Erwachsene Maus venöse Bluthochdruckmodell: A. carotis communis, um äußere Jugularvene Anastomose.

Medicine

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Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen einer zuverlässigen Modell der zerebralen venöse Hypertonie in der adulten Maus. Dieses Modell ist vielfältig beschrieben und geprüft bei der Ratte ist. Diese neue Gegenstück in den Mäusen eröffnet die Möglichkeit der Verwendung von gentechnisch veränderten Tieren und verbreitert, wodurch die Anwendungen des Modells.

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Yang, S. T., Rodriguez-Hernandez, A., Walker, E. J., Young, W. L., Su, H., Lawton, M. T. Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.. J. Vis. Exp. (95), e50472, doi:10.3791/50472 (2015).

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Abstract

Das Verständnis der Pathophysiologie von Gehirn arteriovenösen Fehlbildungen und arteriovenösen Fisteln hat dank Tiermodellen verbessert. Ein Rattenmodell die Schaffung eines künstlichen Fistel zwischen der A. carotis communis (CCA) und der externen Halsschlagader (EJV) ist vielfältig beschrieben und bewiesen technisch möglich ist. Dieses Konstrukt provoziert eine konsistente cerebralvenösen Hypertonie (CVH), und damit dazu beigetragen hat die Untersuchung der Beteiligung von venöser Hypertonie, um die Bildung, die klinischen Symptome und der Prognose von Gehirn AVMs und Dura AVFs. Entspricht Mäusen Modelle wurden nur knapp beschrieben und haben Probleme mit Stenose der Fistel gezeigt. Ein etabliertes Mausmodell würde das Studium nicht nur Pathophysiologie, sondern auch potenzielle genetische Therapien für diese zerebrovaskuläre Erkrankungen ermöglichen.

Wir präsentieren ein Modell der arteriovenöse Fistel, die eine dauerhafte Hirnvenenbluthochdruck in der Maus erzeugt. Mikrochirurgische Anastomose of murinen CCA und EJV kann schwierig sein, aufgrund von winzigen Anatomie und in einem nicht-Patent Fistel häufig führen. In diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll sprechen wir alle wichtigen Herausforderungen bei diesem Vorgang auftreten. Vermeidung übermäßiger Zurückziehen der Vene während der Belichtung mit 11-0 Nähte statt 10-0, und machen eine sorgfältig geplante End-zu-Seit-Anastomose sind einige der wichtigsten Schritte. Obwohl diese Methode erfordert erweiterte mikro Fähigkeiten und eine längere Lernkurve, die den Gegenwert in der Ratte, es konsequent weiterentwickelt werden kann.

Dieses neuartige Modell wurde entworfen, um Transgene Maus Techniken mit einer zuvor etablierten experimentellen Systems, das auf die Gehirn AVMs und Dura AVFs untersuchen erwiesen integrieren. Durch Öffnen der Möglichkeit der Verwendung von transgenen Mäusen kann ein breiteres Spektrum von gültigen Modellen erzielt werden und genetische Anwendungen können ebenfalls getestet werden. Die experimentelle Konstrukt könnte auch auf die Untersuchung von ot angepasst werdenihr zerebrovaskuläre Erkrankungen mit venösen Bluthochdruck wie Migräne, transiente globale Amnesie, transiente monokulare Blindheit usw. verwandt

Introduction

Tiermodelle der Hirnvenenbluthochdruck haben sich als ein wichtiges Instrument für das Verständnis der Pathophysiologie des Gehirns arteriovenöse Malformationen und arteriovenöse Fisteln 1-7 sein. Das am häufigsten verwendete ist die Ratten-Modell durch eine künstliche Fistel zwischen der Arteria carotis communis (CCA) und die äußere Jugularvene (EJVs), die eine konsistente cerebralvenösen Hypertonie (CVH) bei der Ratte 1,8-10 provoziert erstellt. Äquivalent Mäusemodellen, indem die Möglichkeit der Verwendung verschiedener transgener Mäuse Stämme wären weitere Studie über nicht nur Pathophysiologie sondern auch möglichen genetischen Therapien für diese zerebrovaskuläre Erkrankungen ermöglichen. Ferner sind die Versuchs Konstrukt könnte auch auf die Untersuchung von anderen zerebrovaskulären Krankheiten mit venöser Hypertonie, wie Migräne, transienten globalen Amnesie, transiente monokulare Blindheit usw. 11 Frühere Versuche im Zusammenhang geeignet ist, diese Mäusemodellen h konstruierenave demonstriert die Schwierigkeiten mit der Durchgängigkeit der Fistel aufgrund der winzigen anatomischen 5,12. Hier beschreiben wir die Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine erfolgreiche Anastomose des murinen CCA und EJVs die in einen langfristigen Patent Fistel und einem haltbaren venöse Hypertonie in der Maus übersetzt.

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Protocol

1. Vorbereitung der Maus

  1. Induzieren Vollnarkose in der Maus mit Isofluran Gas. Injizieren 0,15 ml intraperitoneale brupenorphine für die Schmerztherapie. Überprüfen Sie zunächst, ob die Narkoseniveau ist durch Einstechen Pfoten die Maus zufriedenstellend.
  2. Sie mit der Maus in Rückenlage mit den vier von Klebeband fixiert Gliedmaßen. Entfernen Sie die Haare des Halses und der oberen Brustbereich mit einer Schere. Subkutane Injektion verabreichen 0,2-0,4 ml 0,9% Kochsalzlösung, um die Maus während des chirurgischen Eingriffs mit Feuchtigkeit versorgt.
  3. Bereiten Sie das Operationsfeld nach einem strengen sterilen Verfahren. Das Gebiet der Hautschnitt sollte mit 90% Alkohol gereinigt werden.

2. Präparieren der Arteria carotis communis und die äußere Jugularvene

  1. Machen Sie eine horizontale Mittellinie Hals-Schnitt über den unteren Halsbereich der Maus. Nachdem die Vertiefung der Wunde, erhöhen die Speicheldrüsen und Halsweichteile unter Verwendung vonraction Fadens (Abbildung 1). Setzen Sie die rechte äußere Jugularvene (EJV) lateral des M. sternocleidomastoideus (SCM). Dieser Schritt sollte unter dem Mikroskop durchgeführt werden, da zu hohe Traktion über die Vene zu Beschädigungen und induzieren ihre Thrombose.
  2. Das Recht EJV entlang seinem Kurs sorgfältig sezieren vom Schlüsselbein zur Schädelbasis. Normalerweise elektrischen bipolaren Zange, gerinnen und teilen alle Branchen, um eine ausreichende Länge für die spätere temporäre Klammer Platzierung und Anastomose vorzubereiten.
  3. Lateral der Luftröhre und medial des SCM, erkunden Sie die A. carotis communis (CCA). Es sollte vorsichtig aus dem Schlüsselbein gerade jenseits ihrer Gabelung in die externen und internen Karotisarterien ausgesetzt werden. Während dieser Stufe sollte die Aufmerksamkeit wieder gegeben übermäßigen Zug am EJVs die später beeinträchtigen könnte die Durchgängigkeit der Anastomose zu vermeiden.

3. Vorbereitung des Anastomose

  1. Ligieren die CCA mit 10-0 Nylon proximal ihrer Bifurkation. Anschließend eine temporäre Clip über das proximale CCA so nahe dem Schlüsselbein wie möglich.
  2. Sobald die Strömung unterbrochen wurde, durchschneiden die Arterie knapp Bifurkation Ligatur und bewässern sie mit Kochsalzlösung in das Innere des Lumens auszuwaschen verbleibende Blut. Vermeiden bipolare Koagulation in diesem Schritt, da die thermische Schädigung der Arterienwand könnte die Zukunft Anastomose in Gefahr bringen.
  3. Um die Sichtbarkeit der Kanten des EJV verbessern, wird die mediale Wand mit einem blauen Markierungsstift entlang des Verlaufs der geplanten Venotomie markiert. Sobald die EJVs markiert ist, mit einem 10-0 Naht um das distale Ende als Schwanz möglichst ligieren und Anwendung einer temporären Gefäßclip an dem proximalen Ende als Schädel wie möglich.
  4. Mit einer feinen Nadel 30 G und 0,5 ml Spritze, vereinbaren Sie einen Anfangsöffnung über den markierten Bereich der EJV und sofortige Spülung mit Kochsalzlösung in das Lumen zur Thrombusbildung zu vermeiden. Als nächstes erweitern die Venenschnitt mit den Mikroscherebis die Länge ist etwa 2-3 mal der Durchmesser des CCA. Vermeiden Sie gewaltsame Dehnung und achten Sie auf eine scharfe und saubere Schnittkante zu halten.
  5. Näherung für das Ende des CCA in die EJV. Einen Taillierung Einschnitt im Spenderende des CCA um den Durchmesser zu Länge zum Venotomie Größe (2) einzustellen.

4. End-zu-Seit-Anastomose

  1. Verwenden Sie einen 11-0 Monofilament Nylonfaden für das CCA-to-EJV Ende-zu-Seit-Anastomose. Naht der medialen Wand der Anastomose in einem craneo-kaudal ist der erste Schritt. Jeder Stich sollte von außen in die Venenwand ersten (Abbildung 3) von innen nach außen der Arterienwand (Abbildung 4) neben platziert und. Dadurch wird der Knoten auf der Außenfläche der anastomotischen Gefäße zu allen Zeiten (Abbildung 5) zu halten. Entweder unterbrochen oder kontinuierliche Fäden verwendet werden können, aber alle kontinuierliche Nähte sollten als Endstufe angezogen werden.
  2. Once der medialen Wand wurde genäht hat, wiederholen Sie den Vorgang von kaudal mit der Seitenwand kranial. Nun sollte jeder Stich von außen in die Arterienwand erste und von innen nach außen der Venenwand neben platziert werden. Saline Bewässerung wird dazu beitragen, das Lumen der Anastomose jederzeit sichtbar während des Verfahrens.
  3. Nach Abschluss aller Schritte der Anastomose erster und aus der Arterie entfernen zunächst die temporäre Clip aus der Vene. Das arterielle Blut wird in den EJV mit keiner oder wenig Nässen aus der Anastomose fließen (siehe Videos VH und VH-Modell Modell 2). Die minimale Blutung sollte ohne Baumwolle Kompression über die Anastomose zu stoppen. Diese müssen, um eine Thrombose des empfindlichen Vene verhindert vermeiden.
  4. Einmal durch die pulsierende Anastomose fließen wird bestätigt und keine sichtbare Blutungen beobachtet wird, bewässern das Operationsfeld mit Kochsalzlösung und schließen Sie den Hals-Schnitt mit 6-0 Nylonnaht. Schließlich verwalten 0,15 ml mehr intraperitoneal brupenorphine zur postoperativen Schmerztherapie und 0,2-0,4 ml subkutane 0,9% Salzlösung, jede Blutverlust während der Operation wieder aufzufüllen.

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Representative Results

Ein erfolgreiches Ergebnis des Modells ist ein Patent arteriovenöse Fistel, die venöse Hypertonie im murinen Gehirn induziert. Um das Modell zu validieren wir zunächst den intrakraniellen Venendruck in der sagittalen Sinus der Mäuse gemessen bei 2, 3 und 4 Wochen nach der Operation. 6 verschiedene Mäuse wurden für jede Zeitgruppe zugewiesen. Der Sinus Druck betrug 8,8 ± 1,2 mmHg in der Gruppe, gemessen zwei Wochen nach der Operation. In den 6-Mäusen gemessen 3 Wochen nach der Operation, die Sinus Druck betrug 4,7 ± 1,4 mmHg. Schließlich messen die 6 Mäuse 4 Wochen nach der Operation hatte eine Sinus Druck von 3,9 ± 0,6 mmHg (Abbildung 6). Postoperative 2 Wochen Sinus Druck war signifikant höher als Sinus Druck bei 3 und 4 Wochen (jeweils p <0,001).

Allerdings ist die komplexe Technik, um die Sinus Druck messen erforderlich nicht notwendig Fistel Durchgängigkeit und venöse Hypertonie regelmäßig gewährleisten. Stattdessen kann das gewünschte Ergebnis Cdurch direkte Inspektion der Fistel und klinischen Zeichen einer venösen Bluthochdruck in der Maus hecked.

Die Durchgängigkeit der Fistel kann direkt am Ende des chirurgischen Eingriffs durch zwei Verfahren untersucht werden. Die erste besteht aus vorübergehenden Behinderung der EJV kranial der anastomsis Bereich mit einer Pinzette ein Juwelier. Dieser Punkt ist nun der einzige Abfluss des Blutes aus der CCA. Wenn die End-zu-Seit-Anastomose ist Patent wird die dehnbare EJVs sofort Ballon aus, wie in der Durchgängigkeitstestvideo 1. Bei der zweiten Methode dargestellt wird durch Verschließen des Venentransplantats distal der Anastomose und langsam Entleeren oder "Melken" it geführt mit einer Pinzette Juwelier. Wie im zweiten Video für Durchgängigkeitsprüfung gezeigt, sobald der Verschluss freigegeben wird, ein Patent Anastomose sollte schnell nachfüllen geleert Segment.

Wenn das Modell funktioniert, sollte die Erweiterung der Maus Auge 24 Stunden nach der Operation festgestellt werden. Diese may aufgrund umfasste venösen Abfluss von Kopf und Hals. Obwohl beide Augen vergrößerte nach der Operation ist das Phänomen mehr im Vordergrund der operierten Seite wie in 7 zu beachten.

Figur 1
Abb. 1: Hautschnitt eine horizontale Mittellinie Hals-Schnitt über den unteren Halsbereich der Maus und einem weichen Traktion der Speicheldrüsen setzt den rechten Vena jugularis externa (EJV). Notieren Sie sich die oberflächliche Lage des EJV, die eine sorgfältige Hautschnitt, um Verletzungen der empfindlichen Vene verhindert garantiert.

Abbildung 2
Abb. 2: Vorbereiten der Anastomose Die mediale Wand des EJV mit einer blauen Linie auf der Strecke der geplanten Venotomie markiert. Ein Seitenschnitt incision im Spenderende des CCA durchgeführt wird, um den Durchmesser der Arterie zu der Länge zu dem Venenschnitt einzustellen.

Figur 3
Abb. 3: Outside-in Die mediale Wand der Anastomose wird in einer craneo-kaudal mit dem 11-0 Stich ersten von außen in der Venenwand platziert vernäht.

4
Abb. 4: Inside-out Die Nadel wird hier von innen nach außen die Arterienwand, um eine Naht in der medialen Wand in geeigneter Weise zu vervollständigen, um den Knoten auf der Außenfläche der Anastomose zu halten angetrieben.

Abbildung 5
Abbildung 5: Halten Sie den Knoten außerhalb Hinweis ho.w der Knoten der Knopfnaht dabei so gewählt bleibt außerhalb der Lumen der Gefäße zur Thrombusbildung, die die Fistel zu verschließen würden, zu vermeiden.

Figur 6
Abb. 6: Sinus Druckanalyse Diese bart Diagramm zeigt grafisch den Unterschied in der intrakraniellen Sinus Druck in mmHg nach der Operation gemessen bei 2, 3 und 4 Wochen.

7
Abb. 7: Einen Tag nach der Operation Proptosis, beide Augen vergrößert, aber das rechte Auge Erweiterung (ipsilateral zur Operation) ist mehr im Vordergrund.

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Discussion

Anhaltende Hirnvenenbluthochdruck hat eng mit schweren klinischen Manifestationen und schlechter Prognose bei Patienten mit Dura AVFs und Gehirn AVMs 3 zusammen. Diese Wirkungen von CVH wurden weitgehend in Rattenmodellen 1,2,8 sucht. Eine entsprechende Modell in der Maus würde die Verwendung von gentechnisch veränderten Tieren, die letztlich erlauben würde die Analyse der molekularen Signalwege auf die Pathogenese der venösen Bluthochdruck und seine Beziehung mit der Dura AVF und Gehirn AVM beteiligt ermöglichen.

Hier berichten wir ein Verfahren zum Erzeugen einer Hirnvenenbluthochdruck in der adulten Maus durch ein Ende-zu-Seite-Karotis-jugulare Fistel. Dieses neue Modell erhöht die gut beschriebene Karotis-Halsschlag Fistel Modelle in der Ratte durch die Übersetzung an die Maus und damit die oben erwähnten Möglichkeit der Untersuchung von molekularen Signalwege und Gentherapien ermöglicht.

Häufige Probleme und Vorschläge

Ein weiteres gemeinsames Problem wird eine Beschädigung der Vene mit übermäßigen Zug-, Druck- oder Dissektion entlang seinem Kurs. Daher muß die EJVs Belichtungs sorgfältig unter dem Mikroskop durchgeführt werden, um die geeignete Ebene der Dissektion zu identifizieren. All die kleinen Zweige, die in sie entleeren sollte auch erkannt und koaguliert werden. Dadurch wird vermieden, unkontrollierte Blutungen Kompression der Vene erforderlich und genügend Redundanz zu hohe Spannungen zu vermeiden.

Es ist nicht ungewöhnlich, um schlechte Funktion der Fistel nach dem Entfernen der temporären Clips haben. In diesem Fall sollte der erste Schritt sein, überprüfen Sie mögliche Spannungspunkte oder Winkelung in der CCA. Weitere Dissektion der Arterie oder teilweise Resektion des M. sternocleidomastoideus wird dieses Problem lösen. Allerdings, wenn schlechte Funktion auch nach diesen Manövern, Thrombose der Anastomose muss vermutet werden. In diesem Fall wird anstelle der Wiedereröffnung der Anastomose und das Entfernen des Thrombus, empfehlen wir die Durchführung einer neuenAnastomose kranial des vorherigen. Nach unserer Erfahrung ist eine dritte Anastomose unmöglich. Es ist nicht genügend Länge des EJV und die Maus nicht Anästhesie vertragen einen so langen Zeitraum.

EINSCHRÄNKUNGEN DER TECHNIK

Die wichtigsten Einschränkungen dieser Technik sind: (1) die Verkleinerungs Anatomie der Gefäße erfordert erweiterte mikro Fähigkeiten und eine längere Einarbeitungszeit als für das Ersatzmodell in der Ratte; (2) die Durchgängigkeit der Anastomose wird oft durch die Thrombusbildung und die Länge des Maus EJVs beeinträchtigt wird nur einem zusätzlichen Versuch, dieses Problem zu lösen, zu ermöglichen; und (3) der Operation kann bis zu drei Stunden in Anspruch nehmen, indem die Maus auf eine lange Periode der Anästhesie. Im Anschluss an die technischen Vorschläge oben vorgeschlagen und halten Sie die Maus warm und hydratisiert während des Verfahrens kann ein Patent CCA-to-EJV erfolgreich durchgeführt werden und eine hohe Überlebensrate der in unserer Erfahrung erreicht Tiere.

Eine zuverlässige und dauerhafte Hirnvenenbluthochdruck-Modell bei Mäusen ist ein wichtiges Instrument, das eine breite Reihe von Zwecken in Hirnforschung 13-16 dienen kann. Durch die Zugabe von Knockout-Technologie von transgenen Mäusen, sollte dieses neue Modell weitere Gene-Related in vivo Forschung für alle Pathologien, die mit Hirnvenenbluthochdruck zu erleichtern.

Zuvor haben andere Autoren die venöse Hypertonie-Modell bei der Ratte beschrieben und haben es verwendet, um die Pathophysiologie der Dura AVF und Gehirn AVM 4,5,8,9 studieren. Wir beschreiben nun die Methode, um erfolgreich zu übersetzen das gleiche Modell mit den Mäusen, öffnet somit seine Anwendungsmöglichkeiten für alle Arten von genetischen Behandlung Tests.

Abschluss

Wir zeigen hier ein Protokoll, ein Patent CCA-to-EJV Anastomose in der erwachsenen Maus zu erreichen. Diese Fistel bieteteine dauerhafte Hirnvenenbluthochdruck, die gewesen ist ein nützliches Tool, um verschiedene zerebrovaskuläre Erkrankung Modelle bei der Ratte zu entwickeln. Durch die Bereitstellung dieser erste Schritt, um die gleichen Modelle in den Mäusen zu entwickeln, eröffnen wir die Möglichkeit, die Prüfung der genetischen Behandlungen für diesen zerebrovaskuläre Erkrankungen.

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Disclosures

Die experimentellen Verfahren mit Labortieren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of California, San Francisco (UCSF) zugelassen.

Die Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte auf die Medikamente und Materialien in diesem Verfahren verwendet verwandt.

Acknowledgements

Das Projekt wird teilweise durch die NIH T32 GM008440 zu Espen Walker, R01 NS27713 William L.Young, P01 NS44155 William L.Young und Hua Su, R21 NS070153 Hua SU und von der American Heart Association AHA 10GRNT3130004 Hua Su unterstützt. Dr. Ana Rodríguez-Hernández wird durch einen Zuschuss von "Obra Social La Caixa" unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 Sterile Microsuture Arosurgical Ic. VT5A010Q10
11-0 Sterile Microsuture Arosurgical Ic VT4A00N07
DUROTIP Scissors Aesculap BC210R
Micro-Adson Tissue Forceps Aesculap BD510R
Microscissors Aesculap OC496R
Micro Forceps #5 Jewelers Aesculap BD331R
Angled Jewelers Forceps Aesculap BD329R
Micro Suture Forceps Aesculap BD338R
DUROGRIP Needle Holder Aesculap BM009R

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References

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