en ny ID ved returnering. Vi bruger 2 at tillade regionerne blive savnet af segmentering til 2 frames før han vendte tilbage.
  4. Klik på "Track Cells" at spore regioner fra en ramme til den næste ved hjælp af regionens centroids (Blair og Dufresne MATLAB implementering af Crocker, Grier og Weeks IDL rutine, findes på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) at tildele slægter for nyligt optræder knopper, og for at gemme dataene. Slægter automatisk tildelt af minimizing afstande mellem formodede knopper og potentielle mødre i hver ramme. (Hvis en fejl vises i MATLAB kommando vinduet grundet "vanskelige kombinatorik", fald "Max Displacement" og gentag tracking.) Ændre parameter i popup-vinduer, som er nødvendige for dine data.
  5. Kuratere dårligt segmenterede regioner og fejl i id eller slægt opgaver ved hjælp af de forskellige grafiske værktøjer eller genvejstaster (vist i et popup-vindue ved at trykke på knappen ovenfor "Selected Cell Information" panel).
    • Slider, "Forrige billede", "Next Image" (Ctrl + venstre / højre) - bruge til at vise og flytte mellem rammer i billedet serien.
    • "Image #" - viser rammen antallet af det aktuelle billede i venstre og højre akser. Flyt til en bestemt ramme ved at skrive dens nummer i den rigtige "Image #" redigere kassen.
    • "Delta frame" - viser forskellen i ramme nummer mellem højre og venstre akser (Δ = højre - venstre).
    • "Hide Text" (Ctrl + T) - skifter mellem visning af celle-id'er ide rigtige akser eller ej.
    • "Skjul Labels" (Ctrl + L) - skifter mellem visning af celle-id'er i venstre akser eller ej.
    • "Mask" popup-menuen - vælg mellem visning uden maske, det cellulære maske eller enhver brugerdefinerede sub-masker til visning i panelet til venstre.
    • "Overlay" popup-menuen (Ctrl 1-9) - vælger at vise BF og farvelag i den venstre ramme. Vis BF er den eneste, der slår BF lag til eller fra i begge akser. Skifter mellem visning eller ej, ved at vælge overlay navn i menuen igen ("*" angiver overlay vises). Ctrl +1 skifter BF overlay med 2-9 skifter farven overlejringer i orden.
    • "Set Colors" - bruger til at bestemme farve til overlay display. Et popup vindue vil forespørgslen som fluorescens kanal til at indstille, og så farvepaletten vises for bruger definition.
    • "Rediger Regioner og Tracks" panel - disse styrer effekt ændringer på cellen regionen maske og trace information:
      • "Opdater tracks" (Ctrl + U) - bruger til at retildele celle ID'er. Hvis der ikke celler selekteres i rette akser, vil den grafiske bede om en celle-id til at ændre. Når ID X ændres til Y, vil alle fremtidige forekomster af X ændres til Y, og eventuelle fremtidige forekomster af den aktuelle Y, vil blive skiftet til X. (Lejlighedsvis én celle vil skifte frem og tilbage mellem 2 ID'er, gentagne gange. Dette skyldes sporing forsøger at rumme flere ID'er i et oversegmented region snarere end en fejl i opdateringen ID-funktionen.) Flere celler kan vælges og deres id'er ændres samtidigt, men sørg for at give hver et unikt id. Hvis du vil tildele et område til et id, som ikke findes i den aktuelle fil, skal du indtaste "0", og man vil blive genereret. Brug Ctrl + W til at bytte de ID'er to markerede celler.
      • "Slet valgte Tracks" (Ctrl + D) - brug for at slette den markerede celle eller flere celler regioner i det nuværende højre akser ramme. (Hvis der ikke celler er markeret, vil bede om ID.) Hvis du permanent sletter alle forekomster af et ID spor, markere feltet ved siden af ​​Delete Selected Tracks knap (tekst vil skifte til "Slet ALL"). Dette er nyttigt til at komme af vedvarende junk regioner, men først tjek fremtidige rammer for at sikre, ID skifter ikke til et gyldigt celle eller knop region.
      • "Flet Regioner" (Ctrl + A eller M) - udglatter og kombinerer celle regioner. Klik på en celle eller celler i de rette akser for at vælge (region bliver rød hvis valgt). Fletning på én region vil morfologisk tæt at udfylde revner eller små mangler klumper ved hjælp af en skiveformet element. Sammenlægningen af ​​to eller flere nærliggende regioner vil kombinere dem i én region og give de laveste ID til den nye region. Dette er nyttigt for over-segmenterede regioner (ofte, når cellerne har store vacuoles).
      • "Tegn region" - brug musen til at trække en region i den rigtige akser, hvor de ønskede, og dobbeltklik for at afslutte. Giv et unikt id ikke er til stede i datasættet (mellem 1 og 65535). Annuller ved at trykke på delete på tastaturet.
    • "Lineage Tracking" panel - efter sporing,slægt opgaver genereres automatisk. Når nye ID-regioner synes, den nye celle-id vises i pink og en rød streg til moderen region. Nye regioner for store til at være knopper eller for langt væk fra potentielle mødre vises i grøn og er tildelt en mor ID "NaN" ("ikke et tal", se tabel 2). Regioner eksisterede på det første tidspunkt have en mor ID "0". For at rette individuelle opgaver, indtast mor og opløbet id'er i teksten redigere felter og klik på "Fix". For at slette en celle mor, indtast "0" som moderen. En hurtigere metode er at vælge to regioner i det rigtige billede, og tryk på Ctrl + F. Dette vil automatisk tildele ældre regionen som moderen og nyere region som datter, mens sletning eventuelle eksisterende mor opgaver for datteren celle. ADVARSEL: Hvis du klikker "Beregn slægter" på noget tidspunkt vil genberegne alle afstamning opgaver, herunder dem, som brugeren tidligere har kurateret.
    • "Selected Cell Information" panel - "Get jegnfo "vil vise nogle målinger af de regioner, valgt i de rigtige akser." Målinger ... "giver brugeren mulighed for at bestemme, hvilke målinger der vises (samt definere standard liste for andre operationer som" Eksporter data "). Kan bruges at bestemme de korrekte ID'er og lineages (fx hvis celle X har en knop på tidspunkt t, er det sandsynligvis ikke har en anden opløbet på tidspunktet t + 5 min).
    • "Gem ændringer" (Ctrl + S) - opdaterer * måtten fil, som afspejler brugerens ændringer.. Bruger ofte (der er ingen fortryd funktion)!
    • "Generer Plots" - åbner GeneratePlots GUI. Bruges til hurtigt at plotte udvalgte variable information og simple beregninger for encellede regioner markeret i højre akser af ProcessTimeSeries GUI, deres gennemsnit, eller gennemsnittet af alle regioner i hver ramme. Denne GUI kan beregne ru første derivater, men sørg for at angive det korrekte tidsinterval øverst til venstre. Plots kan være output til et tal for at spare ved at trykke på "Generate Figure".
    • Ordentligt kuratere data: flette nogen oversegmented regioner slette regioner ikke indfange hele cellen, være sikker på mor-opløbet relationer er korrekt tildelt (en rød streg mellem dem på tidspunktet for opløbet fremkomst, hvor opløbet ID er pink, se Tabel 2), og fjerne eventuelle grønne ID'er ved fastsættelse af ID, tildele regionen en mor, tildele nogen mor ("0"), eller slette regionen. Bud data vil blive tilføjet til den, moderen under den endelige analyse, så ikke flette en knop region til sin mor (det vil føre til unøjagtige volumen skøn).
    • Efterse data for hver frame op til sidste gang af interesse, men det er ikke påkrævet af hele tidsserier hvis du ikke bruger de senere frames.
    • Sørg for at gemme ændringerne.
    • Gentag trin 3,1-3,7 for *. Mat-fil for hver etape position.

4.. Eksport af data til analyse

  1. Blot at eksportere rå region målinger for hver celle gennem time, push "Eksporter data". Målingerne af interesse kan vælges i GUI, der åbnes, og de vil være output i en mellemrums-adskilt *. Txt-fil med variable navne som kolonneoverskrifter.
  2. At analysere tidsserier for hele celler over tid, beregne celle-cyklus information, og tage derivater, push "Time Series Analysis". Et vindue vil åbne tillader udvælgelse af målingerne af interesse og input analyseparametre (figur 6).
  3. Indtast det sidste tidspunkt kurateret i GUI (alle efterfølgende rammer vil blive ignoreret). Den standard udjævning og celle-cyklus opgave parametre fungerer godt for vores haploid og diploide stammer afbildet i 5 min intervaller, men disse skal muligvis ændres for de bedste resultater. (Kontroller, at parameterværdierne er passende ved manuelt at bestemme spirende og division tid til en test datasæt og sammenligne med udførelsen af ​​den automatiske algoritme.)
  4. Når alle parametre er indstillet, tryk på "Analyze" til:
    1. Construct arrays til hver rå måling og trække baggrundsniveauet (målt som den gennemsnitlige intensitet af den ikke-celle område af den første ramme i hver fluorescerende film, eller kan angives at tage højde for gennemsnitlig autofluorescens per celle pixel).
    2. Montér en spline til de udvalgte målinger for at fjerne højfrekvent målestøj (som omtalt i 9).
    3. Automatisk at bestemme opløbet opståen og celledeling gange for hver celle baseret på ændringer i hældningen af volumen tidsserier som diskuteret i 9.. Opløbet målinger vil derefter blive tilføjet til mors målinger mellem fremkomsten og division hver cyklus for en sammenhængende hel celle tidsserier. En normaliseret cellecyklusfremadskriden vil også blive beregnet fra 0 til 2 fra division til division.
    4. Montér en udjævning spline at tage stabil 1. og 2. derivater af de udvalgte målinger. (Med henblik på veldefinerede derivater, tidsseriergøres kontinuerligt tværs division ved at flytte data for følgende cellecyklus at opfylde endpoint for den foregående cyklus.)
    5. Output rå og glattede tidsserier for alle regioner og hele celler udglattet, kontinuerlig og differentieret tidsserier som en matrix for hver måling. Det første element er en farve index for baggrundssubtraktion, resten af ​​den første række holder celle-id'er, resten af ​​den første kolonne er rammen nummer og de resterende elementer holde tidsserier for hver enkelt celle i en kolonne med hver række svarende til rammen i den første kolonne. En lignende vifte af cellecyklusfremadskriden tidsserier og slægt information vil også være output. Array "LineageArray" indeholder en tabel med hver række repræsenterer en mor-bud forholdet og den første gennem femte søjler er mor-id, opløbet ID, ramme af første knop region, anslået spirende rammen, og skønnet division ramme. Data eksporteres til en *. Mat fil (MATLAB datafil).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et positivt resultat og analyseret eksperiment vil give det meste kontinuerlig tidsserier for enlige hele celler med realistisk tildelt opløbet opståen og division tider. Som et eksempel, udførte vi den ovennævnte protokol med en haploide gærstamme udtrykke en integreret kopi af Cerulean fluorescerende protein (CFP), drevet af den konstitutive ADH1-promotoren at observere, hvordan vækst og global ekspression kan variere over tid i enkelte celler (tabel 4, Y47 ). Vi kørte tidsserie analyse for at få hel celle (figur 7A) målinger over tid, og et afhængighed af cellecyklus dukker for både volumen og udtryk, som findes i 9.. Efter knopdannelse øger den samlede kombinerede volumen (mor + BUD) hurtigere end før opløbet fremkomsten (i overensstemmelse med 8,16), mens proteinkoncentration eller gennemsnitlig intensitet, aftager lidt (figur 7B og 7C). Stigningen i kombineret integrationTed protein (volumen x koncentration i dette tilfælde) også accelererer efter spirende (figur 7D). Sammenligning til moderen regionen alene (Figur 7B & D), disse resultater viser vigtigheden af korrekt indarbejde opløbet bidrag til hele cellen måling og fremhæve behovet for en ordentlig knop dannelse og division tid opgaver. Som vi har rapporteret 9, kan vi bruge den differentierede tidsserier til at beregne en øjeblikkelig relative mRNA niveau M (t) og transskription sats A (t), som begge også stige efter spirende (figur 7E og 7F):

Ligning 1
hvor P (t) er det totale protein på tidspunkt t og γ M er mRNA nedbrydningshastigheden 0,04 min -1

Evnen til at generere stabile tid derivater af målinger tidsserier gavner også kinetikstudier. Vi bruger en gærstamme udtrykke en observerbar, højtflyvende transskription faktor omskiftelig transskription aktivitet (tabel 4, Y962). Føreren transskriptionsfaktor phosphatudtørring vej, Pho4p, kontrolleres via nucleo-cytoplasmatisk lokalisering som respons på ekstracellulære fosfat concentratio n 18. Vi erstattet det DNA-bindende domæne af Pho4p med tetR, som binder tet operon (tetO), og C-terminalt fusioneret den nye transkriptionsfaktor til en gul fluorescerende protein til at skabe Pho4-tetR-YFP 9.. Ved at skifte til fosfat niveauet i perfusioner medierne kunne vi så skifte udtryk for en integreret FFP drevet af en syntetisk promotor bestående af 7 Teto bindingssteder and CYC1 minimal promotor (7xtetOpr-CFP). En tidsserie analyse viser, når transkriptionsfaktoren er lokaliseret til kernen (med en fusion af RFP og kerneprotein Nhp2p at skabe en RFP baserede nukleare sub net maske som i trin fra 2,9 til 10), og når målgenet starter og stopper transkription (figur 8). Ved at analysere den afledte serier over tid, kan aktivering og deaktivering tidspunkter af målet promotoren i hver enkelt celle udledes selv når koncentrationen af ​​den stabile fluorescerende reporter er høj.

Figur 1
Figur 1. Skematisk af protokollen. Protokollen beskriver trin for 1) microfluidic kultur, 2) fluorescens, time-lapse mikroskopi, 3) dataanalyse og

Figur 2
Figur 2. FormatData GUI. Interfacet bruges til at importere, format og segmentoplysninger billeddata for senere beregninger og besigtiges. Tal angiver protokollen trin, der svarer til hver komponent. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. SegTest GUI. Interfacet bruges til at teste celle segment ation parametre og visuelt bekræfte segmentering nøjagtighed som i trin 2.7.

Figur 4
Figur 4.. ColorThreshTest GUI. Interfacet bruges til at teste intensiteten tærsklen til for at skabe et subcellulært maske fra den valgte fluorescenskanalen som i trin 2.10.

Figur 5
Figur 5. ProcessTimeSeries GUI. Interfacet anvendes til at måle, spore visuelt inspicere og redigere celle regioner og afstamning opgaver. Tal angiver protokollen trin svarer til hver komponent.target = "_blank"> Klik her for at se større figur.

Figur 6
Figur 6.. AnalysisParams GUI. Interfacet bruges til at indtaste parametre, der kræves for tidsserieanalyse som i trin 4.3 og 4.4.

Figur 7
Figur 7. Encellede tidsserier af en haploide gær udtrykker ADH1 PR-CFP i mikrofluid kultur gennem flere generationer. (A) Bright felt (øverste række) og FFP (nederste række) mikrofotografier er vist på de angivne tidspunkter for en celle hele eksperimentet . For segmenteret mor celle (blå outline) og knopper (grønne kontur), er den tilstødende helcelle skitseret i rødt. Rå mor og knop (B) volumen og (C) proteinkoncentration tidsserier var glattet at fjerne måling støj, og (D) integreret CFP fluorescens blev beregnet som produktet af volumen og koncentration. Hele cellen (rød) kurve er forlænget forbi division til en løbende total, der er let at montere på en differentiabel spline tværs af afdelinger (B og D). (E) i forhold mRNA niveau, og (F) øjeblikkelige transkription sats beregnes ved hjælp af ligningerne (1-2) og spline fit i (D).

Figur 8
Figur 8. Promotor transskription rate respons på nucleo-cytoplasmatiskshuttling af en Pho4-YFP fusion i enkelte gærceller. (A) Mikrografer fra de fire angivne erhvervelse kanaler er vist for en celle med en omstillelig YFP-kondenseret Pho4-tetR transaktivator at (B) lokaliseres RFP-mærkede kerne i reaktion til lav fosfat og (C) drev udtryk for en 7xtetOpr-CFP reporter. (D) De udledte transskription renteændringer med lokalisering i gennemsnit (sort linje) og på enkelt-celle niveau (rød og magenta linjer hvor rød repræsenterer den tilstødende celle region skitseret i rødt i A). Skarpe fald i FFP udtryk i B sammenfaldende med celledeling, når nogle protein er tabt for datteren celle.

Måling Name Beskrivelse
Time Billede stelnummer
Area Samlet antal of pixels omfattende regionen
Volumen (4/3) πabc, hvor a = ½ storakselængde på området, b = ½ lilleakse længde og c = b eller ½ "Chamber højde" (hvad der mindre)
(X) _ (Y) betyder Mean pixelintensitet for regionen maske (Y) i farvekanal (X)
(X) _ (Y) median Median pixelintensitet for regionen maske (Y) i farvekanal (X)
(X) _ (Y) std Standardafvigelse for pixel intensiteter for regionen masken (Y) i farvekanal (X)
(X) _ (Y) IQR Kvartilafstand af pixel intensiteter for regionen masken (Y) i farvekanal (X), 75 percentil - 25 percentilværdi
(X) _ (Y) T20pct Mean intensitet for de øverste 20% af pixel intensiteter for region maske (Y) i farvekanal (X). Brugful i sammenligning med den næste måling at bestemme subcellulær lokalisering uden en sub net maske.
(X) _ (Y) B80pct Mean intensitet for den nederste 80% af pixel intensiteter for region maske (Y) i farvekanal (X). Nyttige i forhold til den foregående måling at bestemme subcellulær lokalisering uden en sub net maske.
(X) _ (Y) M50pct Mean intensitet for den midterste 50% af pixel intensiteter for region maske (Y) i farvekanal (X)
(X) _cellint Integreret fluorescens farvekanal (X) (gennemsnitlig pixelintensitet x volumen) for hele cellen (mor og enhver opløbet)
(Z) Raw Rå tidsserier data output ved "Time Series Analysis" for variabel (Z)
(Z) Smooth Spline-udglattet rå tidsserier data output ved "Time Series Analysis" for variabel (Z)
(Z) Hel Helcelle (mandet + vedlagte opløbet (Z) Rawsmooth) tidsserier data output ved "Time Series Analysis" for variabel (Z)
(Z) Cont Helcelle tidsseriedata gjort kontinuerligt på divisioner ("running total") output ved "Time Series Analysis" for variabel (Z)
(Z) WhSmooth Spline-udglattet (Z) Hele celle tidsserier data output ved "Time Series Analysis" for variabel (Z)
(Z) ddt Første gang derivat af spline-udjævnet (Z) Hele celle tidsserier data output ved "Time Series Analysis" for variabel (Z)
(Z) d2dt2 Anden gang derivat af spline-udjævnet (Z) Hele celle tidsserier data output ved "Time Series Analysis" for variabel (Z)

Tabel 1. Måling variable nomenklatur i ProcessTimeSeries GUI.

Celle-id farve Lineage status
gul tildelte mor
pink nye opløbet (rød linje til formålsbestemte mor)
grøn nej tildelte mor

Tabel 2. Celle-id farvekode for afstamning tildelingsstatus.

File Name Beskrivelse
FormatData.m Datainput GUI at formater film og segmenter BF billeder til behandling i ProcessTimeSeries.m
FormatData.fig FormatData GUI vindue layout
BFsegment.m BF segmentering modul, med extractregions2.m og segmentregions.m
SegTest.m Segmentering kvalitetstest GUI
SegTest.fig SegTest GUI vindue layout
extractregions2.m Første komponent af BF segmentering modul til at identificere regioner
segmentregions.m Anden del af BF segmentering modul til at adskille og ren celle regioner
color2submask.m Fluorescens-baserede sub net maske segmentering modul
ColorThreshTest.m Fluorescens-baserede tærskel maske testning GUI
ColorThreshTest.fig ColorThreshTest GUI vindue layout
tiffread2.m Trækker data *. TIF eller *. STK filer til brug i Matlab
imalign.m Billede registrering ved hjælp af 2D krydskorrelation
ProcessTimeSeries.m Databehandling GUI, der sporer regioner, tildeler slægter og muliggør visuel korrektion af fejl. Også giver GUI-baseret plotte kapacitet og udgange hel-celle tidsseriedata
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUI vindue layout
cleanMask.m Fjerner maske regioner baseret på parametre i ProcessTimeSeries GUI
track.m Tracks celle regioner baseret på regionens centroids
OptimizeLineages.m Lineage opgave modul afgør optimale mor opløbet relationer baseret på fysisk afstand og tidligere og fremtidige spirende begivenheder
getClosestObjects.m Finder naboceller for hver ny celle-id (BUD)
SelectVariables.m Måling valg GUI til at vælge variabler af interesse
SelectVariables.fig SelectVariables GUI vindue layout
GeneratePlots.m Plotning GUI for data i ProcessTimeSeries vindue
GeneratePlots.fig GeneratePlots GUI vindue layout
AnalyzeCellSeries.m Tidsserieanalyse modul bestemmer celledeling tid og udsender helcelle målinger som beskrevet i teksten
assignDivisionsInf2.m Tildeler opløbet spire og celledeling tider
AnalysisParams.m Cell tidsserieanalyse parameter input
AnalysisParams.fig AnalysisParams GUI vindue layout

Tabel 3. Podninger fil beskrivelser.

Strain id Genotype (W303-baseret) Henvisning
Y47 MAT en leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19
Y962 MAT en ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9

Tabel 4. Gærstammer anvendt i denne undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ovennævnte protokol beskriver en enkel metode til at opnå og analysere fluorescens tidsseriedata med begrænset erfaring i microfluidics eller softwareudvikling. Det tillader en at opnå time-lapse fluorescens film af enkelt gærceller, udtrække relevante celle størrelse og udtryk målinger kapellan sporing og slægt opgaver og analysere adfærden for hele celler over tid ved hjælp af en kommercielt tilgængelig mikrofluid kultur enhed og en alsidig grafisk bruger (GUI). Mens eksperimentelle, segmentering og sporing skridt er blevet kontaktet på forskellige måder tidligere 11,13,14 er ovennævnte procedure designet til at gøre disse teknikker mere tilgængelig for et bredere udsnit af biologi samfund. Mens ovenstående procedure er optimeret til en bestemt microfluidic kultur enhed, kan den samlede analyse tilpasses tilsvarende enheder som off-the-shelf mikrofluid kultur teknologier bliver billigere og mere tilpasses. FundamEntally, segmentering og regionens måling algoritmer vi anvender ligner eksisterende metoder 13,14, men de podninger software tilføjer muligheden for at visuelt kuratere region tracking og slægt opgaver og til at tildele celle-cyklus faser præcist. Begge disse funktioner er afgørende for korrekt beregning af time-derivater af dataserier.

Der er flere trin i protokollen, som i væsentlig indflydelse på kvaliteten af ​​de resulterende tidsseriedata. Oprindeligt overbelaste kultur kammer med celler vil falde perfusion i kammeret (især mærkbar i kinetiske eksperimenter, hvor kammer refresh tid er vigtig), og tilgroning vil forekomme tidligere i eksperimentet tidsforløbet. Dette kan bedst undgås ved at starte med lavere celle belastningstryk for kortere tider og gradvist stigende ene eller begge indtil en passende celledensitet opnås. Stage position valg for billeddannelse er en beslægtet og lige så vigtigt betragtedebejde. Kendskab til den fordobling tid af stammen, planen, hvor mange celler vil være i billedrammen over tid og foregribe, hvordan fortrængning vil påvirke medierne diffusion. Ti dispergerede celler vil vokse til ti mikrokolonier, men ti celler oprindeligt grupperet sammen vil vokse ind i en enkelt stor koloni (vi har bemærket næringsstoffer diffusionsbegrænsninger ved 6 psi til centrum af en koloni, når det er større end ~ 14 celler i diameter) . Ekstra indsats på upstream protokoltrin letter også manuel datasikring senere, og forbedrer produktionen tidsserier. Sørg pladen er fast monteret i scenen og bruge billedet registrering mulighed i FormatData GUI at langt forbedre nøjagtigheden i automatisk sporing enkelte celler gennem tiden. Tilbring tid i at vælge de bedst mulige segmentering parametre også for at reducere antallet af fejl, der kræver opmærksomhed. Den tracking software fungerer bedst med svag oversegmentation af celle regioner snarere end undersegmentation fordi genforene ensplit celle er en enklere opgave end at tegne linjer at opdele regioner imidlertid øget oversegmentation øger fejl i slægt opgaver på grund af tilstedeværelsen af ​​falske, nye regioner. Desuden skal du sørge for, at alle mor-opløbet relationer ordentligt tildeles således, at målingerne for hele cellen vil være nøjagtige. Hvis en knop er savnet ved en kategorisering eller vokser uden for billedet grænsen, overveje slutter moderens dataserier for at forhindre falske resultater. Dette gøres nemt ved at ændre moderen regionen til et unikt id (Indtast ID "0") på fejlagtige rammen, og ved hjælp af "Slet ALL" funktion til at fjerne alle fremtidige forekomster af det nye id. Meget opmærksom på disse skridt vil i høj grad øge nøjagtigheden af ​​de rå tidsseriedata.

At etablere gyldig fortolkning af data output ved at trykke på "Time Series Analysis", anbefaler vi et par ekstra undersøgelser. Kontroller opløbet fremkomsten og division tider er nøjagtigt baseret på brugerens-input parametre. Manuelt registrerer spirende og division gange for en test film sæt og sammenligne med algoritmen resultater. Til visuelt estimere tiden cytokinese fuldfører mellem en mor og datter, kigge efter deres grænse til smalle og mørkere. (NB:. En test stamme med et fluorescens-mærkede nucleus hjælpemidler i manuel observation af division tid En anden metode ville være at fluorescensmæssigt markere plasmamembranen og kigge efter kløften mellem mor og datter celler til at lukke.). Også kontrollere, om den samlede fluorescens efter en celle bedre beregnes som den gennemsnitlige region intensitet multipliceret med volumen (når fanget lys stammer fra en tynd tværsnit af cellen) eller som den integrerede fluorescens over regionen (når fanget lys stammer fra hele cellen). Hvis fluorescens profil på tværs af en celle svarer kurven for en semi-ellipse beskrevet af de større og mindre akser område 7, fanget lys stammer fra hele cellen, og den samlede fluorescens ShoUld beregnes som (middel intensitet) x (område). I vores tilfælde til 63X med en dybdeskarphed meget mindre end cellens højde, er fluorescens profil forholdsvis flad og total fluorescens beregnes som (middel intensitet) x (volumen). En anden overvejelse er fotoblegning af fluoroforen. Softwaren mener ikke fotoblegning i analysen, og dermed fluorescens tidsserier output kun udgør det observerbare reporter. Fotoblegning processer stærkt afhængige erhvervelse indstillinger og tidsinterval anvendes til at opnå fluorescens billeder, karakteren af ​​fluoroforen, og forskellige andre eksperiment-specifikke parametre. Fotoblegning må heller ikke være godt beskrevet ved en enkel, første ordens rate udtryk, der forhindrer en generel algoritme til dens behandling. Vi har derfor ikke højde for fotoblegning i tidsserien output, men den analytiske metode kan anvendes til at måle kinetikken af ​​denne proces til at hjælpe brugeren fortolkning. Endelig vælger smoothing parametre er egnede til den observerede tidsserier. Ideelt set vil udglatning splines eliminere højfrekvent målestøj samtidig bevare reelle funktioner i dataene. De parametre, der kræves for at opnå dette afhænger af egenskaberne ved det særlige tidsserier og kan variere fra eksperimenter.

Softwaren blev beregnet til at være fleksible for analyse af forskellige time-lapse mikroskopi data. Ethvert antal farvekanaler kan medtages, og enhver kan bruges til at skabe en sub-region maske. Mens de algoritmer fungerer godt for film af spirende gærceller, bør mange af de funktionaliteter udvides til film af andre organismer som godt. Region måling (bortset volumen), sporing og datasikring kun afhænger af cellens maske og er således fleksible. Den segmentering, slægt opgaven, celledeling beslutsomhed og tidsserieanalyse moduler kan selvstændigt tilpasses til specifikke behov. Derudover, end snarere med det medfølgende SEgmentation modul, kan en præ-segmenteret maske film være input, og fase-kontrast eller differential interferens kontrast billeder kan erstatte lyse felt. Den GUI kan derefter bruges primært til at spore og kuratere id og afstamning opgaver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi takker Emily Jackson, Joshua Zeidman og Nicholas Wren for kommentarer til softwaren. Dette arbejde blev finansieret af GM95733 (til NM), BBBE 103316 og MIT opstart midler (til NM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307, (5717), 1962-1965 (2005).
  3. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  4. Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8, (5), 431-433 (2012).
  5. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332, (6028), 475-478 (2011).
  6. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123, (6), 1025-1061 (2005).
  7. Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332, (6028), 472-474 (2011).
  8. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38, (8), 2676-2681 (2010).
  9. Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. Submitted (2013).
  10. Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5, (9), e239 (2007).
  11. Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1, (1), 2005.0024 (2005).
  12. Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, (7131), 46-51 (2007).
  13. Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3, (1), e1468 (2008).
  14. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4, (2), 175-181 (2007).
  15. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9, (1), 62-66 (1979).
  16. Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23, (12), 1408-1422 (2009).
  17. To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327, (5969), 1142-1145 (2010).
  18. O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271, (5246), 209-212 (1996).
  19. Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304, (5678), 1811-1814 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics