Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescentie time-lapse microscopie is uitgegroeid tot een krachtig instrument in de studie van vele biologische processen op het eencellige niveau. In het bijzonder, films beeltenis van de temporele afhankelijkheid van genexpressie geven inzicht in de dynamiek van de regelgeving, maar er zijn veel technische uitdagingen voor het verkrijgen en analyseren van fluorescentie films van enkele cellen. We beschrijven hier een eenvoudig protocol met behulp van een in de handel verkrijgbaar microfluïdische cultuur apparaat om dergelijke gegevens te genereren, en een MATLAB-gebaseerde, grafische gebruikersinterface (GUI)-gebaseerde software pakket om de fluorescentie beelden te kwantificeren. De software segmenten en tracks cellen, kan de gebruiker visueel curator fouten in de gegevens, en wijst geslacht en afdeling tijd uitgevoerd. De GUI analyseert verder de tijdreeks whole cell sporen en hun eerste en tweede afgeleiden produceren. Terwijl de software is ontworpen voor S. cerevisiae, moet zijn modulariteit en veelzijdigheid laat het to dienen als een platform voor het bestuderen van andere celtypes met enkele wijzigingen.

Introduction

Single-cell analyse van genexpressie heeft bevorderd ons begrip van de vele aspecten van genregulatie. Statische momentopnamen van fluorescerende reporter expressie met behulp van flowcytometrie of microscopie nuttige informatie over de verdeling van eencellige expressie, maar missen de geschiedenis en evolutie van tijdreeksen gegevens die nodig zijn om gen-expressie dynamiek rechtstreeks te informeren. Fluorescentie time-lapse microscopie presenteert een middel om zowel single-cell metingen en hun geschiedenis te verkrijgen. Verschillende experimentele en analytische technieken ontwikkeld voor het verkrijgen en kwantificeren films van fluorescente reporter expressie, waardoor meegeven inzichten in genregulatie kenmerken (zie 1 voor een overzicht), zoals cel-cel variaties 2,3, bacteriële persister vorming 4, transcriptie initiatie en rek 5, transcriptie barsten 6,7, cel-cyclus afhankelijkheid 8,9 en erfelijkheid 10. Echter, OBTaining kwaliteit eencellige fluorescentie tijdreeks zijn aanzienlijke technische uitdagingen in kweken van een monolaag van cellen in een controleerbare omgeving en in high-throughput kwantificering van de fluorescentie verkregen films. Hier beschrijven we een procedure voor het verkrijgen en analyseren van fluorescentie films van S. cerevisiae zonder vereiste ervaring in celkweekinrichting vervaardiging of in software ontwikkeling (figuur 1).

Ten eerste, we detail een voorbeeld protocol om fluorescentie tijdreeksen films te genereren voor gist uiten van een of meer fluorescerende reporters. Hoewel op maat microfluïdische cultuur kamers zijn gebouwd en met succes ingezet eerder 11-13, maken we gebruik van een in de handel verkrijgbaar microfluïdische apparaat uit CellAsic (Hayward, CA). Het systeem beperkt cellen monolaag groei en maakt continue controle van de perfusie milieu. De microscopie protocol presenteren we een eenvoudig middel om tl verkrijgenlingen films van gist, maar elke gewijzigde experimentele protocol (een aangepaste cultuur apparaat, alternatieve media omstandigheden, enz.) gelijkblijvende fluorescentie film gegevens van enkele gistcellen kunnen worden vervangen.

Vervolgens schetsen we de analyse van de films met behulp van een grafische gebruikersinterface (GUI)-based softwarepakket in MATLAB (Mathworks, Natick, MA), ook wel de GUI voor snelle analyse van Fluorescentie Time Series (enten), om tijdreeksen gegevens te extraheren voor enkele cellen. Enten heeft dezelfde eigenschappen als de veelzijdige, open-source softwarepakket Cell-ID 14 in het segmenteren en het bijhouden van cellen en in het extraheren van fluorescentie-intensiteit en geometrische informatie. Echter, enten geeft belangrijke aanvullende functies. Ten eerste, het biedt gemakkelijke interactieve bewerking van segmentatie en het bijhouden van de resultaten om de nauwkeurigheid van gegevens, in plaats van alleen statistische venstertijd van uitschieters regio sporen na analyse controleren. Bovendien geldt voor de analyse automatically aanwijzen afkomst en cel-cyclus bezienswaardigheden van gist. Bepalen wanneer moeder en dochter delen om twee onafhankelijke cellen regio's te vormen is cruciaal voor het bepalen van whole cell (moeder met inbegrip van eventuele aangesloten bud) metingen in de hele celcyclus 8. De suite bestaat uit drie modules om deze taken te volbrengen. De eerste segmenten cel regio's op basis van het contrast tussen gericht en ongericht helderveld afbeeldingen en kan de gebruiker segmentatie parameters te definiëren en visueel te testen. De tweede tracks (. Met Blair en Dufresne's MATLAB implementatie van de Crocker et al. IDL routine, beschikbaar op: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) en meet cel regio's door de tijd; wijst lineages automatisch, en maakt visuele inspectie en foutcorrectie. Een eenvoudige plotten GUI is opgenomen om een ​​query eencellige eigenschappen. De derde module toeschrijft bud opkomst en divisie times en voert gehele cellen tijdreeksgegevens en hun eerste en tweede afgeleiden (zoals besproken in 9). De analyse module voert de data als een ruimte gescheiden tekstbestand voor verdere studie in de statistische software van keuze. Dus het pakket kan de gebruiker hoge kwaliteit tijdreeksen extraheren via een grafische interface. We hebben deze methode om real-time transcriptiesnelheden schatten enkele gist cellen als functie van de celcyclus 9. Hoewel de modules zijn geoptimaliseerd voor gist, de parameters of, indien nodig, de vrij beschikbare code worden aangepast voor andere organismen en beeldtypen. Segmentatie, tracking, en het geslacht toewijzing algoritmen kan specifiek type beeldvorming toegewezen en de betreffende organisme. De bestaande algoritmes kan worden vervangen, maar nog steeds de GUI interface die gebruiksvriendelijke visuele controle en correctie van segmentatie en het bijhouden van fouten die steevast bedrijfspensioenvoorziening mogelijk maaktr met elk algoritme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Verkrijgen van fluorescentie microscopie Films van Single gistcellen groeien in een Microfluidic Kamer

  1. Inoculeer 1 ml SC media (gedefinieerd synthetisch medium met 2% glucose en volledige complement van aminozuren) met cellen van een vers groeiende plaat en incubeer de cultuur overnacht ~ 16 uur op een roller trommel bij 30 ° C. Bereid de cultuur zodanig dat de uiteindelijke OD 600 nm is ~ 0.1 voor de vroege log-fase groei.
  2. Verdun de starter cultuur als nodig en teruggroeien 1 ml in een frisse reageerbuis een extra 6-8 uur aan OD 600 nm = 0,1. Dit levert cellen groeien in een voedselrijke steady state bij een dichtheid die geschikt zijn voor het laden in de microfluïdische apparaat. (Als alternatief, vervang stappen 1,1-1,2 de procedure nodig is om cellen te bereiden die nodig zijn voor het experiment.)
  3. Bereid een Y04C microfluïdisch cultuur plaat uit CellAsic: verwijder de scheepvaart oplossing, spoel de putten met steriel water, en het gebruik van het ONIX perfusiesysteem doorstromingwater door putten 1-6 op 6 psi gedurende 5 minuten om de kanalen te spoelen. Dan, vloeien voort uit het laden en 8 bij 6 psi gedurende 10 seconden (het laden kanaal heeft veel hogere debieten en dienen afzonderlijk te worden gespoeld).
  4. Verwijder het water uit alle putjes en te vervangen door 250 ul SC in de inlaat putten 1-6 en 50 ul van de cultuur van stap 1.2 in cel laden goed 8. (Als alternatief, plaats de gewenste media in de inlaat putten 1-6 voor experimenten waarbij schakelen tussen verschillende omstandigheden.)
  5. Verzegel de ONIX spruitstuk aan de plaat, en beginnen priming de kanalen en kweekkamer met die uit inlaat putjes 1-6 bij 6 psi gedurende 2 min gevolgd door ten minste 5 min bij 6 psi van alleen de inlaat en die het uitgangspunt media voor de experiment. Vloeien deze voortdurend tot stap 1.7.
  6. Bereid de microscoop voor het experiment. We maken gebruik van een Zeiss Axio Observer.Z1 groothoek microscoop met een Cascade II back-illuminated EMCCD camera (Photometrics, Tuscon, AZ) en een Lumen 200 metal-halide arclamp (PRIOR Scientific, Rockland, MA) voor fluorescentie excitatie verzwakt tot 10% fotobleken te voorkomen. Om de schakeltijd nodig is om te verwerven in meerdere fluorescerende kanalen te minimaliseren, koppelen we een enkele, triple-bandpass dichroinefilter kubus passende excitatie / emissie filters voor GVB, YFP en RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; set 89006) in externe, fast-switching filter wielen (Ludl Electronic Products, Novato, CA).
  7. Plaats een paar druppels immersie vloeistof op de doelstelling (indien nodig, gebruiken we een Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC), en monteer de microfluïdische apparaat stevig in het stadium van het omgekeerde microscoop. Het waarborgen van de plaat verschuift niet helemaal in de fase gedurende het experiment verbetert cell tracking tijdens de data-analyse. We tape gewoon de plaat naar het podium mount om te voorkomen dat haar verschuiven.
  8. Richten op de meest linkse derde van de eerste kweekkamer (indien de schachthoogte is kleinste) via een van de ingebedde positietie markers. Schakel stroom uit de media inlaat goed, en de stroom van cel laden en 8 bij 6 psi in 5 sec uitbarstingen. Verplaats de etappe naar rond de cultuur kamer voor cellen kijken. Verhoog het laden stroom tijd en druk totdat gewenste cel dichtheid wordt bereikt, maar niet te overladen en verstopping van de meest linkse slagboom waar vers medium komt in de kamer.
  9. Begin voortvloeien uit de media inlaat putje met het starten van media op 6 psi.
  10. In MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) of andere microscopie automatisering en controle-software, het inrichten van een multi-dimensionale overname om meerdere foto's te nemen op meerdere podium posities in de tijd. Stel het aantal en de interval tussen de tijdstippen. Selecteer meerdere podium posities met ~ 10 cellen per (meer zal snel overladen). We gebruiken meestal 5 min tussenpozen beeld tot 16 posities, die elk ~ 11 seconden nodig voor het ingaan op elk tijdstip.
  11. Stel de overname, zodat in elk stadium positie op elk tijdstip the programma: richten op het doorgelaten licht helder veld (BF) beeld met behulp MetaMorph de ingebouwde autofocus-methode (uitvoering van de autofocus als een op maat geschreven dagboek aan het begin van elke fase positie biedt meer controle over de scherpstelling nauwkeurig); verwerven van de BF afbeelding bij 1 pm tot het brandvlak (fp); verwerven van een BF onscherp (BFOOF) image op -4 um tot de fp (te gebruiken op maat geschreven tijdschriften om de focus te veranderen zoals vereist tussen de beelden), en het verwerven van een grijswaarden afbeelding voor elke fluorescerende reporter op de fp met instellingen die zijn geoptimaliseerd voor snelle acquisitie met minimale fotobleken.
  12. Eventueel verkrijgen achtergrond en nuanceringskorrektie afbeeldingen voor elke fluorescerende reporter in een gebied van de kweekkamer zonder cellen.
  13. Bereid de stroom programma voor het experiment in de ONIX besturingssoftware. Tegelijkertijd begint de acquisitie programma in MetaMorph en de stroom-programma in het ONIX besturingssoftware.
  14. Aan het einde van het experiment, corrigeren unzelfs achtergrond en schaduwen in de fluorescerende beelden (indien nodig), en eventueel combineren. tif-bestanden voor elke afbeelding kanaal in elke fase positie in een. stk filmbestand (bv. create BF, BFOOF, CFP, YFP en RFP films voor positie 1 ).

2. Formaat en Segment Gegevens voor Tracking Met behulp van de FormatData GUI in MATLAB (figuur 2)

  1. Voer het FormatData.m bestand in MATLAB om de gegevensinvoer GUI te openen. Op de top, opgeven of blader naar de map met de beeldbestanden naar de data directory te stellen, en gebruik vervolgens de GUI om de data types en beeldbestanden die in het experiment te specificeren.
  2. Naar rechts, selecteert u het keuzerondje naast "Time-lapse" om aan te geven welk type analyse uit te voeren. "Time-lapse" zal het beeld-serie als een tijdreeks (bijv. een film van cellen groeien in een microfluïdische kamer) te behandelen. "Static" zal elk beeld series behandelen als een set van snapshots genomen uit een populatie (bijvoorbeeld meerdere foto's genomen op diflende posities op een enkele dia sample). In deze enten versie, kan time-lapse gegevens voor meerdere posities worden verwerkt, maar als een apart bestand voor elke positie (zie stap 2.14).
  3. Vink het vakje voor het registratie te corrigeren voor onnauwkeurige podium bewegingen door elk beeld verschuiven in de films om schijnbare cel beweging te minimaliseren binnen het frame. We raden dit als het sterk verbetert bijhouden (verminderen handleiding spoor curation later), maar zal willekeurig, "witte ruis" pixelwaarden toe aan waar afbeeldingen zijn verschoven aan de grens in te vullen. Het kan ook worden geselecteerd na het bekijken van gesegmenteerde BF afbeeldingen in stap 2.7 of op enig punt tot stap 2.13.
  4. Vink het vakje "Bright Field" in het "Data Channels"-paneel. Klik op "Select" om het recht op de BF afbeeldingen te laden. Voor *. TIF-bestanden, selecteert u alle BF beelden die overeenkomen met een enkele film door de Shift-toets tijdens het selecteren, en klik op 'Openen'. Voor *. STK-bestanden, selecteert u gewoon de BF stapel belang. Als de beelden zijn succesvolledig erkend, zullen de bestandsnamen in het popup-menu worden weergegeven aan de rechterkant in de "Data Recognized" paneel. . Voor * TIF-bestanden, moet u de bestandsnamen worden weergegeven in de juiste volgorde (bestanden op te slaan met sequentiële namen tijdens acquisitie - BF_t001, etc.).
  5. Controleer de "Bright Field (onscherp)" vakje en gebruik de "Select" knop als in stap 2.4 op de BFOOF bestanden, die in de pop-up om de juiste zal worden vermeld laden. (BFOOF verkregen als BF -4 urn ten opzichte van de fp op 63X segmenten ook.)
  6. Vink het vakje "Cell Mask". In het "Masker Source"-paneel, selecteert u het keuzerondje naast "Segment BF". Druk op de knop "Parameters" om de segmentatie GUI te openen. (Of selecteer een pre-gesegmenteerd masker film door het selecteren van het keuzerondje naast de "Mask File Select" knop, het indrukken van de laatste, en het selecteren van de film als in stap 2.4. In dit geval wordt een BFOOF film niet nodig is, en kunt doorgaan naar stap 2.8.)
  7. Stel de verschillende segmentatie parameters (beschrijvingen van elk kunnen worden bekijkened door op "Parameters"), en test de segmentatie kwaliteit door te klikken op "Test" (Figuur 3). Succes gesegmenteerd regio's zal zijn groen met magenta grenzen. Zorg ervoor dat u de schuifregelaar gebruiken om meerdere tijdstippen in de film te controleren. Wanneer de segmentatie bevredigend is, selecteer "Gereed" om de segmentatie parameters terug naar de FormatData GUI.
  8. Vink het vakje "Color Images". Voer de kleur naam voor de eerste fluorescerende afbeelding kanaal in de tekst edit box, en druk vervolgens op "Add and Select" om de kleur-bestanden als in stap 2.4 laden. De kleur naam wordt toegevoegd aan de keuzelijst aan de linkerkant, en de bestandsnamen worden toegevoegd aan de tabel rechts. Als een fout is gemaakt bij het laden van de kleur-bestanden, selecteert u de kleur naam in de keuzelijst aan de linkerkant en klik op "verwijderen Kleur" om de bestanden te verwijderen. Herhaal dit voor elk kleurkanaal.
  9. Als extra deelgebied maskers op een van de fluorescerende kleuren (bijv. fluorescerend gemerkte nucleus → nucloor regio masker) gewenst zijn, vinkt u het vakje "Color Mask". Zo niet, ga dan naar stap 2.12. In de "Color Mask Source"-scherm, voert u de subregio masker naam in de tekst edit box. Kies een kleur uit het popup-menu in de "Color Mask Source"-paneel (vereist de kleur te zijn toegevoegd in stap 6) en druk op "Parameters" een drempel testen van GUI te openen.
  10. Druk de "Auto-drempel" om de drempel volgens methode Otsu's 15 automatisch te bepalen, en het beeld zal worden gewezen op de gebieden boven de drempel (Figuur 4) bewaard gebleven. De drempel kan handmatig worden ingesteld met behulp van het invoervak. Gebruik de schuifbalk om te bevestigen de drempel is geschikt voor alle tijdstippen. Wanneer u tevreden bent, duw "Klaar" om de drempel terug te keren naar de FormatData GUI.
  11. Push "toevoegen en Segment" aan de subregio masker met behulp van de drempel module toegepast op de geselecteerde kleur beelden te genereren. De kleur masker naam en de bron zal worden weergegeven in de tabel aan de linkerkant, met de relevante recognized bestandsnamen te zien zijn in de tabel rechts. (Als alternatief, push "toevoegen en selecteren" om pre-made subregio masker bestanden te laden.)
  12. Aan de onderkant, opgeven of blader naar de gewenste map te worden gebruikt als de opslag directory.
  13. Druk op "Gegevens opmaken" om de beeldbestanden (met behulp van de tiffread2.m code ontwikkeld door Francois Nedelec, beschikbaar op: lees http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), de data-proces, en een * . mat bestand in de opgegeven map. Dit bestand zal dienen als input voor de ProcessTimeSeries GUI.
  14. Herhaal stap 2,4-2,13 voor de set van films voor elke fase positie.

3. Track Cellen en Geslachten door de tijd met ProcessTimeSeries GUI, en Curate ID en Lineage Opdrachten (figuur 5)

  1. Voer het ProcessTimeSeries.m bestand in MATLAB om de tracking GUI te openen. Stel de volgende parameters na het openen van deGUI:
    • "Kamerhoogte" ("File I / O"-paneel, linksboven) - dit geeft de hoogte van de kamer waarin de cellen zijn opgesloten. Het wordt gebruikt als een beperking in benadert celvolume als 3D ellipsoïde basis van grote en kleine as van de cel regio in 8.
    • "Micrometer / pixel" ("File I / O" paneel) - de omrekeningsfactor pixel kalibreren urn afstand in de afbeeldingen zodat dwarsdoorsnede en volume worden berekend urn en 2 urn 3 respectievelijk.
    • "Paneel Filters" (hierna "File I / O"-paneel) - set minimale en maximale parameters om te filteren op ongewenste gebieden in het masker: "Ruimte" - regio gebied in pixels; "Ecc" - excentriciteit factor, meer ronde als → 0 , "SF" - vormfactor, meer cirkelvormig als → 1.
  2. Klik op "Afbeeldingen laden" in het "File I / O"-paneel, en selecteer het *. Mat databestand van belang uitgevoerd door de FormatData GUI. De regio masker (en eventuele sub-regio maskers) wordt toegepast op elk kleurkanaalEn een aantal verschillende metingen (Tabel 1). De data bestand wordt dan opgeslagen. (Als het laden van een bestand in ProcessTimeSeries van een vorige sessie, zal het vragen of de analyse moet worden gestart vanaf het begin. LET OP:. Dit zal een track curation reeds voltooide wissen en de behandeling van de gegevens alsof het vers van de FormatData GUI waren als per ongeluk weer, snel Ctrl + C in de MATLAB commando venster om te voorkomen dat de eerder samengesteld *. mat bestand wordt overschreven.)
  3. Vervolgens volgen de cellen. In de "Track Cellen" paneel (naast het "Filters" paneel), stelt u de volgende parameters:
    • "Maximum Displacement" - de maximale afstand in pixels van een cel kan reizen tussen aangrenzende beelden alvorens te worden bestempeld als een andere cel. Hoger verplaatsingsmiddelen het algoritme kan goed zijn voor cellen bewegen meer, maar het verhoogt ook de complexiteit van het matching-cel gebieden in menigten. We beginnen om 12 en dalen als er een fout optreedt bij het volgen (zie stap 3.4).
    • "Minimum Length" - minimum aantal keren voor een cel trace te worden beschouwd als een geldige data-serie. We maken gebruik van 1 tot verwijdering van een echte sporen te voorkomen, maar dit kan worden verhoogd als segmentatie resultaten in kortlevende, onechte regio sporen.
    • "Lijstgeheugen" - maximum aantal opeenvolgende frames een cel gebied kan verdwijnen en worden gegeven op dezelfde ID als het rendement. Als het verdwijnt langer dan "Lijstgeheugen", zal het worden gegeven een nieuwe ID bij terugkomst. We gebruiken 2 om regio's te missen door segmentatie van 2 frames alvorens terug te keren.
  4. Klik op "Track Cellen" om de regio's te volgen van het ene frame naar de volgende met de regio centroïden (Blair en Dufresne MATLAB implementatie van Crocker, Grier, en Weeks IDL routine, beschikbaar op: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , om lijnen toe te wijzen voor nieuw verschijnen knoppen, en om de gegevens op te slaan. Lijnen worden automatisch toegewezen door de minimizing afstanden tussen vermeende knoppen en potentiële moeders in elk frame. (Als er een fout wordt weergegeven in de MATLAB commando venster te wijten aan "moeilijke combinatoriek", afnemen "Maximum Displacement" en herhaal tracking.) Parameters wijzigen in het pop-upvensters als nodig is voor uw gegevens.
  5. Kapelaan slecht gesegmenteerde regio's en fouten in ID of lineage opdrachten met behulp van de verschillende GUI gereedschap of sneltoetsen (in een popup venster getoond door op de knop hierboven "Geselecteerde Cell Information"-paneel).
    • Slider, "Vorige Afbeelding", "Next Afbeelding" (Ctrl + links / rechts) - gebruiken voor het weergeven en bewegen tussen frames in de afbeelding serie.
    • "Beeld #" - geeft het framenummer van het huidige beeld in de linker en rechter assen. Verplaatsen naar een opgegeven kader door het intikken haar nummer in de juiste "Beeld #" vak te bewerken.
    • "Delta frame" - toont het verschil in framenummer tussen de rechter en linker assen (Δ = rechts - links).
    • "Tekst verbergen" (Ctrl + T) - schakelt tussen weergave van de cel IDs inrechts assen of niet.
    • "Hide Labels" (Ctrl + L) - schakelt tussen weergave van de cel-id's in de linker-assen of niet.
    • "Mask" popup-menu - kiezen tussen de weergave van geen masker, de cellulaire masker, of een door de gebruiker gedefinieerde sub-maskers voor weergave in het linkervenster.
    • "Overlay" popup-menu (Ctrl 1-9) - kies voor BF en kleur lagen in het linker frame weer te geven. Toon BF is de enige die de BF laag schakelt aan of uit in beide assen. Schakelen tussen weergave of niet door het selecteren van de naam overlay in het menu opnieuw ("*" gemarkeerde overlay wordt weergegeven). Ctrl +1 schakelt BF overlay, met 2-9 schakelen de kleur overlays in orde.
    • "Set Kleuren" - gebruiken om de kleur te bepalen voor overlay display. Een popup venster zal bevragen die fluorescentie kanaal in te stellen, en vervolgens het kleurenpalet zal verschijnen voor de definitie gebruiker.
    • "Wijzig Regio's en Tracks" paneel - deze controles effect veranderingen op de cel regio masker en trace informatie:
      • "Update tracks" (Ctrl + U) - te gebruiken omcell-ID's toe te wijzen. Als er geen cellen worden geselecteerd in de juiste assen, zal de GUI vragen om een ​​cel ID te wijzigen. Wanneer ID X wordt gewijzigd in Y, zullen verdere ritten van X worden veranderd Y en toekomstige instances van de huidige Y geschakeld naar X. (Soms een cel heen en weer schakelen tussen 2 IDs herhaaldelijk. Deze is te wijten aan het bijhouden van het proberen om meerdere ID's te ontvangen in een oversegmented regio in plaats van een fout in de update-ID-functie.) Meerdere cellen kunnen worden geselecteerd en hun ID's tegelijk veranderd, maar zorg ervoor dat elk een unieke ID te geven. Een regio om een ​​ID dat niet bestaat in het huidige bestand toewijzen, voert u "0" en men zal worden gegenereerd. Gebruik Ctrl + W om de ID's van twee gemarkeerde cellen verwisselen.
      • "Delete Selected Tracks" (Ctrl + D) - gebruiken om de geselecteerde cel of meerdere cellen regio's in het huidige recht assen kader te verwijderen. (Als er geen cellen zijn geselecteerd, zal vragen om ID.) Als u alle instanties van een ID-trace definitief te verwijderen, vinkt u het vakje naast de Delete knop Selected Tracks (tekst verandert naar "Delete ALL"). Dit is handig voor het wegwerken van hardnekkige junk regio's, maar raadpleeg eerst toekomstige kaders om ervoor te zorgen dat de ID niet overschakelen naar een geldige cel of bud regio.
      • "Merge Regio's" (Ctrl + A of M) - verzacht en combineert cel regio. Klik op een cel of cellen in de juiste assen te selecteren (regio worden rood wanneer geselecteerd). Samenvoegen op de ene regio zal morfologisch sluiten in scheuren of kleine ontbrekende stukjes met behulp van een schijfvormig element in te vullen. Samenvoegen van twee of meer nabijgelegen regio's zal ze combineren in een regio en de laagste ID om de nieuwe regio. Dit is handig voor over-gesegmenteerde gebieden (vaak wanneer cellen hebben grote vacuolen).
      • "Trek regio" - Gebruik de muis om een ​​gebied te tekenen in de juiste assen op de gewenste plaats en dubbelklik om af te maken. Bieden een unieke ID niet in de dataset (tussen 1 en 65535). Annuleren door op Delete op het toetsenbord.
    • "Lineage Tracking" paneel - na het volgen,lineage opdrachten worden automatisch gegenereerd. Wanneer nieuwe ID's verschijnen, verschijnt de nieuwe cel ID in roze en een rode lijn getrokken naar de moeder regio. Nieuwe regio's te groot zijn om te toppen of te ver weg van potentiële moeders verschijnen in groen en krijgen een moeder ID van "NaN" ("geen enkele", zie tabel 2). Bestaan ​​op het eerste tijdstip regio's hebben een moeder ID van "0". Om individuele opdrachten op te lossen, voert u de moeder en de kiem id's in de tekst te bewerken velden in en klik op "Fix". Aan de moeder van een cel wissen, voert u "0" als zijn moeder. Een snellere methode is om twee regio's in het juiste beeld te selecteren en druk op Ctrl + F. Dit zal automatisch de oudere regio als de moeder en de nieuwere regio als de dochter toe te wijzen, terwijl het wissen van alle reeds bestaande moeder opdrachten voor de dochtercel. LET OP: Als u op "Bereken Geslachten" te allen tijde zal herberekenen alle lineage opdrachten, waaronder die van de gebruiker eerder samengesteld.
    • "Geselecteerde Cell Information"-paneel - "Get Info "zullen sommige metingen van de gekozen in de juiste assen weergegeven worden. 'Metingen ..." kan de gebruiker bepalen welke metingen worden weergegeven (alsmede bepalen de standaardlijst voor andere operaties zoals "Gegevens exporteren"). Kan gebruikt worden om de juiste ID's en geslachten (bijvoorbeeld als cel X heeft een knop op tijdstip t, het waarschijnlijk niet nog een knop hebben op tijdstip t + 5 min.) te bepalen.
    • "Save Changes" (Ctrl + S) - updates het * mat bestand naar de gebruiker wijzigingen.. Vaak gebruik (er is geen undo-functie)!
    • "Plots Genereer" - opent de GeneratePlots GUI. Gebruikt om snel te plotten geselecteerde variabele informatie en eenvoudige berekeningen voor eencellige gebieden gemarkeerd in de juiste assen van de ProcessTimeSeries GUI, hun gemiddelde of het gemiddelde van alle regio's in elk frame. Deze GUI kan berekenen ruwe eerste afgeleiden, maar zorg ervoor dat de juiste tijdsinterval opgeven in de linkerbovenhoek. Plots kan output naar een cijfer voor het opslaan door op "Generate figuur" te zijn.
    • Om gegevens correct curator: samenvoegen elke oversegmented regio; elke regio de hele cel niet vastleggen schrappen; zeker zijn moeder-bud relaties goed zijn toegewezen (een rode lijn verschijnt tussen hen ten tijde van de kiem ontstaan, toen de kiem ID is roze, zie tabel 2), en afschaffen van groene id's door de vaststelling van de ID, het toewijzen van de regio een moeder, het toewijzen geen moeder ("0"), of verwijderen van de regio. Bud gegevens zullen aan die van de moeder worden toegevoegd tijdens de uiteindelijke analyse dus niet fuseren een knop regio om haar moeder (dit zal leiden tot onnauwkeurige volume schatting).
    • Visueel gegevens voor elk frame naar het laatst plaats inspecteren, maar het is niet noodzakelijk de hele tijdreeksen alleen gebruiken als de latere frames.
    • Zorg ervoor dat u wijzigingen op te slaan.
    • Herhaal de stappen 3,1-3,7 voor de *. Mat-bestand voor elke fase positie.

4. Gegevens exporteren voor analyse

  1. Om gewoon te exporteren ruwe regio metingen voor elke cel door time, push "Gegevens exporteren". De metingen van belang kan worden geselecteerd in de GUI die wordt geopend, en zij zullen output in een door spaties gescheiden worden *. Txt-bestand met variabele namen als kolomkoppen.
  2. Om de tijdreeksen voor gehele cellen in de tijd te analyseren, berekenen cel-cyclus informatie, en neem derivaten, push "Time Series Analysis". Er wordt een venster geopend waarin de selectie van de metingen van de belangstelling en inbreng van de analyse parameters (Figuur 6).
  3. Voer het laatste tijdstip gecureerd in de GUI (alle volgende frames worden genegeerd). De standaard smoothing en cel-cyclus opdracht parameters werken goed voor onze haploïde en diploïde stammen afgebeeld in 5 min. intervallen, maar hiervan moet mogelijk worden aangepast voor het beste resultaat. (Controleer dat de parameterwaarden geschikt door het handmatig bepalen ontluikende en divisie tijd voor een test data set en te vergelijken met die van de geautomatiseerde algoritme.)
  4. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, push "Analyze" naar:
    1. Construct arrays voor elke ruwe meting en aftrekken van de achtergrond (gemeten als de gemiddelde intensiteit van de niet-celoppervlakte van het eerste frame in elke fluorescerende film, of kunnen worden gespecificeerd om rekening te houden gemiddelde autofluorescentie pixel per cel).
    2. Breng een glad spline de geselecteerde metingen hoogfrequente meetruis (zoals besproken in 9) elimineren.
    3. Automatisch bepalen bud ontstaan ​​en celdeling tijden voor elke cel gebaseerd op veranderingen in de helling van het volume tijdreeks besproken 9. De kiem metingen wordt dan toegevoegd aan de metingen van de moeder tussen de opkomst en de divisie elke cyclus voor een aaneengesloten gehele cel tijdreeks. Een genormaliseerde celcyclusprogressie wordt ook berekend variërend van 0 tot 2 per divisie.
    4. Monteer een smoothing spline om stabiele 1 e en 2 e derivaten van de geselecteerde metingen. (Met het oog op goed gedefinieerde derivaten, tijdreeksworden continu over deling door het verschuiven van gegevens voor de volgende celcyclus aan het eindpunt van de vorige cyclus voldoen gemaakt.)
    5. Output rauw en afgevlakte tijdreeksen voor alle regio's, en de hele cel afgevlakte, continue, en gedifferentieerde tijdreeksen als een array voor elke meting. Het eerste element is een kleurindex achtergrond aftrek, de rest van de eerste rij bevat cel IDs, de rest van de eerste kolom is het framenummer, en de overige elementen houdt de tijdreeks voor elke cel in een kolom met elke rij overeenkomt met het frame in de eerste kolom. Een soortgelijke reeks van celcyclusprogressie tijdreeksen afstamde informatie zal ook worden uitgevoerd. De array "LineageArray" bevat een tabel met elke rij die een moeder-knop relatie en de eerste tot en met vijfde kolommen zijn moeder ID, bud ID, het frame van de eerste kiem regio, geschat ontluikende frame, en ingeschatte verdeling frame. Gegevens worden geëxporteerd naar een *. Mat-bestand (MATLAB gegevensbestand).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een succes uitgevoerd en geanalyseerd experiment zal vooral continue tijdreeks opleveren voor enkele hele cellen met realistisch toegewezen bud opkomst en verdeeldheid tijden. Als voorbeeld, voerden we het bovenstaande protocol met een haploïde giststam expressie een geïntegreerde kopie van Cerulean fluorescerend eiwit (CFP) aangedreven door de constitutieve ADH1 promoter te zien hoe groei en wereldwijde expressie kunnen op termijn in afzonderlijke cellen (Tabel 4, Y47 ). We liepen de tijdreeks analyse om volledige cel te verkrijgen (figuur 7A) metingen in de tijd, en een afhankelijkheid van de celcyclus komt voor zowel in volume en expressie zoals gevonden in 9. Na de knopvorming, de totale gecombineerde volume (moeder + knop) sneller dan voorheen bud opkomst toeneemt (consistent met 8,16), terwijl eiwitconcentratie, of gemiddelde intensiteit, daalt licht (figuren 7B en 7C). De stijging van de gecombineerde integratieted eiwit (volume en concentratie in dit geval) versnelt ook na ontluiken (figuur 7D). Te vergelijken met de moeder regio alleen (Figuur 7B & D), deze resultaten tonen het belang van de juiste integratie van bud bijdragen aan de gehele cel meten en benadrukken de noodzaak van een goede knopvorming en verdeeldheid tijd opdrachten. Zoals reeds gemeld 9, kunnen we de gesplitste tijdreeksen gebruikt om een momentane relatieve mRNA M (t) en transcriptiesnelheid A (t), die beide ook toe na ontluiken (Figuur 7E en 7F) berekenen:

Vergelijking 1
waar P (t) de totale eiwit op tijdstip t en γ M de mRNA afbraaksnelheid 0.04 min -1

Het vermogen om stabiele tijdsafgeleiden van de meting tijdreeksen genereren ook ten goede komt kinetische studies. We maken gebruik van een giststam uiten een waarneembare, hersenschim transcriptiefactor met schakelbare transcriptie activiteit (tabel 4, Y962). De master transcriptiefactor van het fosfaat uithongering route, Pho4p, wordt gecontroleerd door middel van nucleo-cytoplasmatische lokalisatie in reactie op extracellulaire fosfaat concentratio n 18. Vervingen we het DNA-bindingsdomein van Pho4p met tetR, dat de tet operon (tetO) bindt en C-terminaal gefuseerd nieuwe transcriptiefactor een geel fluorescerend eiwit pHo4-tetR-YFP 9 maken. Door over te schakelen het fosfaatgehalte in de perfusie media, zouden we dan schakelen uitdrukking van een geïntegreerd GVB aangedreven door een synthetische promotor samengesteld uit 7 tetO bindingsplaatsen eennd de CYC1 minimale promoter (7xtetOpr-GVB). Een tijdreeksanalyse aangeeft wanneer de transcriptiefactor is gelokaliseerd in de kern (met een fusie van RFP en kerneiwit Nhp2p een RFP gebaseerde nucleaire submask zoals in stap 2,9-10 maken), en als het doelgen start en stopt transcriptie (figuur 8). Door het analyseren van de afgeleide tijdreeksen, kan activering en uitschakeltijden van de doelgroep promoter in elke cel worden afgeleid, zelfs wanneer de concentratie van het stabiele fluorescerende reporter hoog.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van het protocol. Het protocol beschrijft de stappen voor 1) microfluïdische cultuur, 2) fluorescentie, time-lapse microscopie, 3) data-analyse, en

Figuur 2
Figuur 2. FormatData GUI. De interface wordt gebruikt voor het importeren, formaat, en segment beeldgegevens voor latere berekeningen en visuele inspectie. Nummers geven het protocol stap overeenkomt met elke component. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. SegTest GUI. De interface wordt gebruikt om mobiele segment testen atie parameters en visueel bevestigen segmentatie nauwkeurigheid zoals in stap 2.7.

Cijfer 4
Figuur 4. ColorThreshTest GUI. De interface wordt gebruikt om de intensiteit drempel nodig is om een subcellulaire masker van het gekozen kanaal fluorescentie in stap 2.10 maken testen.

Figuur 5
Figuur 5. ProcessTimeSeries GUI. De interface wordt gebruikt voor het meten, bijhouden, visueel te inspecteren, en cel-regio en afkomst opdrachten bewerken. Nummers geven de stap protocol overeenkomstig elke component.target = "_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. AnalysisParams GUI. De interface wordt gebruikt om de parameters die nodig zijn voor de analyse van tijdreeksen als in de stappen 4.3 en 4.4 in te voeren.

Figuur 7
Figuur 7. Eencellige tijdreeksen van een haploïde gist expressie ADH1 pr-GVB in microfluïdische cultuur over meerdere generaties. (A) Bright veld (bovenste rij) en GVB (onderste rij) microfoto worden getoond op de aangegeven tijdstippen voor een cel gedurende het experiment . Voor de gesegmenteerde moeder cel (blauw outline) en de knoppen (groen overzicht), wordt de aaneengesloten gehele cel in rood. Rauwe moeder en bud (B) volume en (C) eiwitconcentratie tijdreeksen werden gladgestreken te meten ruis te verwijderen, en (D) geïntegreerd GVB fluorescentie werd berekend als het product van volume en concentratie. De hele cel (rood) spoor wordt uitgebreid verleden divisie aan een lopend totaal dat is eenvoudig te monteren op een differentiable smoothing spline tussen de verschillende divisies (B en D) te houden. Het (E) relatieve mRNA niveau (F) momentane transcriptiesnelheid wordt met de vergelijkingen (1-2) en de spline fit in (D).

Figuur 8
Figuur 8. Promotor transcriptie tarief reactie op nucleo-cytoplasmatischependelen van een pHo4-YFP fusie in enkele gistcellen. (A) Micrografen uit de vier aangegeven acquisitie kanalen worden getoond voor een cel met een schakelbare YFP-gefuseerde pHo4-tetR transactivator dat (B) lokaliseert de RFP-gemarkeerde kern in reactie te lage fosfaat en (C) drives expressie van een 7xtetOpr-GVB reporter. (D) De afgeleid transcriptie van koerswijzigingen met lokalisatie gemiddeld (zwarte lijn) en bij de single-cell niveau (rood en magenta lijnen, waarbij rood staat voor de aansluitende cel regio geschetst in het rood in A). Scherpe dalingen van de GVB-expressie in B samenvallen met de celdeling bij sommige eiwitten wordt verloren aan de dochtercel.

Meting Naam Beschrijving
Tijd Afbeelding framenummer
Gebied Totaal aantal of pixels omvattende de regio
Volume (4/3) πabc, waarbij a = ½ hoofdas lengte van streek, b = ½ kleine lengte-as, en c = b of ½ "Kamerhoogte" (afhankelijk van welke kleiner is)
(X) _ (Y) betekenen Bedoel pixelintensiteit voor de regio masker (Y) in kleur kanaal (X)
(X) _ (Y) mediaan Mediaan pixelintensiteit voor de regio masker (Y) in kleur kanaal (X)
(X) _ (Y) std Standaarddeviatie van pixel intensiteiten voor de regio masker (Y) in kleur kanaal (X)
(X) _ (Y) IQR Interkwartielbereik van pixel intensiteiten voor de regio masker (Y) in kleur kanaal (X), 75 ste percentiel - 25 ste percentiel waarde
(X) _ (Y) T20pct Gemiddelde intensiteit voor de top 20% van de pixel intensiteiten voor de regio masker (Y) in kleur kanaal (X). Gebruikenful in vergelijking met de volgende meting de subcellulaire lokalisatie bepalen zonder submask.
(X) _ (Y) B80pct Gemiddelde intensiteit van de onderste 80% van pixelintensiteiten voor regio masker (Y) in kleurkanaal (X). Nuttig in vergelijking met de vorige meting de subcellulaire lokalisatie bepalen zonder submask.
(X) _ (Y) M50pct Gemiddelde intensiteit voor de middelste 50% van de pixel intensiteiten voor de regio masker (Y) in kleur kanaal (X)
(X) _cellint Geïntegreerde fluorescentie van kleurkanaal (X) (gemiddelde pixel intensiteit x volume) voor de gehele cel (moeder en eventuele aangesloten bud)
(Z) Raw Ruwe tijdreeks data output door "Time Series Analysis" voor variabele (Z)
(Z) Smooth Spline-afgevlakte ruwe tijdreeks data output door "Time Series Analysis" voor variabele (Z)
(Z) Whole Gehele cel (mandere + bijgevoegde bud (Z) Rawsmooth) tijdreeksen data output door "Time Series Analysis" voor variabele (Z)
(Z) Cont Gehele cel tijdreeksdata gemaakt continu op afdelingen ("lopend totaal") door de "Time Series Analysis" voor variabele (Z)
(Z) WhSmooth Spline-afgevlakte (Z) Whole cell tijdreeksen data output door "Time Series Analysis" voor variabele (Z)
(Z) ddt Eerste keer-derivaat van spline-afgevlakte (Z) Whole cell tijdreeksen data output door "Time Series Analysis" voor variabele (Z)
(Z) d2dt2 Tweede keer-derivaat van spline-afgevlakte (Z) Whole cell tijdreeksen data output door "Time Series Analysis" voor variabele (Z)

Tabel 1. Meetvariabele nomenclatuur in ProcessTimeSeries GUI.

Cell ID kleur Lineage-status
geel moeder toegewezen
roze nieuwe knop (rode lijn getrokken aan toegewezen moeder)
groen geen moeder toegewezen

Tabel 2. Cell ID kleurcode voor lineage toewijzingsstatus.

File Name Beschrijving
FormatData.m Gegevensinvoer GUI die formaten films en segmenten BF beelden voor verwerking door ProcessTimeSeries.m
FormatData.fig FormatData GUI window layout
BFsegment.m BF segmentatie module, met extractregions2.m en segmentregions.m
SegTest.m Segmentatie kwaliteit testen GUI
SegTest.fig SegTest GUI window layout
extractregions2.m Eerste component van BF segmentatiemodule om gebieden te identificeren
segmentregions.m Tweede component van BF segmentering module te scheiden en schoon cel regio
color2submask.m Fluorescentie-gebaseerde submask segmentatiemodule
ColorThreshTest.m Fluorescentie-gebaseerde drempel masker testen GUI
ColorThreshTest.fig ColorThreshTest GUI window layout
tiffread2.m Extracten data *. TIF of *. STK-bestanden voor gebruik in MATLAB
imalign.m Registratie beeld met behulp van 2D kruiscorrelatie
ProcessTimeSeries.m Gegevensverwerking GUI die regio volgt, wijst geslachten, en maakt visuele correctie van fouten. Biedt ook GUI-gebaseerde plotten vermogen en uitgangen whole-cell tijdreeksen
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUI window layout
cleanMask.m Elimineert masker regio op basis van parameters in ProcessTimeSeries GUI
track.m Tracks cel regio op basis van regio centroïden
OptimizeLineages.m Lineage opdracht module bepaalt optimale moeder-bud relaties gebaseerd op fysieke afstand en verleden en toekomst ontluikende gebeurtenissen
getClosestObjects.m Vindt buurman cellen voor elke nieuwe cel ID (knop)
SelectVariables.m Meting selectie GUI voor het kiezen van variabelen van belang
SelectVariables.fig SelectVariables GUI window layout
GeneratePlots.m Plotten GUI voor data in ProcessTimeSeries venster
GeneratePlots.fig GeneratePlots GUI window layout
AnalyzeCellSeries.m Tijdreeksanalyse module bepaalt celdeling tijd en verschaft volledige cel metingen zoals beschreven in de tekst
assignDivisionsInf2.m Wijst kiem spruit en celdeling tijden
AnalysisParams.m Cel tijdreeksanalyse inputparameter
AnalysisParams.fig AnalysisParams GUI window layout

Tabel 3. Enten bestand beschrijvingen.

Strain ID Genotype (W303-based) Verwijzing
Y47 MAT een leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19
Y962 MAT een ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pHo4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-GVB 9

Tabel 4. Giststammen gebruikt in deze studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het bovenstaande protocol beschrijft een eenvoudige methode om fluorescentie tijdreeksen gegevens te verkrijgen en te analyseren met een beperkte ervaring in microfluidics of in software ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om tijd-vervallen fluorescentie films van enkele gistcellen te verkrijgen; extraheren relevante celgrootte en metingen meningsuiting; kapelaan tracking en lineage opdrachten, en analyseren van het gedrag van de gehele cellen na verloop van tijd met behulp van een in de handel verkrijgbaar microfluïdische cultuur-apparaat en een veelzijdige grafische gebruikersinterface (GUI). Terwijl de experimentele, segmentatie, en het volgen stappen zijn benaderd op verschillende manieren eerder 11,13,14, wordt de bovenstaande procedure ontworpen om deze technieken toegankelijker voor een breder deel van de biologie community te maken. Terwijl de bovenstaande procedure is geoptimaliseerd voor een bepaald microfluïdische cultuur-apparaat, kan de algemene analyse worden aangepast aan soortgelijke apparaten als off-the-shelf microfluïdische cultuur technologieën goedkoper worden en meer aanpasbare. FundamEntally, de segmentatie en regio meting algoritmen die we gebruiken zijn vergelijkbaar met bestaande methoden 13,14, maar het enten software voegt de mogelijkheid om visueel curator regio tracking en lineage opdrachten en tot cel-cyclus fasen nauwkeurig toewijzen. Beide functies zijn cruciaal om nauwkeurig berekenen van de tijd-derivaten van gegevensreeksen.

Er zijn verschillende stappen in het protocol dat aanzienlijke invloed op de kwaliteit van de resulterende tijdreeksgegevens. Aanvankelijk overbelasting van de cultuur kamer met cellen zullen perfusie afnemen in de kamer (vooral merkbaar in kinetische experimenten waarbij kamer refresh tijd is belangrijk), en overgroei zal eerder in het experiment tijdsverloop optreden. Dit kan het best worden vermeden door te beginnen met de onderste cel laaddruk Bij kortere tijden en geleidelijk toenemende een of beide tot een geschikte celdichtheid wordt bereikt. Podium positie selectie voor beeldvorming is een verwante en even belangrijke overweking. Het kennen van de verdubbelingstijd van de stam, een plan hoeveel cellen zullen in het beeldframe in de tijd en te anticiperen op hoe verdringing zullen media diffusie beïnvloeden. Ten gedispergeerde cellen groeien in tien microkolonies maar tien cellen aanvankelijk samengevoegd zal groeien tot een enkele, grote kolonie (we nutriënten diffusiebeperkingen hebben opgemerkt bij 6 psi tot het centrum van een kolonie wanneer deze groter is dan ~ 14 cellen in diameter) . Extra inspanning in de upstream-protocol stappen vergemakkelijkt ook de handmatige data curation later, en verbetert de output tijdreeks. Zorg ervoor dat de plaat wordt vast gemonteerd in de etappe en het gebruik van de registratie-optie afbeelding in de FormatData GUI in automatisch volgen van enkele cellen door de tijd sterk verbeteren van de nauwkeurigheid. Breng tijd door in het kiezen van de best mogelijke segmentatie parameters ook om het aantal fouten die aandacht vereisen te verminderen. De tracking software werkt het best met een lichte oversegmentatie van cel regio's in plaats van undersegmentation omdat geremerged eensplit cel eenvoudiger wordt dan het tekenen van lijnen op gebieden verdelen, maar verhoogde oversegmentatie verhoogt fouten in lijn opdrachten door de aanwezigheid van valse, nieuwe gebieden. Bovendien, er zeker van zijn dat alle moeder-bud relaties correct zijn toegewezen, zodat de metingen voor de gehele cel nauwkeurig zal zijn. Als een knop wordt gemist door de segmentatie of groeit buiten de beeldgrens, beschouwen het beëindigen van de moeder gegevensreeksen om valse resultaten te voorkomen. Dit is eenvoudig te doen door het veranderen van de moeder regio om een ​​unieke ID (identificatie invoeren van "0") op de foutieve frame, en met behulp van de "ALL Delete"-functie op alle toekomstige exemplaren van de nieuwe ID te verwijderen. Veel aandacht aan deze stappen zal sterk toenemen van de juistheid van de ruwe tijdreeksgegevens.

Om geldige interpretatie van de data-output tot stand door op "Time Series Analysis", adviseren wij een paar extra vragen. Controleer bud opkomst en deling tijden worden nauwkeurig bepaald op basis van de door de gebruiker input parameters. Ontluikende en divisie keer handmatig op te nemen voor een test filmset en te vergelijken met het algoritme resultaten. Om visueel schatten de tijd cytokinesis voltooit tussen een moeder en dochter, op zoek naar hun grenzen te smal en donkerder. (NB:. Een test stam met een fluorescent gemarkeerde kern helpt bij handmatige observatie van verdeeldheid tijd Een andere methode zou zijn om fluorescent-markeren de plasmamembraan en zoek naar de kloof tussen moeder en dochter cellen te sluiten.). Controleer ook of de totale fluorescentie voor een cel beter wordt berekend als de gemiddelde regio intensiteit vermenigvuldigd met het volume (wanneer gevangen licht afkomstig is van een dunne doorsnede van de cel) of als de geïntegreerde fluorescentie over de regio (wanneer gevangen licht afkomstig is van de hele cel). Indien de fluorescentie profiel vertoont in een cel overeen met de kromming van een halve ellips beschreven door de grote en kleine assen van het gebied 7, gevangen licht afkomstig van de hele cel, en de totale fluorescentie should worden berekend als (gemiddelde intensiteit) x (gebied). In ons geval bij 63X met een scherptediepte minder dan celhoogte de fluorescentie profiel is relatief vlak en de totale fluorescentie wordt berekend als (gemiddelde intensiteit) x (volume). Een andere overweging is het fotobleken van de fluorofoor. De software houdt geen rekening fotobleken in de analyse, en dus de fluorescentie tijdreeks uitgang vertegenwoordigt slechts de waarneembare verslaggever. Fotobleken processen sterk afhankelijk van de verwerving instellingen en tijdsinterval gebruikt fluorescentiebeelden, de aard van de fluorofoor, en diverse andere proef-parameters te verkrijgen. Photobleaching ook mogelijk niet goed worden beschreven door een eenvoudige, eerste-orde snelheidsconstante expressie, die een algemeen algoritme voor zijn behandeling voorkomt. Daarom doen geen rekening fotobleken in de tijdreeks uitgang, maar de analysemethode kan worden gebruikt om de kinetiek van het proces te meten de interpretatie van de gebruiker te helpen. Tenslotte kiest smoothing parameters die geschikt zijn voor de waargenomen tijdreeks. Idealiter zal het vloeiend splines hoogfrequentie metingen te elimineren behoud werkelijke functies in de data. De parameters hiervoor noodzakelijk afhankelijk van de kenmerken van de specifieke tijdreeksen en kan variëren tussen experimenten.

De software is bedoeld om flexibel te zijn voor de analyse van de verschillende time-lapse fluorescentie microscopie gegevens. Elk aantal kleurkanalen kunnen geven en kan worden gebruikt om subgebied masker maken. Terwijl de algoritmen werken goed voor films van ontluikende gistcellen, veel van de functionaliteiten moeten uitbreiden om films van andere organismen ook. Regio meting (behalve volume), tracking, en curatie alleen afhangen van de cel masker en zijn dus aanpasbaar. De segmentatie, lineage opdracht, celdeling vastberadenheid, en tijdreeksen analyse modules kunnen onafhankelijk van elkaar worden aangepast aan specifieke behoeften. Bovendien, in plaats van de inbegrepen segmentation module, kan een pre-gesegmenteerd masker film worden ingevoerd, en fase-contrast of differentiële interferentie contrast beelden kunnen vervangen helderveld. De GUI's kan dan in de eerste plaats worden gebruikt voor het bijhouden en kapelaan ID en lineage opdrachten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

Wij danken Emily Jackson, Joshua Zeidman, en Nicholas Wren voor commentaar op de software. Dit werk werd gefinancierd door GM95733 (tot NM), BBBE 103.316 en MIT opstarten van fondsen (tot NM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307, (5717), 1962-1965 (2005).
  3. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  4. Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8, (5), 431-433 (2012).
  5. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332, (6028), 475-478 (2011).
  6. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123, (6), 1025-1061 (2005).
  7. Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332, (6028), 472-474 (2011).
  8. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38, (8), 2676-2681 (2010).
  9. Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. Submitted (2013).
  10. Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5, (9), e239 (2007).
  11. Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1, (1), 2005.0024 (2005).
  12. Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, (7131), 46-51 (2007).
  13. Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3, (1), e1468 (2008).
  14. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4, (2), 175-181 (2007).
  15. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9, (1), 62-66 (1979).
  16. Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23, (12), 1408-1422 (2009).
  17. To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327, (5969), 1142-1145 (2010).
  18. O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271, (5246), 209-212 (1996).
  19. Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304, (5678), 1811-1814 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics