L'acquisition de fluorescence Time-lapse films de levure bourgeonnante et analyse de la dynamique de cellules uniques en utilisant des greffes

Biology

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Summary

Nous présentons un protocole simple d'obtenir des films de microscopie par fluorescence de cellules de levure en croissance, et un logiciel GUI basée à extraire des données de séries chronologiques unicellulaires. L'analyse comprend lignée automatisé et l'affectation du temps de division intégrée à l'inspection visuelle et la conservation manuelle de données à chenilles.

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Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

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Abstract

Microscopie time-lapse fluorescence est devenu un outil puissant dans l'étude de nombreux processus biologiques au niveau d'une seule cellule. En particulier, les films dépeignant la dépendance temporelle de l'expression des gènes permettent de mieux comprendre la dynamique de sa réglementation, mais il ya beaucoup de défis techniques à obtenir et à analyser les films de fluorescence des cellules individuelles. Nous décrivons ici un protocole simple en utilisant un dispositif de culture microfluidique disponible dans le commerce pour produire ces données, et une interface graphique basée sur MATLAB utilisateur (GUI) basée sur logiciel pour quantifier les images de fluorescence. Les segments des logiciels et des cellules de pistes, permet à l'utilisateur de vicaire visuellement erreurs dans les données, et attribue automatiquement lignage et des temps de division. L'interface graphique analyse en outre la série temporelle afin de produire des traces de cellules entières, ainsi que leurs dérivées première et seconde de temps. Bien que le logiciel a été conçu pour S. cerevisiae, sa modularité et sa polyvalence devrait lui permettre de to servir de plate-forme pour l'étude d'autres types cellulaires avec quelques modifications.

Introduction

Analyse unicellulaire de l'expression génique a permis de mieux comprendre de nombreux aspects de la régulation des gènes. Instantanés statiques d'expression rapporteur fluorescent par cytométrie en flux ou microscopie fournissent des informations utiles sur la distribution de l'expression seule cellule, mais n'ont pas l'histoire et l'évolution des données de séries chronologiques nécessaires pour informer directement la dynamique de l'expression des gènes. Microscopie time-lapse fluorescence présente un moyen d'obtenir deux mesures unicellulaires et leur histoire. Diverses techniques expérimentales et analytiques ont été développées afin d'obtenir et de quantifier les films d'expression rapporteur fluorescent, conférant ainsi un aperçu des caractéristiques de régulation des gènes (cf. 1 pour une revue) tels que la variation de cellule de la cellule 2,3, la formation de persister bactérienne 4, transcription initiation et d'élongation 5, transcription éclatement 6,7, la dépendance du cycle cellulaire 8,9 et héritabilité 10. Cependant, obtaining série temporelle de fluorescence unicellulaire qualité implique des difficultés techniques importantes dans la culture d'une monocouche de cellules dans un environnement contrôlable dans la quantification et à haut débit des films de fluorescence acquises. Ici, nous décrivons une procédure pour obtenir et analyser des films de fluorescence de S. cerevisiae avec aucune expérience requise dans la fabrication du dispositif de culture cellulaire ou dans le développement de logiciels (Figure 1).

Tout d'abord, nous détaillons un protocole d'exemple pour produire des films de séries chronologiques de fluorescence pour levure bourgeonnante exprimant un ou plusieurs rapporteurs fluorescents. Bien que des chambres de culture microfluidiques personnalisés ont été construits et utilisés avec succès précédemment 11-13, nous utilisons un dispositif microfluidique disponible dans le commerce à partir de CellAsic (Hayward, CA). Le système confine à la croissance des cellules de la monocouche et permet un contrôle continu du milieu de perfusion. Le protocole de microscopie que nous présentons est un moyen simple d'obtenir Déessfilms rence de levure bourgeonnante, mais tout protocole modifié expérimental (un dispositif de culture personnalisée, les conditions de médias alternatifs, etc.) fournissant des données de films similaires fluorescence de cellules de levure simples peuvent être substitués.

Ensuite, nous présentons l'analyse des films en utilisant une interface utilisateur graphique (GUI) basée sur logiciel dans MATLAB (The MathWorks, Natick, MA), surnommé le GUI pour l'analyse rapide des séries chronologiques Fluorescence (greffes), pour extraire des données de séries chronologiques pour des cellules individuelles. GREFFES a des caractéristiques similaires à la polyvalente, logiciel open-source paquet Cell-ID 14 dans la segmentation et le suivi des cellules et dans l'extraction de l'intensité de fluorescence et de l'information géométrique. Toutefois, les greffes fournit d'importantes fonctionnalités supplémentaires. Tout d'abord, il offre une édition interactive facile de segmentation et le suivi des résultats afin de vérifier l'exactitude des données, plutôt que de simplement gating statistique des traces de la région aberrantes après analyse. En outre, elle étend l'analyse aux automatically désigné lignée et les points du cycle cellulaire d'intérêt de la levure bourgeonnante. Déterminer le moment où mère et fille se divisent pour former deux régions de cellules indépendantes est cruciale pour déterminer les mesures à travers le cycle cellulaire 8 cellules entières (y compris toute mère bourgeon connecté). La suite se compose de trois modules pour accomplir ces tâches. Les premières régions cellulaires segments basé sur le contraste entre les images de champ lumineux ciblés et non ciblés, et permet à l'utilisateur de définir et de tester visuellement les paramètres de segmentation. La seconde pistes (. Utilisant Blair et la mise en œuvre de la MATLAB Crocker et al IDL routine de Dufresne, disponible sur: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) et les mesures régions cellulaires à travers le temps; attribue automatiquement lignées et permet une inspection visuelle et la correction d'erreur. Une interface graphique tracé simple est inclus aux propriétés unicellulaires requête. Le troisième module attribue bourgeon émergence et la division times, et délivre des données de séries chronologiques de cellules entières ainsi que leurs dérivées premières et secondes de temps (tel que discuté dans 9). Le module d'analyse fournit en sortie les données dans un fichier de texte délimité par des espaces pour l'étude ultérieure dans le logiciel de statistique de choix. Ainsi, le forfait permet à l'utilisateur d'extraire des données de séries chronologiques de haute qualité par le biais d'une interface graphique. Nous avons utilisé cette méthode pour estimer les taux de transcription en temps réel dans des cellules de levure bourgeonnante simples en fonction du cycle cellulaire 9. Alors que les modules ont été optimisés pour levure bourgeonnante, les paramètres ou, le cas échéant, le code librement disponible peut être adapté à d'autres organismes et les types d'images. Segmentation, le suivi, et la lignée des algorithmes d'affectation peuvent être spécifiques à types d'imagerie affecté et l'organisme en question. Les algorithmes existants pourraient être remplacés, mais conservent l'interface graphique qui permet une inspection visuelle conviviale et la correction des erreurs de segmentation et de suivi qui invariablement occupantsr avec n'importe quel algorithme.

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Protocol

1. Obtenir fluorescentes microscopie Films de cellules de levure unique qui poussent dans une chambre microfluidique

  1. Inoculer 1 ml médias SC (médias définis synthétiques avec 2% de glucose et le complément complet d'acides aminés) avec des cellules d'une plaque fraîchement croissante, et incuber la culture de la nuit environ 16 heures sur un tambour à rouleaux à 30 ° C. Préparer la culture tels que le DO finale 600nm est d'environ 0,1 pour une croissance en phase logarithmique précoce.
  2. Diluer la culture de départ en fonction des besoins et repousse 1 ml dans un tube à essai frais supplémentaires 6-8 heures à OD 600 nm = 0,1. Ceci permet d'obtenir des cellules en croissance à un état stable riche en éléments nutritifs à une densité approprié pour le chargement dans le dispositif microfluidique. (Vous pouvez remplacer les étapes 1.1-1.2 avec la procédure nécessaires pour préparer des cellules que nécessaire pour l'expérience.)
  3. Préparer une plaque de culture microfluidique Y04C de CellAsic: retirer la solution d'expédition; rincer les puits avec de l'eau stérile, et en utilisant le débit du système de perfusion ONIXl'eau par des puits 1-6 à 6 psi pendant 5 minutes pour rincer les canaux. Ensuite, le débit du puits de chargement 8 à 6 psi pendant 10 secondes (le canal de chargement comporte des débits beaucoup plus élevés et doit être rincé séparément).
  4. Enlevez l'eau de tous les puits et les remplacer par 250 SC ul dans l'entrée des puits 1-6 et 50 pi de la culture de l'étape 1.2 dans la cellule de chargement et 8. (Sinon, placez le support souhaité dans le puits d'entrée 1-6 pour des expériences nécessitant une commutation entre les différentes conditions.)
  5. Sceller le collecteur ONIX à la plaque, et pour commencer à amorçage des canaux et de la chambre de culture par l'écoulement à partir des puits d'entrée 6.1 à 6 psi pendant 2 min suivie d'au moins 5 min à 6 livres par pouce carré de l'orifice d'entrée ainsi que le support de maintien de départ pour l' expérience. Circuler cette continuellement jusqu'à l'étape 1.7.
  6. Préparer le microscope pour l'expérience. Nous utilisons un Zeiss Axio Observer.Z1 widefield microscope avec une caméra EMCCD II rétro-éclairé Cascade (Photometrics, Tuscon, AZ) et un arc Lumen 200 à halogénures métalliquesLampe (scientifique préalable, Rockland, MA) pour l'excitation de fluorescence atténué à 10% pour éviter photoblanchiment. Pour minimiser le temps de commutation nécessaire d'acquérir de multiples canaux fluorescents, nous associons un seul cube filtre triple bande passante dichroïque à l'excitation / émission des filtres appropriés pour CFP, YFP, et RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; série 89006) Située dans commutation rapide roues à filtres externes (produits électroniques Ludl, Novato, CA).
  7. Placez quelques gouttes de liquide d'immersion sur l'objectif (si nécessaire, nous utilisons un Plan-Apochromat Zeiss 63X/1.40 Oil DIC), et monter le dispositif microfluidique en toute sécurité dans le stade du microscope inversé. Assurer la plaque ne se déplace pas du tout dans la scène tout au long de l'expérience améliore le suivi de la cellule lors de l'analyse des données. Nous enregistrons simplement la plaque sur le support de la scène pour empêcher son déplacement.
  8. Focus sur le troisième à gauche de la première chambre de culture (où la hauteur de la chambre est le plus petit) en utilisant l'un des intégré positiontion marqueurs. Éteignez écoulement de l'entrée des médias bien, et le débit de la cellule de chargement et 8 à 6 psi à 5 sec rafales. Déplacez le stade de regarder autour de la chambre de culture de cellules. Augmenter le temps de chargement de débit et de pression jusqu'à ce que la densité cellulaire désirée est atteinte, mais éviter de surcharger et de colmatage de la barrière à gauche où les médias frais pénètre dans la chambre.
  9. Commencer s'écoulant de l'entrée de milieu et contenant le support à partir de 6 psi.
  10. En MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ou d'autres automatisation de la microscopie et des logiciels de commande, installer une acquisition multi-dimensionnelle de prendre plusieurs images à multiples positions de scène au fil du temps. Définissez le nombre et l'intervalle entre des points dans le temps. Sélectionner plusieurs positions sur scène avec ~ 10 cellules chacune (plus se surcharger rapidement). Nous utilisons généralement des intervalles de 5 min et l'image jusqu'à 16 postes, qui nécessitent chacun environ 11 secondes pour que l'acquisition à chaque point de temps.
  11. Configuration de l'acquisition de telle sorte que dans chaque position de phase à chaque point du temps THprogramme de e va: se concentrer sur le fond clair de lumière transmise (BF) de l'image à l'aide de méthode intégrée autofocus (mise en œuvre de l'autofocus comme un journal personnalisé écrite au début de chaque poste de scène offre un plus grand contrôle sur la précision de mise au point) de MetaMorph; acquérir le BF image au +1 um au plan focal (fp); acquérir une image BF hors foyer (BFOOF) à um -4 à la fp (utiliser revues coutume écrits de changer l'orientation selon les besoins entre les images), ou d'acquérir un niveau de gris image pour chaque rapporteur fluorescent à la fp utilisant des réglages optimisés pour l'acquisition rapide avec photobleaching minime.
  12. Si nécessaire, obtenir le fond et l'ombrage des images de correction pour chaque rapporteur fluorescent dans une zone de la chambre de culture sans cellules.
  13. Préparer le programme de flux pour l'expérience dans le logiciel de contrôle ONIX. Simultanément commencer le programme d'acquisition de MetaMorph et le programme d'écoulement dans le logiciel de commande ONIX.
  14. A la fin de l'expérience, de rectification ONUmême arrière-plan et l'ombrage dans les images fluorescentes (si nécessaire), et éventuellement combiner les. tif pour chaque canal de l'image à chaque position de scène dans un fichier vidéo. STK (par exemple, créer BF, BFOOF, CFP, YFP et des films RFP pour la position 1 ).

2. Format et segment de données pour le suivi de l'aide du FormatData GUI dans MATLAB (Figure 2)

  1. Exécutez le fichier FormatData.m dans MATLAB pour ouvrir l'interface graphique d'entrée de données. Au sommet, préciser ou accédez au dossier contenant les fichiers d'image pour définir le répertoire de données, puis utiliser l'interface graphique pour spécifier les types de données et les fichiers d'image enregistrés dans l'expérience.
  2. À droite, sélectionnez le bouton radio à côté de "Time-lapse" pour indiquer le type d'analyse à effectuer. "Time-lapse" va traiter la série d'images comme une série de temps (par exemple un film de cellules en croissance dans une chambre microfluidique). "Statique" va traiter chaque série d'image comme un ensemble de photos prises à partir d'une population (par exemple des images multiples prises au DIFférentes positions sur un échantillon de diapositive). Dans cette version de greffons données time-lapse pour de multiples positions peuvent être traités mais dans un fichier distinct pour chaque poste (voir l'étape 2.14).
  3. Cochez la case pour l'enregistrement d'image pour corriger les mouvements de scène imprécises en décalant chaque image dans les films de minimiser le mouvement des cellules apparent dans le cadre. Nous recommandons fortement ce que cela améliore grandement suivi (réduction de curation manuelle de piste plus tard), mais nous allons ajouter, «bruit blanc» des valeurs de pixels aléatoires à remplir où les images ont été transférés à la frontière. Il pourrait également être sélectionné après avoir visionné des images BF segmentées à l'étape 2.7 ou à tout moment avant l'étape 2.13.
  4. Cochez la case "Champ Bright" dans le panneau "Data Channels". Cliquez sur «Select» pour le droit de charger les images BF. Pour *. TIF, sélectionnez toutes les images BF correspondant à un seul film en maintenant la touche Maj enfoncée tout en sélectionnant, puis cliquez sur «Ouvrir». Pour les fichiers Stk *., Il suffit de sélectionner la pile BF d'intérêt. Si les images sont réussitepleinement reconnue, les noms de fichiers sont répertoriés dans le menu déroulant à droite dans la "données reconnues" panneau. . Pour * TIF, être sûr que les noms de fichiers apparaissent dans l'ordre correct (enregistrer des fichiers avec des noms séquentiels lors de l'acquisition - BF_t001, etc.)
  5. Cochez la case "Bright Field (hors-sujet)" de la boîte et utilisez la touche "Select" comme dans l'étape 2.4 pour charger les fichiers BFOOF, qui seront répertoriés dans le menu contextuel à droite. (BFOOF obtenu comme BF um -4 par rapport à la fp à 63X segments ainsi.)
  6. Cochez la case "Mask Cell". Dans le panneau "Source de masque", sélectionnez le bouton radio à côté de "Segment BF". Appuyez sur le bouton "Paramètres" pour ouvrir l'interface de segmentation. (Vous pouvez également sélectionner un film de masque pré-segmentée en sélectionnant le bouton radio à côté du bouton "Sélectionner un fichier de masque", en appuyant sur celle-ci, et en sélectionnant le film comme dans l'étape 2.4. Dans ce cas, un film BFOOF n'est pas nécessaire, et peut passer à l'étape 2.8.)
  7. Définissez les différents paramètres de segmentation (descriptions de chacun peuvent être visualisered en appuyant sur ​​"Description des paramètres"), et de tester la qualité de la segmentation en cliquant sur ​​"Test" (Figure 3). Réussir régions segmentées seront verts avec des frontières magenta. Assurez-vous d'utiliser le curseur de vérifier plusieurs points dans le temps dans le film. Lorsque la segmentation est satisfaisante, sélectionnez «Terminé» pour revenir aux paramètres de segmentation de l'interface graphique FormatData.
  8. Cochez la case "Images de la couleur». Entrez le nom de la couleur pour le premier canal d'image fluorescente dans la zone de saisie de texte, puis appuyez sur «Ajouter et sélectionnez" pour charger les fichiers de couleur comme dans l'étape 2.4. Le nom de la couleur sera ajouté à la liste déroulante sur la gauche, et les noms de fichier sera ajouté à la table à droite. Si une erreur est commise dans le chargement des fichiers de couleurs, sélectionnez le nom de la couleur dans la zone de liste de gauche et cliquez sur "Supprimer la couleur" pour supprimer les fichiers. Répétez l'opération pour chaque canal de couleur.
  9. Si masques sous-région supplémentaires basées sur l'une des couleurs fluorescentes (par exemple marqué par fluorescence noyau → nucloreille de masque de la région) sont souhaitées, cochez la case "Masque de couleur". Si non, passez à l'étape 2.12. Dans le panneau "Color Mask Source", entrez le nom du masque de sous-région dans la zone de saisie de texte. Choisissez une couleur dans le menu contextuel dans le panneau "Color Mask Source" (nécessite la couleur ont été ajoutés à l'étape 6) et pousser "Paramètres" pour ouvrir un seuil de tester l'interface graphique.
  10. Appuyez sur le bouton «Auto-seuil» pour déterminer automatiquement le seuil en utilisant la méthode d'Otsu 15, et l'image mettra en évidence les zones préservées au-dessus du seuil (Figure 4). Le seuil peut être réglé manuellement à l'aide de la boîte d'édition. Utilisez la barre de défilement pour confirmer le seuil est approprié pour tous les temps. Lorsque vous êtes satisfait, appuyez sur «Terminé» pour revenir au seuil de l'interface graphique FormatData.
  11. Push "Ajouter et Segment" pour générer le masque de sous-région à l'aide du module de seuil appliquée aux images de couleurs sélectionnées. Le nom du masque de couleur et la source seront affichés dans le tableau à gauche, avec le r pertinenteles noms de fichiers ecognized figurant dans le tableau à droite. (Vous pouvez pousser "Ajouter et sélectionnez" pour charger les fichiers pré-faites de masque sous-région.)
  12. Au fond, spécifiez ou recherchez le dossier souhaité pour être utilisé comme répertoire de sauvegarde.
  13. Appuyez sur "Data Format" pour lire les fichiers image (en utilisant le code tiffread2.m développé par François Nedelec, disponible sur: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), le traitement des données, et de créer une * fichier. tapis dans le dossier spécifié. Ce fichier servira d'entrée à l'interface graphique ProcessTimeSeries.
  14. Répétez l'étape 2.4 à 2.13 pour l'ensemble des films pour chaque position de la scène.

3. Les cellules de la voie et des lignages dans le temps avec ProcessTimeSeries GUI, et curé ID et affectations de Lineage (figure 5)

  1. Exécutez le fichier ProcessTimeSeries.m dans MATLAB pour ouvrir l'interface de suivi. Définissez les paramètres suivants après l'ouverture duGUI:
    • «Hauteur Chambre" ("File I / O" panneau en haut à gauche) - ce qui indique la hauteur de la chambre dans laquelle les cellules sont piégées. Il est utilisé en tant que contrainte en rapprochant volume de la cellule comme une ellipsoïde 3D ​​sur la base de l'axe majeur et mineur de la région de la cellule comme dans 8.
    • "Um / pixel" (panneau "I / O file") - le facteur de conversion pour calibrer pixel de la distance um dans les images afin section transversale et le volume peuvent être calculées en um um 2 et 3, respectivement.
    • "Panneau Filtres" (ci-dessous "Fichier I / O" panneau) - ensemble minimal et paramètres maximum pour filtrer les régions à haut risque dans le masque: "Zone" - zone de la région en pixels "Ecc" - facteur d'excentricité, plus circulaire que → 0 , "SF" - facteur de forme plus circulaire que → 1.
  2. Cliquez sur "Charger les images" dans le panneau "I / O Fichier" et sélectionner le fichier de données *. Mat de sortie d'intérêt par la GUI FormatData. Le masque de la région (et tous les masques de sous-zone) est appliqué à chaque canal de couleurEt un certain nombre de mesures sont effectuées (tableau 1). Le fichier de données est alors enregistrée. (Si vous chargez un fichier dans ProcessTimeSeries d'une session précédente, il vous demandera si l'analyse doit être recommencé depuis le début. ATTENTION:. Ceci effacera tout curation de piste déjà terminé et traiter les données comme si elles étaient fraîches en provenance de l'interface graphique FormatData Si accidentellement redémarré, rapidement appuyez sur Ctrl + C dans la fenêtre de commande MATLAB pour empêcher le fichier. mat * précédemment organisée d'être remplacée.)
  3. Ensuite, suivre les cellules. Dans le panneau "Cellules Track" (à côté du panneau «Filtres»), définissez les paramètres suivants:
    • "Déplacement Max" - la distance maximale en pixels d'une cellule peut voyager entre des images adjacentes, avant d'être étiqueté comme une cellule différente. Déplacement plus élevé signifie l'algorithme peut expliquer les cellules mobiles plus, mais elle augmente également la complexité de mise en correspondance des régions cellulaires dans la foule. Nous commençons à 12 ans et diminue si une erreur se produit dans le suivi (voir l'étape 30,4).
    • "Longueur minimum" - un nombre minimal d'occurrences pour une trace de cellules à prendre en considération une série de données valides. Nous utilisons 1 pour empêcher le retrait de toutes les traces réelles, mais ce peut être augmenté si les résultats de segmentation dans les traces de la région à court terme, de parasites.
    • "Mémoire du cadre" - nombre maximum de trames consécutives une région de cellule peut disparaître et être donné le même ID quand il retourne. Si elle disparaît pendant plus de "Mémoire du cadre", il sera donné une nouvelle identité à son retour. Nous utilisons 2 à permettre aux régions d'être manquées par segmentation pour 2 cadres avant de revenir.
  4. Cliquez sur "Cellules de route» pour suivre les régions d'une image à l'autre en utilisant les centres de gravité de la région (Blair et Dufresne mise en œuvre de MATLAB Crocker, Grier, et Weeks IDL routine, disponible à l'adresse: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , pour attribuer lignées de bourgeons nouvellement comparants, et pour sauvegarder les données. Lignées sont automatiquement assignés par minimizing distances entre les bourgeons putatifs et les mères potentielles dans chaque trame. (Si une erreur s'affiche dans la fenêtre de commande MATLAB en raison de «combinatoire difficiles», diminuent "Déplacement Max" et répètent suivi.) Modifier les paramètres dans les fenêtres popup que nécessaire pour vos données.
  5. Curé régions et les erreurs dans ID ou missions de la lignée mal segmentées en utilisant les différents outils graphiques ou des touches de raccourci (montré dans une fenêtre contextuelle en appuyant sur le bouton ci-dessus panneau "Informations de cellules sélectionnée").
    • Curseur, "image Image précédente", "image suivante" (Ctrl + gauche / droite) - utiliser pour afficher et déplacer entre les images de la série d'images.
    • "N ° de l'image" - affiche le numéro de trame de l'image courante dans les axes gauche et droit. Déplacer vers un cadre spécifié en tapant son numéro dans le droit "image #" zone d'édition.
    • "Frame Delta" - montre la différence dans le nombre de trames entre les axes gauche et droite (Δ = droite - gauche).
    • "Hide Text" (Ctrl + T) - permet de basculer entre l'affichage des ID de cellules dansles bons axes ou non.
    • "Masquer les étiquettes" (Ctrl + L) - bascule entre l'affichage des ID de cellules dans les axes de gauche ou non.
    • "Mask" menu contextuel - choisir entre l'affichage sans masque, le masque cellulaire, ou tout sous-masques définis par l'utilisateur pour l'affichage dans le panneau de gauche.
    • Menu contextuel "Overlay" (Ctrl 1-9) - choisir d'afficher BF et des couches de couleur dans le cadre de gauche. Voir BF est le seul qui permet de basculer la couche BF ou désactiver dans les deux axes. Basculer entre l'affichage ou non en sélectionnant le nom de la superposition dans le menu à nouveau ("*" désigne overlay est affiché). Ctrl +1 bascule BF superposition, avec 2-9 basculer les superpositions de couleurs dans l'ordre.
    • "Définir les couleurs» - Utilisez pour déterminer la couleur pour l'affichage de superposition. Une fenêtre va interroger le canal de fluorescence à régler, puis la palette de couleurs apparaîtra pour la définition de l'utilisateur.
    • "Modifier Régions et Tracks" panneau - ces contrôles apporter des changements sur le masque de zone de cellule et les informations de trace:
      • "Mettre à jour les pistes" (Ctrl + U) - utilisent à nouveauaffecter des ID de cellules. Si aucun cellules sont sélectionnées dans les axes droite, l'interface graphique demandera un identifiant de cellule à changer. Lorsque ID X est remplacé par Y, toutes les futures instances de X seront modifiées afin de Y, et toutes les instances futures du Y actuel, seront passés à X. (Parfois une cellule basculer entre 2 cartes d'identité, à plusieurs reprises. Ce est due à la poursuite essayant d'accommoder plusieurs ID dans une région oversegmented plutôt que d'une erreur dans la fonction d'identification de mise à jour.) Plusieurs cellules peuvent être sélectionnées et leurs identifiants modifiés simultanément, mais assurez-vous de donner à chacun un numéro d'identification unique. Pour affecter une région à une identification qui n'existe pas dans le fichier actuel, inscrivez «0» et vous sera généré. Utilisez Ctrl + W pour échanger les identifiants des deux cellules sélectionnées.
      • "Supprimer des pistes sélectionnées" (Ctrl + D) - utiliser pour supprimer la cellule sélectionnée ou plusieurs régions de cellules dans le cadre actuel des axes droite. (Si aucun cellules sont sélectionnées, vous invite à ID.) Pour supprimer définitivement toutes les instances d'une trace d'identité, cochez la case à côté du DeLete bouton Selected Tracks (texte passera à "éliminer tout"). Ceci est utile pour se débarrasser des régions à haut risque persistants, mais vérifiez d'abord futures trames pour s'assurer que le ID ne passe pas à une cellule valide ou région d'œuf.
      • "Fusionner les régions" (Ctrl + A ou M) - adoucit et combine régions cellulaires. Cliquez sur une ou plusieurs cellules dans les bons axes pour sélectionner (région devient rouge si elle est sélectionnée). Fusion sur une région sera morphologiquement proche pour remplir des fissures ou des petits morceaux manquants à l'aide d'un élément en forme de disque. La fusion de deux ou plusieurs régions voisines se combiner en une seule région et de donner le plus petit ID de la nouvelle région. Ceci est utile pour les régions sur-segmentées (souvent lorsque les cellules ont de grandes vacuoles).
      • «Dessine-région» - Utilisez la souris pour dessiner une région dans les bons axes endroit désiré et double-cliquez pour terminer. Fournir un identifiant unique pas présent dans l'ensemble de données (entre 1 et 65535). Annuler en appuyant sur Suppr du clavier.
    • "Lineage Tracking" panneau - après le suivi,travaux de lignage sont générés automatiquement. Lorsque de nouvelles régions d'identité apparaissent, le nouvel identifiant de cellule apparaît en rose et une ligne rouge est attirée sur la région de la mère. De nouvelles régions trop grandes pour être bourgeons ou trop loin de mères potentielles apparaissent en vert et se voient attribuer un ID de la mère de «Nan» («pas un nombre», voir tableau 2). Régions existant au premier point dans le temps ont une identification de la mère de "0". Pour fixer les affectations individuelles, entrez la mère et les ID des bourgeons dans les domaines de l'édition de texte et cliquez sur "Fix". Pour effacer la mère d'une cellule, inscrivez «0» comme sa mère. Une méthode plus rapide consiste à sélectionner deux régions dans l'image de droite et appuyez sur Ctrl + F. Cela assignera automatiquement la région plus que la mère et la région récente comme la fille, tout en effaçant toutes les affectations de mère déjà existantes pour la cellule fille. ATTENTION: en cliquant sur «Calculer lignées" à tout moment recalculera toutes les missions de la lignée, y compris celles que l'utilisateur a préalablement organisée.
    • Panneau "Selected d'infos cellule» - «Je Obteneznfo "affichera des mesures des régions sélectionnées dans les bons axes." mesures ... "permet à l'utilisateur de déterminer quelles mesures sont affichées (ainsi que définir la liste par défaut pour d'autres opérations telles que" Exporter des données "). Peut être utilisé pour déterminer les ID et les lignées (par exemple, si la cellule X est un bourgeon à l'instant t, il est fort probable ne pas avoir un autre bouton à l'instant t + 5 min) correctes.
    • "Enregistrer les modifications" (Ctrl + S) - mises à jour le fichier * mat pour refléter les changements de l'utilisateur.. Utilisez fréquemment (il n'ya pas de fonction d'annulation)!
    • "Générer Parcelles" - ouvre l'interface graphique GeneratePlots. Utilisé pour tracer rapidement sélectionné des informations variables et des calculs simples pour les régions mono-cellulaires mis en évidence dans les bons axes de la GUI ProcessTimeSeries, leur moyenne, ou la moyenne de toutes les régions dans chaque trame. Cette interface graphique peut calculer les dérivées premières brutes, mais n'oubliez pas de préciser l'intervalle de temps correct en haut à gauche. Parcelles peuvent être restitués à un chiffre pour l'enregistrement en appuyant sur "Générer la figure".
    • Pour curé correctement les données: fusionner les régions oversegmented, supprimez les régions non capturant l'ensemble de la cellule; n'oubliez relations mère-bud sont correctement assignés (une ligne rouge apparaît entre eux au moment de l'émergence bourgeon, lorsque l'ID bourgeon est rose, voir Tableau 2), et éliminer tout ID vertes par la fixation de l'ID, l'attribution de la région d'une mère, sans affecter mère ("0"), ou la suppression de la région. Bud données seront ajoutées à celle de la mère lors de l'analyse finale afin de ne pas fusionner une région de bourgeon de sa mère (elle conduira à l'estimation du volume inexacte).
    • Inspecter visuellement les données pour chaque trame jusqu'à la dernière heure d'intérêt, mais il n'est pas nécessaire de l'ensemble de la période, si vous n'utilisez pas les cadres ultérieure.
    • Assurez-vous d'enregistrer les changements.
    • Répétez les étapes 3.1-3.7 pour le fichier *. Mat pour chaque position de la scène.

4. Exportation de données pour l'analyse

  1. Pour simplement exporter mesures région brutes pour chaque cellule par time, appuyez sur "Exporter des données". Les mesures d'intérêt peuvent être sélectionnés dans l'interface graphique qui s'ouvre, et ils le seront dans un espace délimité *. Txt avec des noms de variables que les en-têtes de colonnes.
  2. Pour analyser les séries chronologiques pour les cellules entières dans le temps, de calculer les informations du cycle cellulaire, et de prendre des produits dérivés, pousser "Analyse des séries chronologiques". Une fenêtre s'ouvre permettant de sélectionner les mesures d'intérêt et l'entrée des paramètres d'analyse (Figure 6).
  3. Entrez le dernier point de temps organisée dans l'interface graphique (toutes les images suivantes seront ignorés). Les paramètres d'affectation par défaut lissage et cycle cellulaire fonctionnent bien pour notre haploïde et souches diploïdes imagées à intervalles de 5 minutes, mais il faudrait peut-être modifié pour de meilleurs résultats. (Vérifiez que les valeurs des paramètres sont appropriés en déterminant manuellement temps en herbe et la division d'un ensemble de données de test et de comparaison de la performance de l'algorithme automatisé.)
  4. Lorsque tous les paramètres sont réglés, appuyez sur "Analyser" pour:
    1. Moinstruct tableaux pour chaque mesure brute et soustraire le fond (mesuré comme l'intensité moyenne de la zone de non-cellule de la première trame dans chaque film fluorescent, ou qui peut être complétée pour tenir compte de l'autofluorescence moyenne par pixel de la cellule).
    2. Monter une spline de lissage pour les mesures sélectionnées pour éliminer le bruit de mesure haute fréquence (tel que discuté dans 9).
    3. Déterminer automatiquement apparition des bourgeons et des temps de division cellulaire pour chaque cellule en fonction des changements dans la pente de la série chronologique du volume abordés à 9. Les mesures de bourgeon seront alors ajoutés aux mesures de la mère entre émergence et la division de chaque cycle pour toute une série de temps de la cellule contiguë. Une progression du cycle cellulaire normalisé sera également calculée allant de 0 à 2 de division en division.
    4. Monter un lissage spline de prendre stables 1 er et 2 nd dérivés des mesures sélectionnées. (Aux fins de dérivés bien définis, des séries chronologiquessont fabriqués en continu à travers la division en décalant les données pour le cycle cellulaire suivant pour satisfaire le critère pour le cycle précédent.)
    5. Sortie brut et des séries chronologiques lissée pour toutes les régions, et tout lissée de la cellule, continue et séries chronologiques différencié comme un tableau pour chaque mesure. Le premier élément est un indice de couleur de fond de la soustraction, le reste de la première rangée occupe ID de cellules, le reste de la première colonne indique le numéro de trame, et les éléments restants maintenir la série chronologique pour chaque cellule dans une colonne, chaque rangée correspondant à la trame de la première colonne. Un tableau similaire du cycle cellulaire des séries chronologiques de la progression et de l'information de lignage sera également sortie. Le tableau "LineageArray" contient une table avec chaque ligne représentant une relation mère-bourgeon et la première à la cinquième colonnes sont ID de mère, bourgeon ID, cadre de la première région de bourgeon, cadre en herbe estimée, et le cadre de la division estimé. Les données sont exportées dans un fichier *. Mat (fichier de données MATLAB).

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Representative Results

Une expérience réalisée et analysée avec succès donnera série surtout à temps continu pour les cellules entières simples avec réalisme attribué apparition des bourgeons et des temps de division. À titre d'exemple, nous avons réalisé le protocole ci-dessus avec une souche de levure haploïde exprimant une copie intégrée de la protéine fluorescente Cerulean (CFP) entraînée par le promoteur constitutif ADH1 d'observer comment la croissance et l'expression globale peuvent varier au fil du temps dans des cellules individuelles (tableau 4, Y47 ). Nous avons couru l'analyse des séries chronologiques pour obtenir cellule entière (figure 7A) mesures au fil du temps, et une dépendance à l'égard du cycle cellulaire émerge à la fois le volume et d'expression que l'on trouve dans les 9. Après la formation des bourgeons, le volume total combiné (mère + bourgeon) augmente plus rapidement qu'auparavant bourgeon émergence (conforme à 8,16), tandis que la concentration en protéine, ou d'intensité moyenne, diminue légèrement (figures 7B et 7C). La hausse combinée intégrationprotéines TED (concentration volumique de x dans ce cas) accélère également après bourgeonnement (figure 7D). En comparaison avec la région de la mère seule (figure 7B & D), ces résultats démontrent l'importance d'intégrer correctement les contributions des bourgeons de l'ensemble de mesure de la cellule et de souligner la nécessité de la formation des bourgeons appropriée et plusieurs affectations de division. Comme nous l'avons rapporté 9, nous pouvons utiliser la série chronologique différencié pour calculer un niveau ARNm par rapport instantané M (t) et le taux de transcription A (t), qui à la fois augmenter aussi après bourgeonnement (figure 7E et 7F):

Équation 1
P (t) est la protéine totale à l'instant t, et γ M est le taux de dégradation de l'ARNm 0,04 min -1

La capacité de générer des dérivés stables dans le temps des séries chronologiques de mesure profite également à des études cinétiques. Nous utilisons une souche de levure exprimant, un facteur de transcription chimérique observable à l'activité de transcription commutable (tableau 4, Y962). Le facteur de transcription de maître de la voie de carence en phosphate, Pho4p, est contrôlée grâce à la localisation nucléo-cytoplasmique en réponse à concentratio phosphate extracellulaire N 18. Nous avons remplacé le domaine de liaison d'ADN de la Pho4p avec tetR, qui se lie à l'opéron tet (tetO), et C-terminale fusionné le nouveau facteur de transcription à une protéine fluorescente jaune pour créer Pho4-tetR-YFP 9. En changeant le niveau de phosphate dans le milieu de perfusion, nous pourrions alors passer expression d'une PCP intégré dirigé par un promoteur synthétique composé de 7 sites de liaison tetO une le promoteur minimal CYC1 (7xtetOpr-PCP). Une analyse de séries chronologiques montre lorsque le facteur de transcription est localisée dans le noyau (en utilisant une fusion de DP et le Nhp2p de protéine nucléaire de créer un sous-masque nucléaire DP basé comme dans l'étape 2.9-10), et lorsque le gène cible démarre et s'arrête transcription (Figure 8). En analysant la série dérivée dans le temps, l'activation et la désactivation de fois le promoteur de la cible dans chaque cellule unique ne peuvent être déduits, même lorsque la concentration du rapporteur fluorescent stable est élevée.

Figure 1
Figure 1. Schéma du protocole. Le protocole décrit les étapes pour 1) culture microfluidique, 2) fluorescence, microscopie time-lapse, 3) l'analyse des données, et

Figure 2
Figure 2. FormatData GUI. L'interface est utilisé pour importer, le format et les données d'image de chaque segment pour des calculs ultérieurs et l'inspection visuelle. Les chiffres indiquent l'étape de protocole correspondant à chaque composant. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. SegTest GUI. L'interface est utilisée pour tester segment de cellule paramètres ation et confirmer visuellement la précision de segmentation comme dans l'étape 2.7.

Figure 4
Figure 4. ColorThreshTest GUI. L'interface est utilisée pour tester le seuil d'intensité nécessaire pour créer un masque subcellulaire du canal de fluorescence choisi comme à l'étape 2.10.

Figure 5
Figure 5. ProcessTimeSeries GUI. L'interface est utilisée pour mesurer, suivre, contrôler visuellement et modifier régions cellulaires et des missions de la lignée. Les nombres indiquent l'étape de protocole correspondant à chaque composant.target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 6
Figure 6. AnalysisParams GUI. L'interface est utilisée pour entrer les paramètres nécessaires à l'analyse des séries chronologiques comme dans les étapes 4.3 et 4.4.

Figure 7
Figure 7. Séries chronologiques seule cellule d'une levure haploïde exprimer ADH1 pr-PCP dans la culture microfluidique sur plusieurs générations. (A) Fond clair (rangée du haut) et de la PCP (rangée du bas) micrographies sont présentés aux moments indiqués pour une cellule tout au long de l'expérience . Pour la cellule mère segmenté (bleu outline) et ses bourgeons (contour vert), la cellule contiguë ensemble est souligné en rouge. Raw mère et le volume auriculaire (B) et (C) des séries temporelles de la concentration de protéines ont été lissées pour éliminer le bruit de mesure, et (D) intégré PCP fluorescence a été calculé comme le produit du volume et de la concentration. La cellule entière (rouge) trace est prolongée division passé pour garder un total cumulé qui est facile à adapter à une spline de lissage différentiables dans toutes les divisions (B et D). Le (E) le niveau de l'ARNm par rapport et (F) le taux de transcription instantanée sont calculées en utilisant les équations (2.1) et de l'ajustement de courbe en (D).

Figure 8
Figure 8. Promoteur réponse du taux de transcription de nucléo-cytoplasmiquenavette d'une fusion Pho4-YFP dans les cellules de levure simples. (A) Micrographies des quatre canaux d'acquisition indiqués sont indiquées pour une cellule avec un commutable YFP fusionnée Pho4-tetR transactivateur que (B) se localise dans le noyau DP-marquée en réponse à faible phosphate et (C) induit l'expression d'un journaliste 7xtetOpr-CFP. (d) Le taux présumées changements de transcription avec la localisation en moyenne (ligne noire) et au niveau d'une seule cellule (lignes rouge et magenta, où le rouge représente la zone contiguë région de cellule souligné en rouge dans A). Les fortes baisses dans l'expression de la PCP en B coïncident avec la division cellulaire lors de certaines protéines est perdu à la cellule fille.

Nom de la mesure Description
Heure numéro de trame de l'image
Région Nombre total oPixel de f, comprenant la région
Volume (4/3) πabc,a = ½ axe principal de la région, b = ½ longueur de l'axe mineur, et c = b ou ½ "hauteur Chambre" (valeur la plus faible)
(X) _ (Y) signifie L'intensité moyenne des pixels du masque de région (Y) dans le canal de couleur (X)
(X) _ (Y) médiane Intensité de pixel médian du masque de région (Y) dans le canal de couleur (X)
(X) _ (Y) std L'écart-type des intensités de pixels du masque de région (Y) dans le canal de couleur (X)
(X) _ (Y) iqr Intervalle interquartile des intensités de pixels du masque de région (Y) dans le canal de couleur (X), 75 e percentile - 25 ème valeur centile
(X) _ (Y) T20pct Intensité pour le top 20% des intensités des pixels pour un masque de région (Y) dans le canal couleur (X) signifie. Utiliserutile par rapport à la mesure suivante pour déterminer la localisation subcellulaire sans un sous-masque.
(X) _ (Y) B80pct L'intensité de la partie inférieure de 80% des intensités des pixels de masque de la région (Y) dans le canal de couleur (X) moyenne. Utile en comparaison avec la mesure précédente pour déterminer la localisation subcellulaire sans submask.
(X) _ (Y) M50pct L'intensité moyenne pour 50% de la moyenne des intensités de pixels pour un masque de région (Y) dans le canal de couleur (X)
(X) _cellint Fluorescence intégrée des canaux de couleur (X) (intensité moyenne des pixels x volume) pour l'ensemble de la cellule (mère et toute bourgeon relié)
(Z) Raw Temps de sortie de données série brute par «analyse des séries chronologiques" pour variable (Z)
(Z) Lisse Spline-lissées fois sortie de données brutes par "l'analyse des séries chronologiques" pour variable (Z)
(Z) Entier Cellule entière (mautre + joint bourgeon (Z) Rawsmooth) séries chronologiques sortie de données par «l'analyse des séries chronologiques" pour variable (Z)
(Z) Cont Données de séries chronologiques de cellules entières ont continu à des divisions («cumul») sortie par «analyse des séries chronologiques" pour variable (Z)
(Z) WhSmooth Spline lissée (Z) tout ce temps la sortie de données série de la cellule par «analyse des séries chronologiques" pour variable (Z)
(Z) DDT Première fois dérivé de spline lissée (Z) tout ce temps la sortie de données série de la cellule par «analyse des séries chronologiques" pour variable (Z)
(Z) d2dt2 Deuxième dérivée temporelle de spline lissée (Z) tout ce temps la sortie de données série de la cellule par «analyse des séries chronologiques" pour variable (Z)

Tableau 1. Mesure nomenclature variable dans ProcessTimeSeries GUI.

couleur Cell ID statut de Lineage
jaune mère affectée
rose nouveau bourgeon (trait rouge à la mère affectée)
vert aucune mère affectée

Tableau 2. ID cellule code couleur pour l'état de cession de la lignée.

Nom du fichier Description
FormatData.m L'entrée de données GUI qui formate les films et les segments BF images pour traitement par ProcessTimeSeries.m
FormatData.fig FormatData disposition de la fenêtre GUI
BFsegment.m Module de segmentation BF, avec extractregions2.m et segmentregions.m
SegTest.m Segmentation qualité des tests GUI
SegTest.fig SegTest disposition de la fenêtre GUI
extractregions2.m Premier composant de module de segmentation BF pour identifier les régions
segmentregions.m Deuxième composante du module de segmentation BF aux régions cellulaires distincts et propres
color2submask.m Module de segmentation submask basé sur la fluorescence
ColorThreshTest.m Basées sur la fluorescence seuil masque tests GUI
ColorThreshTest.fig ColorThreshTest disposition de la fenêtre GUI
tiffread2.m Extraits données *. Ou les fichiers *. STK TIF pour une utilisation dans MATLAB
imalign.m enregistrement de l'image en utilisant une corrélation transversale 2D
ProcessTimeSeries.m Le traitement des données GUI qui permet de suivre régions, attribue lignées, et permet une correction visuelle des erreurs. Fournit également des capacités de traçage interface graphique et délivre des données de séries chronologiques de cellules entières
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries disposition de la fenêtre GUI
cleanMask.m Élimine les régions de masque en fonction de paramètres dans ProcessTimeSeries GUI
track.m Pistes régions cellulaires basés sur centroïdes de la région
OptimizeLineages.m module d'affectation de Lineage détermine les relations mère-bud optimaux basés sur la distance physique et les événements passés et futurs en herbe
getClosestObjects.m Trouve cellules voisines pour chaque nouvel ID de cellule (BUD)
SelectVariables.m Sélection mesure GUI pour le choix des variables d'intérêt
SelectVariables.fig SelectVariables disposition de la fenêtre GUI
GeneratePlots.m Tracé graphique des données dans la fenêtre ProcessTimeSeries
GeneratePlots.fig GeneratePlots disposition de la fenêtre GUI
AnalyzeCellSeries.m Module d'analyse de la série de temps détermine le temps de la division cellulaire et fournit en sortie des mesures de cellules entières, comme décrit dans le texte
assignDivisionsInf2.m Affecte bourgeon pousse et le temps de la division cellulaire
AnalysisParams.m séries chronologiques saisie des paramètres d'analyse de cellules
AnalysisParams.fig AnalysisParams disposition de la fenêtre GUI

Tableau 3. GREFFES déposer descriptions.

ID Strain Génotype (W303-based) Référence
Y47 MAT une Ieu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19
Y962 MAT une ADE + NHP2 :: DP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9

Tableau 4. Les souches de levure utilisées dans cette étude.

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Discussion

Le protocole ci-dessus décrit une méthode simple pour obtenir et analyser des données de séries chronologiques de fluorescence avec une expérience limitée en microfluidique ou dans le développement de logiciels. Il permet d'obtenir time-lapse films de fluorescence des cellules de levure simples; extraire la taille des cellules pertinentes et les mesures d'expression; suivi curé et missions de la lignée, et analyser le comportement des cellules entières dans le temps en utilisant un dispositif de culture microfluidique disponible dans le commerce et une interface utilisateur graphique polyvalente Interface utilisateur (GUI). Alors que l'expérimentation, la segmentation et le suivi des mesures ont été sollicités de diverses manières précédemment 11,13,14, la procédure ci-dessus est conçu pour rendre ces techniques accessibles à un sous-ensemble plus large de la communauté des biologistes. Alors que la procédure ci-dessus est optimisée pour un dispositif de culture microfluidique particulier, l'analyse globale peut être adapté à des dispositifs similaires que les technologies de culture microfluidiques off-the-shelf devenus moins chers et plus personnalisable. FundamEntally, la segmentation et les algorithmes de mesure de la région que nous employons sont similaires aux méthodes de 13,14 existants, mais le logiciel GREFFES ajoute la possibilité de curé visuellement le suivi de la région et des missions de la lignée et d'affecter les phases du cycle cellulaire avec précision. Ces deux caractéristiques sont essentielles pour calculer avec précision le temps dérivés des séries de données.

Il ya plusieurs étapes dans le protocole qui influe grandement sur la qualité des données de séries chronologiques qui en résultent. Surcharge d'abord la chambre de culture avec des cellules diminue la perfusion dans la chambre (surtout perceptible dans les expériences cinétiques où la chambre le temps de rafraîchissement est important), et la prolifération aura lieu plus tôt au cours du temps de l'expérience. Ceci peut mieux être évité en commençant par diminuer la pression de chargement de cellules pour des durées plus courtes et en augmentant progressivement l'un ou les deux jusqu'à une densité cellulaire appropriée est assurée. sélection de position de scène pour l'imagerie est consi connexe et tout aussi importanttion. Connaissant le temps de doublement de la souche, le plan combien de cellules sera dans le cadre de l'image dans le temps et d'anticiper comment éviction aura une incidence sur la diffusion des médias. Dix cellules dispersées vont se transformer en dix microcolonies, mais dix cellules initialement regroupés vont se transformer en une seule grande colonie (nous avons remarqué limitations de diffusion des nutriments à 6 psi au centre d'une colonie quand elle est supérieure à ~ 14 cellules de diamètre) . Effort supplémentaire dans les étapes du protocole en amont facilite également curation manuelle des données plus tard, et améliore la série chronologique de sortie. S'assurer que la plaque est montée fermement dans la scène et utilisez l'option d'enregistrement de l'image dans l'interface graphique FormatData d'améliorer considérablement la précision de localisation automatique des cellules individuelles à travers le temps. Passez du temps dans le choix des paramètres de segmentation meilleur possible aussi de réduire le nombre d'erreurs qui nécessitent une attention. Le logiciel de suivi fonctionne mieux avec une légère oversegmentation des régions cellulaires plutôt que undersegmentation parce réémergentes unecellule de fractionnement est une tâche simple que dessiner des lignes de diviser les régions, cependant, l'augmentation de oversegmentation augmente erreurs dans les assignations de lignées en raison de la présence de faux, de nouvelles régions. En outre, assurez-vous que toutes les relations mère-bud sont correctement assignés sorte que les mesures pour l'ensemble de la cellule seront exacts. Si un bourgeon est manquée par la segmentation ou se développe en dehors de la limite d'image, pensez à mettre fin à la série de données de la mère pour éviter des résultats erronés. Cela se fait facilement en changeant la région de la mère à un identifiant unique (ID saisir de "0") à la trame erronée, et en utilisant le "Tout effacer" fonctionnalité pour supprimer toutes les occurrences futures de la nouvelle identité. Une attention particulière à ces mesures permettra d'accroître considérablement la précision des données de séries chronologiques brutes.

Pour établir interprétation valable de la sortie de données en appuyant sur "l'analyse des séries chronologiques", nous vous conseillons quelques renseignements supplémentaires. Vérifiez apparition des bourgeons et des temps de division sont précisément déterminés sur la base utilisateur input paramètres. Enregistrer manuellement les temps de bourgeonnement et la division pour un décor de cinéma d'essai et de comparer les résultats de l'algorithme. Afin d'estimer visuellement le temps cytokinesis complète entre une mère et sa fille, chercher leur frontière étroite et à s'assombrir. (NB:. Une souche de test avec un sida noyau fluorescence marqués en observation manuel du temps de division Une autre méthode serait de fluorescence marquer la membrane plasmique et chercher le fossé entre les cellules de la mère et la fille pour fermer.). En outre, vérifier si la fluorescence totale d'une cellule est plus propre que l'intensité de la région moyenne multipliée par le volume (lorsque la lumière captée provient d'une section transversale mince de la cellule) ou comme la fluorescence intégrée sur la région (lorsque la lumière captée provient d' la totalité de la cellule). Si le profil de fluorescence à travers une cellule correspondant à la courbe d'une demi-ellipse décrite par les axes majeur et mineur de la région 7, la lumière capturée provient de l'ensemble de la cellule, et la fluorescence totale shoULD être calculée comme (intensité moyenne) x (région). Dans notre cas, à 63X avec une profondeur de champ très inférieure à la hauteur de la cellule, le profil de fluorescence est relativement plate et la fluorescence totale est calculée comme (intensité moyenne) x (volume). Une autre considération est le photoblanchiment des fluorophores. Le logiciel ne considère pas photoblanchiment dans l'analyse, et donc la production de séries chronologiques fluorescence ne représente que le journaliste observable. Processus de photoblanchiment dépendent fortement des paramètres d'acquisition et l'intervalle de temps utilisé pour obtenir des images de fluorescence, la nature du fluorophore, et divers autres paramètres expérience spécifiques. Photoblanchiment peut également ne pas être bien décrite par une expression de taux simple, de premier ordre, ce qui empêche un algorithme général pour son traitement. Nous faisons donc pas compte de photoblanchiment dans la production de séries chronologiques, mais la méthode d'analyse peut être utilisée pour mesurer la cinétique de ce processus pour aider à l'interprétation de l'utilisateur. Enfin, choisissez smoothing paramètres appropriés pour la série observée. Idéalement, les splines de lissage permettra d'éliminer le bruit de mesure haute fréquence tout en préservant les caractéristiques réelles dans les données. Les paramètres nécessaires pour réaliser cet dépendent des caractéristiques de la série de temps particulière et peuvent varier entre les expériences.

Le logiciel a été conçu pour être flexible pour l'analyse de diverses données de microscopie par fluorescence time-lapse. N'importe quel nombre de canaux de couleur peuvent être inclus et tout peut être utilisé pour créer un masque de sous-région. Alors que les algorithmes fonctionnent bien pour les films de cellules de levure en herbe, la plupart des fonctionnalités devrait s'étendre aux films d'autres organismes ainsi. Mesure de la région (à l'exception de volume), le suivi, et la conservation dépendent uniquement sur le masque de cellule et sont donc adaptable. La segmentation, la cession de la lignée, la détermination de la division cellulaire, et des modules d'analyse de séries temporelles peuvent être modifiés indépendamment pour s'adapter aux besoins spécifiques. En outre, plutôt que d'utiliser la SE inclusmodule de gmentation, un film de masque pré-segmentée peut être saisie, et en contraste de phase ou d'interférence différentielle images de contraste peut être substitué à champ lumineux. Les interfaces graphiques peut ensuite être utilisé principalement pour suivre et prendre soin d'identité et missions de la lignée.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Nous remercions Emily Jackson, Joshua Zeidman, et Nicholas Wren pour les commentaires sur le logiciel. Ce travail a été financé par GM95733 (au Mexique), BBBE 103316 et fonds de démarrage du MIT (à NM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

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References

  1. Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307, (5717), 1962-1965 (2005).
  3. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  4. Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8, (5), 431-433 (2012).
  5. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332, (6028), 475-478 (2011).
  6. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123, (6), 1025-1061 (2005).
  7. Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332, (6028), 472-474 (2011).
  8. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38, (8), 2676-2681 (2010).
  9. Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. Submitted (2013).
  10. Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5, (9), e239 (2007).
  11. Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1, (1), 2005.0024 (2005).
  12. Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, (7131), 46-51 (2007).
  13. Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3, (1), e1468 (2008).
  14. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4, (2), 175-181 (2007).
  15. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9, (1), 62-66 (1979).
  16. Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23, (12), 1408-1422 (2009).
  17. To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327, (5969), 1142-1145 (2010).
  18. O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271, (5246), 209-212 (1996).
  19. Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304, (5678), 1811-1814 (2004).

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