هندسة الأنسجة ل3D الإنسان
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Würzburg
* These authors contributed equally

Bioengineering
 

Summary

وصفت وسائل لخلق أنسجة الورم 3D الإنسان كما نظم الاختبار. وتستند هذه التقنيات على decellularized البيولوجية أوعية دموية سقالة (BioVaSc)، وخلايا الإنسان الأولية وخط الخلية السرطانية، والتي يمكن تربيتها في إطار ثابت وكذلك في ظل ظروف دينامية في مفاعل حيوي التدفق.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Moll, C., Reboredo, J., Schwarz, T., Appelt, A., Schürlein, S., Walles, H., Nietzer, S. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460, doi:10.3791/50460 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

السرطان هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. يتم تطوير الاستراتيجيات العلاجية الحالية في الغالب في أنظمة الثقافة 2D، التي تعكس بشكل كاف الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي. المصفوفات 3D البيولوجية توفير بيئة الخلايا في الخلايا التي يمكن تنظيم الذاتي، والسماح للدراسة المنظمة الأنسجة وتمايز الخلايا. يمكن المصنف مثل السقالات مع خليط من أنواع مختلفة من الخلايا لدراسة المباشر 3D خلية خلية التفاعلات. لتقليد تعقيد 3D من الأورام السرطانية، وقد وضعت مجموعتنا في المختبر الورم نظام اختبار 3D.

لدينا نماذج نظام اختبار الأنسجة 3D الوضع في الجسم الحي من الأورام الخبيثة الطرفية العصبية غمد (MPNSTs)، التي وضعناها مع شركائنا decellularized الجزء صائمية الخنازير المستمدة سقالة أوعية دموية البيولوجية (BioVaSc). في نموذجنا، ونحن reseeded على BioVaSc مصفوفة تعديل مع الخلايا الليفية الأولية، الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (mvECs) والورم خط الخلية S462. للثقافة ثابت، تتم إزالة بنية الأوعية الدموية في BioVaSc ويتم قطع السقالة المتبقية مفتوحة على جانب واحد (تحت المخاطية المعوية الصغيرة SIS-MUC). ثم يتم إصلاح المصفوفة الناتجة بين اثنين من حلقات معدنية (التيجان الخلية).

خيار آخر هو ثقافة خلايا المصنف SIS-MUC في نظام مفاعل حيوي تدفق الذي يعرض الخلايا لإجهاد القص. هنا، يتم توصيل مفاعل حيوي لمضخة تحوي في حاضنة المكونة داخليا. كمبيوتر ينظم الأوكسجين الشرياني وتوريد المواد الغذائية عن طريق المعلمات مثل ضغط الدم ودرجة الحرارة ومعدل التدفق. هذا الإعداد يسمح لثقافة ديناميكية مع أي ضغط أو ينظم نابض تدفق مستمر.

في هذه الدراسة، فإننا لا يمكن إنشاء بنجاح كل من نظام الثقافة 3D والدينامية للMPNSTs. والقدرة على تصميم نموذج الأورام السرطانية في بيئة 3D أكثر طبيعية تمكين اكتشاف واختبار والتحقق من صحةالأدوية المستقبل في نموذج مثل الإنسان.

Introduction

يجب التحقق من صحة الأدوية الجديدة فيما يتعلق جودتها، والسلامة، والكفاءة قبل الترخيص السوق. حتى الآن، التجارب على الحيوانات هي الطريقة القياسية لاختبار المخدرات والتحقق من الصحة. ومع ذلك، بسبب وجود خلافات أنواع محددة، التجارب على الحيوانات في كثير من الأحيان لا تقييم شامل لتأثير المركبات في البشر 1. لهذا السبب، من المهم لتوليد نماذج الأنسجة البشرية التي يمكن استخدامها لفي المختبر اختبارات العقاقير والمواد الجديدة.

واحدة من يركز مجموعتنا هو خلق في المختبر نماذج الاختبار مع سقالة بيولوجية لدينا أوعية دموية (BioVaSc) 2،3. وBioVaSc يمكن استخدامها كنظام مصفوفة 3D ساكنا أو متحركا. للثقافة ثابتة، يتم وضع الجزء decellularized صائمية الخنازير (المعوية الصغيرة تحت المخاطية SIS-MUC) في إدراج المعدن لإعادة زرع النبتة الخلية. خلايا مختلفة، مثل السرطان والخلايا البطانية يمكن تربيتها على منصة الاعدام.

4. لالمفاعلات الحيوية في مجال هندسة الأنسجة، والمفهوم الأساسي هو محاكاة الظروف في جسم الإنسان. حيث يتم توفير خلايا البيئة الطبيعية التي يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض ومصفوفة المحيطة بهم خارج الخلية. لإنتاج أنظمة اختبار في المختبر أو زرع، والقدرة على محاكاة البيئة الطبيعية للخلايا مع بنية الناقل مناسبة ونظام مفاعل حيوي أمر بالغ الأهمية 5. لذلك، يجب وضع أجهزة أكثر تعقيدا وتطلبا من الناحية الفنية من أجل تحقيق هذه المهام 6.

وعلاوة على ذلك فمن الممكن استخدام السقالة لدينا أنشأناishment نموذج أوعية دموية بسبب الهياكل الأنبوبية الحفاظ عليها، والتي تشمل الشريان التغذية، الوريد، والسرير الشعرية الموصل. تحتاج جميع خلايا الخنازير إلى إزالتها عن طريق decellularization الكيميائية والميكانيكية والأنزيمية، والسقالة تعقيم غاما. يمكن لاحقا أن reseeded الهياكل الأوعية الدموية أنبوبي استعادتها مع الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان باستخدام مفاعل حيوي إعادة تدوير نضح الذي يحاكي المعلمات النشاط الحيوي و / أو البيوكيميائية مثل الرقم الهيدروجيني، ودرجة الحرارة، والضغط، توريد المواد الغذائية وإزالة النفايات 6. إعادة تبطنن للهياكل أنبوبية يخلق ما يعادل الأوعية الدموية البشرية داخل السقالة 3،7 كولاجيني. في الخطوة التالية، سطح التجويف السابق (الغشاء المخاطي) يمكن المصنف مع الخلايا البشرية الأولية لإنشاء المشترك الثقافات 3،7،8.

في هذه الدراسة تم تعيين نظام اختبار الورم 3D بنسبة شارك في زرع خط خلية الورم مع شارع الرئيسيخلايا romal في ظل ظروف والدينامية على SIS-MUC.

Protocol

1. Decellularization من BioVaSc

  1. شطف الأوعية الدموية للجزء صائمية الخنازير عبر مقنى الوصول الشرايين وتجويف الأمعاء مع برنامج تلفزيوني -. كرر حتى أنها نظيفة تماما.
  2. إعداد 200 مم خزان الزجاج مع 4 محولات وربطها عبر أنابيب السيليكون إلى المضخة تحوي (ISMATEC). الضغط السيطرة على حدة يمكن رصدها عبر جهاز استشعار ضغط متصل قبة القابل للتصرف العقيمة (انظر الشكل 1).
  3. ملء زجاجات الخزان مع decellularization (DZ) حل والتحقق من نظام أنابيب لفقاعات الهواء ممكن.
  4. الاتصال تجويف الأمعاء العلاقات مع كابل إلى وصلات من الزجاج لتدفق اللمعية. ضخ 500 مل DZ الحل في الوصول الشرايين الحمراء (الشكل 1B) من نظام الأوعية الدموية. مقاطعة عملية الضخ كل 15 دقيقة قريبا للضغط يدويا من تجويف الأمعاء بأكملها.
  5. خلال decellularizatiعلى العملية، يجب أن يكون الضغط من حل العازلة بين 80-100 ملم زئبق، على غرار ضغط الدم الطبيعي.
  6. غسل BioVaSc مع برنامج تلفزيوني - حتى أنها خالية من بقايا الخلية ("بيضاء تماما").
  7. ملء BioVaSc تماما مع الحل DZ واحتضان أنها تغرق في حل DZ أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية على هزاز شاكر.
  8. كرر الخطوة 1.6.
  9. وضع BioVaSc في حل الدناز واحتضان أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية على هزاز شاكر.
  10. إزالة حل الدناز وشطف مع غسل العازلة.
  11. γ-التعقيم مع 25 كيلو جراى

2. أنواع مختلفة من الخلايا

2.1 عزل الخلايا الأولية الإنسان عن طريق الجلد الاوعية الدموية الدقيقة البطانية (mvECs) والخلايا الليفية

  1. قطع خزعة الجلد (يفضل قلفة) إلى شرائح من 2-3 مم عرض مع مشرط وشطف لهم 3x أخرى مع برنامج تلفزيوني - الحل.
  2. تغطية الأنسجة مع الحل Dispase واحتضان لمدة 16-18 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  3. البشرة منفصلة عن الأدمة مع 2 ملاقط ونقل كلا على حدة في أطباق بتري مليئة PBS +.
  4. الأدمة شطف شرائح 1X مع Versene.
  5. إضافة 10 مل التربسين / EDTA حل لشرائط الأدمة واحتضان في حاضنة لمدة 40 دقيقة.
  6. وقف رد فعل الانزيم على الفور مع 1٪ FCS.
  7. نقل شرائط الجلد إلى طبق بتري مليئة VascuLife والصفر من كل قطاع مع مشرط 8X كل جانب، مضيفا بقليل من الضغط.
  8. نقل تعليق خلية أنتجت خلال مصفاة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي وشطف 3X مصفاة الخلية مع VascuLife.
  9. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،200 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه الخلية مع VascuLife.
  10. لعزل الخلايا الليفية، الأدمة ختم الشرائط إلى قطع صغيرة باستخدام مشرط.
  11. إضافة 10 مل من محلول كولاجيناز إلى قطعة الأدمة.
  12. احتضان لمدة 45 دقيقة في الحاضنة، ثم الطرد المركزي أنه وإزالة بعناية سوpernatant.
  13. يغسل 1X بيليه مع DMEM + 10٪ FCS +٪ PenStrep، الطرد المركزي وذلك إزالة بعناية طاف.
  14. resuspend الكرية في مستنبت وتحويلها إلى قارورة ثقافة T75 للسماح للخلايا للتخلص من الأنسجة.

الخط 2.2 ورم الخلية S462

تم إنشاء خط خلية الورم S462 (شريطة التفضل الدكتور نيكولا هولتكامب، الطب جامعة شاريتيه برلين) من الخبيث الطرفية العصبية ورم غمد من مريضة مع وراثي نوع متلازمة الاستعداد الورم الورم العصبي الليفي 1 9. S462 يتم تربيتها في DMEM تستكمل مع FCS 10٪. المتوسطة يجب أن يتغير كل 2 - 3 أيام. مرة واحدة في الأسبوع الخلايا يجب أن الانقسام.

3. ورم اختبار النظام: ثابت الثقافة الشروط بالمقارنة مع الثقافة الديناميكية في أنظمة تفاعلات الاحيائية

  1. قطع أنبوبي SIS-MUC فتح على جانب واحد وإصلاحه بين اثنين من حلقات معدنية (التيجان خلية، 10 مم، والنفس جonstructed). تغطية SIS-MUC في الثقافة خلية متوسطة بين عشية وضحاها.
  2. خلايا البذور معزولة في أعداد الخلايا المحددة (انظر أدناه) على واحد أو كلا الجانبين من الهيئة العامة للاستعلامات (أحادية أو شارك في ثقافة انشاء).
    1. البذور 8،000 خلية / سم 2 من mvECs الأساسي في إجمالي حجم 100 ميكرولتر على سطح basolateral من الهيئة العامة للاستعلامات (المصلية السابق). ملء وقت لاحق 3 ساعة البئر مع المتوسطة لضمان ثقافة المغمورة.
    2. تسمح الخلايا البطانية على الانضمام لمدة 3 أيام. الوجه نظام الثقافة ثابت بنسبة 180 درجة وتحويلها إلى لوحة 12 جيدا.
    3. البذور خليط من الخلايا الليفية الجلدية الأولية (8،000 خلية / سم 2) والخلايا السرطانية (15،000 خلية / سم 2) ضمن وحدة تخزين ما مجموعه 500 ميكرولتر على سطح قمية من الهيئة العامة للاستعلامات (جانب التجويف السابق).
    4. تسمح للخلايا الالتزام لمدة 3 ساعة وملء البئر مع المتوسطة (الثقافة المغمورة والمتوسطة: 50٪ + 50٪ Vasculife DMEM تستكمل مع FCS 10٪).
    5. يتم تربيتها في نظام اختبار الورم في ظل ظروف ثابتة ور 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في الحاضنة لمدة 14 يوما إضافية. تغيير الثقافة المتوسطة كل 2 - 3 أيام.
  3. للثقافة ديناميكية، وتحديد SIS-MUC بين اثنين من حلقات معدنية والبذور mvECs الأولية كما هو موضح في 3.2.1. بعد 3 أيام إزالة SIS-MUC من حلقات معدنية وإدراج غشاء المفاعل في التدفق (انظر الأرقام 2C و 2D). تطبيق الخلايا الليفية الجلدية والخلايا السرطانية الأولية مع حقنة وقنية على مصفوفة في مفاعل حيوي، وتسمح للخلايا الالتزام لمدة 3 ساعة قبل ملء نظام مفاعل حيوي مع الثقافة المتوسطة.
  4. على الشروط التالية ثقافة اليوم ديناميكية مع تدفق مستمر المتوسطة (3.8 مل / دقيقة، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) ويمكن أن تبدأ. يتم الحفاظ على ثقافة ديناميكية لمدة 14 يوما، يتم تغيير ثقافة المتوسط ​​بعد 7 أيام.
  5. الإعداد اختبار الديناميكية هو مثقف في حاضنة-شيدت الذاتي الذي يوفر تدفق وسائل الإعلام من خلال مضخة وضرورية درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2

4. طرق توصيف لتحليل

4.1 إصلاح والبارافين التضمين من المصفوفة كولاجيني المصنفة

  1. ل(المناعية) الأوصاف النسيجي إزالة مستنبت وإصلاح الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 2 ساعة.
  2. إزالة 4٪ بارافورمالدهيد ونقل SIS من إدراج المعدن إلى الأنسجة تضمين الكاسيت. المياه في الأنسجة لإزالة ما تبقى تثبيتي، ويذوى للتسلل البارافين.
  3. قبل التضمين في كتلة البارافين، وقطع SIS في 2 - 3 شرائح ووضعها في قالب معادن عادية مليئة البارافين بحيث مواجهة قطع الأسطح أسفل. إضافة الكاسيت الأنسجة على الجزء العلوي من العفن باعتباره الدعم.
  4. قطع 5 ميكرون شرائح وتطفو بها على حمام مائي 40 ° مئوية لمدة استقامة، ثم تحميل الشرائح على الشرائح الزجاجية مناسبة. وتستخدم الشرائح غير المصقول لH & E البقع، والشرائح المغلفة متعدد الليزين لتلطيخ immunohistological لتحسين المرفق.دعونا شرائح يجف تماما.
  5. تذوب البارافين، إزالته مع الزيلين وترطيب للشرائح التالية تلطيخ.

4.2 تلطيخ

  1. يمكن أن تكون ملطخة شرائح ممهى مع الهيماتوكسيلين / يوزين كما لمحة تلطيخ موحدة.
  2. لتلطيخ immunhistological، الثابتة ويجب شرائح الأنسجة تسلل البارافين الخضوع لاسترجاع مستضد للسماح الأجسام المضادة الاعتراف وربط الحواتم محددة. وبالتالي، deparaffinized وتوضع الشرائح ممهى في طنجرة البخار مع العازلة سيترات ساخنة (درجة الحموضة 6.0) لمدة 20 دقيقة.
  3. نقل الشرائح لغسل العازلة (0.5 M TBS عازلة + 0.5٪ توين) وشرائح دائرة بالقلم PAP لتقليل حجم المطلوب لحلول تلطيخ.
  4. ضع الشريحة في غرفة الرطوبة. لتأمين الفجل البيروكسيداز بوساطة التصور محددة مستضد الضد ملزمة، يجب أن تشبع البيروكسيداز الذاتية مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين.
  5. antib الابتدائييتم تطبيق التخفيفات ODY إلى شرائح، المحتضنة لمدة 1 ساعة على RT وغسلها بعناية قبالة مع غسل العازلة.
  6. للكشف عن الارتباطات ضد مستضد محددة الترا يستخدم الرؤية Quanto نظام لكشف HRP DAB (الحرارية العلمية) وفقا لبروتوكول الموصى بها.
  7. وcounterstained نوى مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة.
  8. هي التي شنت الشرائح مع وسط مائي، والمجففة، وتصويرها باستخدام مجهر العكسية.

Representative Results

كما هو مبين في الشكل 1B، ونحن decellularized الجزء صائمية الخنازير (حوالي 2 متر في الطول و 20 ملم في القطر) مع الحفاظ على هياكل أنبوبية للشبكة الشعرية. بعد الكيميائية، والأنزيمية decellularization الميكانيكية، حصلنا على سقالة الكولاجين I / III، والتي يمكن استخدامها لزراعة الخلايا 3D. وأجري اختبار فولغين للتدليل على نقاء (أي بقايا الحمض النووي) من المصفوفة (لا تظهر البيانات).

أرقام 2A و 2B تظهر ثقافة ثابتة من SIS-MUC مضمونة التيجان الخلية. نحن إصلاح SIS-MUC في مفاعل حيوي في منزل تصميم (الشكل 2C) للثقافة ديناميكية. يوضح الشكل 2D تدفق الحيوية من خلال محاكاة غرفة مفاعل حيوي. يتم وضع مفاعل حيوي في نظام حاضنة المكونة داخليا ومتصلة مع مضخة تحوي. هذا الإعداد يسمح ثقافة ديناميكية مع أي ضغط ينظم تدفق نابض أو ج تدفق ONSTANT.

يعطي الشكل 3 لمحة عامة عن S462 الورم خط الخلية مثقف بشكل ثابت في 2D الأحادية (الشكل 3A) و3D coculture (أرقام 3B-3D) ويبين الشكل 3B ثقافة الثلاثي من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية الأولية S462 على الجانب قمية من SIS -MUC (الجانب التجويف الداخلي السابق) وmvEC على الجانب basolateral (الجانب المصلية السابق). تحديد أنواع مختلفة من الخلايا ممكن عن طريق تلطيخ علامات محددة خلية من نوع، مثل عامل فون ويلبراند لتسمية mvEC (الشكل 3C). الخلايا S462-P53 إيجابية يمكن تمييزها عن البروتين p53 السلبية الخلايا الليفية الأساسية (الشكل 3D) وتوزيع 3D من الخلايا يمكن تحليلها. ويبين الشكل 4 stainings يعادل الرقم 3 للثقافة الثلاثي مثقف بشكل حيوي.

0460/50460fig1.jpg "/>
الشكل 1. Decellularization انشاء. (أ) تفاعلات الاحيائية ومضخة انشاء لdecellularizing في BioVaSc، يرصدها جهاز كمبيوتر. (B) Decellularized BioVaSc في خزان الزجاج. يتم توصيل التجويف الشرياني ومدخل إلى المحولات. .

الرقم 2
الشكل 2. نظر أكثر من ثقافة مختلفة مجموعة عمليات. (أ) عرض القسم CAD نظام الثقافة ثابتة في عيار مكروي لوحة جيدا، (ب) إدراج المعدن للثقافة ساكنة، (C) محاكاة تدفق المتوسطة (حقل سرعة [م / ثانية]) للثقافة ديناميكية من الغطاء العلوي للمفاعل حيوي تدفق ، (D) مفاعل حيوي تدفق للثقافة ديناميكية متصلة مضخة تمعجية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية

الأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 3
الرقم 3. نظرة عامة على توصيف immunohistological من ساكنة نموذج الورم 3D. (A) الهيماتوكسيلين وصمة عار للمثقف بشكل ثابت الثقافة 2D أحادية الخلايا S462 على شريحة Permanox، (B) H & E وصمة عار للثقافة الثلاثي 3D مثقف بشكل ثابت، سهام بمناسبة الخلايا البطانية، (C) تلطيخ immunohistological لعامل فون ويلبراند، (D ) تلطيخ immunohistological عن البروتين p53. انقر هنا لعرض أكبر شخصية

الرقم 4
(B) تلطيخ immunohistological لعامل فون ويلبراند، (C) تلطيخ immunohistological عن البروتين p53. انقر هنا لعرض أكبر شخصية

Discussion

عند المقارنة بين أنظمة الثقافة 2D و 3D في مجال البحوث السرطانية، ونظم 3D، على الرغم من كونها نهج أكثر تكلفة، وقد ثبت لمحاكاة الظروف في microenvironments البيولوجية أفضل. ويمكن أن يتبين أن بعض الخلايا السرطانية تنمو أبطأ بكثير في ثقافة 3D مما كان عليه في ثقافة مشتركة 2D 12، والذي هو وفقا للحالة في الورم الحقيقي. أظهرت بيسيل وزملاء العمل في عملهم أن سلوك خلايا الثدي المسرطنة في الجسم الحي يعكس الوضع، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا والإشارات، أكثر دقة عندما ثقافة 3D داخل مصفوفة يقدم التفاعلات خلية ECM. وعلاوة على ذلك، فإنها شددت على أهمية البيئة خارج الخلية في 3D من خلال إظهار أن التغييرات في التفاعلات البيئية أدت إلى الارتداد من الخلايا الخبيثة إلى النمط الظاهري العادي. بالإضافة إلى ذلك، والأهم من ذلك، ويمكن أيضا أن يتم تأكيد هذه النتائج في النماذج الحيوانية في الجسم الحي 10،11.

ontent "> المقارنة المباشرة لفي الجسم الحي التجارب على الحيوانات ونماذج الأنسجة في المختبر يكشف مزايا وعيوب في كلا النظامين. ميزة واحدة من نماذج في المختبر هو إذن من أفضل بكثير في الوقت الحقيقي أو التصوير الثابت بواسطة المجهر. وجود قيود هو أن أنها تحاكي ظروف ثابتة أو قصيرة الأجل، في حين نظم في الجسم الحي في كثير من الأحيان التقدم. إن النقص الحالي في الأوعية الدموية والنقل العادية من جزيئات صغيرة، استضافة الاستجابات المناعية، وغيرها من التفاعلات خلية خلية هي مزيد من عيوب في المختبر نماذج 12. لذلك، 3D في أنظمة المختبر كما وردت في هذه الدراسة تقدم إضافة واعدة إلى التجارب على الحيوانات. أنها توفر المقارنة أفضل للكائن البشري، وبالتالي تقليل تفسيرات التجريبية. المحاكاة البيولوجية في الجسم الحي ونظم نموذج بالتالي تصبح أكثر ذات الصلة لدراسة كيفية انتشار السرطان النقيلي وتعتمد على الشروط التي تنظم microenvironmental tumorigenesis 11.

دراستنا تبين أن البيئة 3D التي تقدمها SIS-MUC يؤدي إلى تشكيل أكثر مثل ورم الأنسجة من الخلايا، التي لم تراع في خلية ثقافة 2D المشتركة (انظر الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا الأولية المستمدة من الخزعات الورم هو خطوة هامة جدا نحو الطب الشخصي، والانضباط الذي يهدف إلى تحديد أفضل علاج تبعا لاحتياجات المريض الفردية. وسوف يتضمن الخلايا السرطانية المريض محددة معزولة عن المواد الأولية خزعة تسمح في اختبار المختبر من الاستراتيجيات العلاجية. ونظم الاختبار مثل هذه تجعل من الممكن للتحقيق في الأدوية وتركيبات مختلفة منها في الوقت وتوفير التكاليف الإنتاجية العالية الفرز. بالإضافة إلى ذلك، ودمج الخلايا اللحمية المرتبطة الورم كما هو موضح في هذه الدراسة مهمة للنهج شخصية، منذ المكروية تأثيرات الورم ورم تطور 13 و قد يثبت كما suitabالهدف العلاجي جنيه.

بدلا من ذلك إلى نهج شخصية، نموذج الورم لدينا يمكن تعديلها لتكون بمثابة نظام اختبار الورم معمم عن طريق دمج خطوط الخلايا الورمية المعمول بها. هذا هو التكيف واعدة لأغراض البحوث الأساسية. لكل اختبار المخدرات النهج مطلوب وجود بنية الأوعية الدموية لاختبار توزيع وامتصاص المواد العلاجية. مصفوفة-SIS MUC يسمح للالبذر basolateral مع mvEC الأولية للدراسات امتصاص الحاجز، فإن إعادة زرع النبتة من هياكل الأوعية الدموية الحفاظ على BioVaSc زيادة تحسين دراسة تسليم المخدرات.

من أجل خلق نماذج الأنسجة، مصفوفة قابلة للتحلل 3D يمكن استخدامها كإطار لثقافة مشتركة من أنواع مختلفة من الخلايا 14. استخدام مثل هذه المصفوفات 3D غالبا ما تكون محدودة بسبب عدم وجود من الأوعية الدموية وظيفية. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق استخدام BioVaSc، والذي يقدم الحفاظ شارع الأوعية الدمويةuctures، والتي يمكن reseeded مع الخلايا البطانية. علاوة على ذلك، يوفر BioVaSc مكونات الخلية، والتي تضمن التصاق الخلايا والأنسجة تسهيل التمايز. فإنه يمكن أيضا وظيفة الأنسجة فترة طويلة محددة من الأنسجة الحيوي الصناعي 3D 7،8،15. شرط مسبق لهندسة بدائل وظيفية الأوعية الدموية هو محاكاة من الفيزيولوجية البشرية وظروف النشاط الحيوي. لذلك، نظم مفاعل حيوي، والتي يمكن تنفيذ هذه المتطلبات في المختبر، هي من مصلحة المتطرفة لخلق نماذج الورم البيولوجية.

مزيج من BioVaSc، والتكنولوجيا مفاعل حيوي وشارك في زراعة مختلف أنواع الخلايا هي طريقة واعدة جدا لتوليد أنسجة الورم أوعية دموية، والتي سوف تسمح للدراسة الآليات ذات الصلة لتطور سرطان مثل الأوعية الدموية والانبثاث. ونحن نرى مثل هذه النماذج الورم كنهج واعدة لاستكمال الدراسات الحيوانية من خلال توفير ما يعادللعلم وظائف الأعضاء البشرية الورم.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر يناير Hansmann (فراونهوفر مجلس الحبوب العراقي، شتوتغارت) لدعمه التقني لتطوير المفاعلات الحيوية والحاضنة مفاعل حيوي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase solution SERVA 17454 (500 U/ml)
Dispase solution Gibco 17105-041 (2.0 U/ml)
DMEM, high-glucose PAA G0001,3010
DNase ROCHE 10104159001 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep
DZ solution Roth 3484.2 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water
FCS LONZA DE14-801F
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP DCS PD000KIT
medical pressure transducer MEMSCAP SP844
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor DAKO Cytomation M0616 Clone F8/86 0.12 μg/ml
mouse monoclonal anti-human p53 DAKO Cytomation IS616 Clone DO-7 ready-to-use
peristaltic pump Ismatec
sterile disposable dome MEMSCAP 844-28
Trypsin / EDTA solution PAA L11-003 0,05%
VascuLife (VEGF-Mv) Lifeline LL-0003
Versene Gibco 15040-033

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).
  2. Pusch, J., Votteler, M., et al. The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine. Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).
  3. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).
  4. Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. Principles of tissue engineering. 3rd, Elsevier Academic Press. Burlington, MA. (2007).
  5. Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review. Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).
  6. Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. The role of bioreactors in tissue engineering. Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).
  7. Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation. Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).
  8. Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research. Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).
  9. Holtkamp, N., Atallah, I., et al. MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors. Neoplasia. 9, 671-677 (2007).
  10. Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  11. Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. Translating tissue engineering technology platforms into cancer research. J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  14. Yang, S. -T., Zhang, X., Wen, Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).
  15. Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model. J. Urol. 173, 276-280 (2005).

Comments

2 Comments

  1. Hi, I am currently working on fish guts and am interested in trying to apply your method to my tissue sections. Would it be possible to find out a little more information about the process, especially the self made rings. Information such as what material was used and tensile strength would be ideal and whether you had tried going smaller then 10mm with any success?

    Reply
    Posted by: Laura L.
    August 21, 2013 - 9:18 AM
  2. Hi,
    thanks for your comment and your interest to adapt our method.
    The metal rings we use are out of stainless steel (V4A). We tried out smaller diameters as well. Therefore we used the cell crown inserts from Scaffdex (http://www.scaffdex.com/sivut/cellcrownâ;„¢48), that are commonly available for 6 / 12 / 24 / 48 and 96 well plates. For our application the 48 well plate inserts were too small, because the porcine gut matrix is very rigid. But maybe it's suitable for your fish guts!?
    About the tensile strength I can not tell you a number, we never measured the strength, it depends also on the tolerances with which your rings are manufactured.
    We wish you success with your experiments.
    Best regards.

    Reply
    Posted by: Jenny R.
    August 22, 2013 - 8:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics