레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

Bioengineering

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Summary

우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.

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Vassalli, M., Basso, M., Difato, F. Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution. J. Vis. Exp. (75), e50477, doi:10.3791/50477 (2013).

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Abstract

개발 신경 네트워크 기능 연결의 형성은 외부의 신호에 의해 영향을 받는다. 개발 신경 세포의 신경 돌기 성장은 화학적 및 기계적 신호에 따라, 그리고 메커니즘을하는 기계적인 신호는 감지 및 응답을 제대로 이해하고 있습니다. 세포의 성숙에 힘의 역할을 해명하는 것은 기판에 세포 부착 및 세포 구조 커플 링을 홍보 할 수있는 발판의 디자인을 활성화하고 따라서 부상 후 재생하는 다른 신경 세포 유형의 능력을 향상시킬 것입니다.

여기, 우리는 레이저에 의한 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 적용하는 방법을 설명합니다. 우리는 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브의 동시 간섭 추적에 의해 부분적으로 lesioned 축삭의 긴장 방출을 측정합니다. 우리의 실험 프로토콜은 piconewton 감도와 긴장의 방출을 감지하고의 긴장 릴리스의 동적밀리 초 시간 해상도. 따라서 세포와 기질 사이의 기계적인 결합이 약물 치료 및 / 또는 기판의 독특한 기계적 특성에 의해 조절 될 수있는 방법을 연구하는 고해상도 방법을 제공합니다.

Introduction

광학 현미경은 살아있는 세포를 관찰 할 수있는보다 적게 침략 이미징 시스템 중 하나입니다. 이러한 방사 압력 (광학 핀셋 1에서와 같이), 또는 고 에너지 광자 플럭스 (레이저 해부 2 등) 등의 효과의 착취,이 기술은 나노 조작으로 확장되었다. 광학 이미징 시스템은 3을 시각화하고 하위 표적 세포를 조작하는 정밀한 제어를 비치한다. 동시에, 전달 된 레이저 출력의 정확한 교정 덕분에, 광학 도구는 전례없는 재현성도 부드럽거나 침입 샘플 조작을 수행.

여러 실험실 다른 세포는 5 융합하거나, 광학적으로 구동화물 6,7에 의해 세포를 자극하는 세포 소기관 4, 브레이션하기 위해 동일한 실험 장치, 광학 핀셋 및 레이저 해부에 통합됩니다. 광 핀셋, 광 강도의 보정 후를 허용하면서piconewton 규모의 셀에 적용되는 힘의 제어, 레이저 박리 시스템은 막 사진 por​​ation에서 하위 세포 구조의 단일 세포 기관 또는 박리 절제 범위는 광학 조작, 조절 할 수 있습니다. 그러나 레이저 해부 교정은 주로 시편 8 인한 형태 학적 변화를 설명하는 이미지 분석을 기반으로 샘플 공급 에너지에 대하여 광학 조작의 실체의 질적 평가에 의존합니다. 제시된 방법으로, 우리는 piconewton 규모에, 정량화, 개발 신경 세포의 레이저 축삭 해부 동안 힘 분광 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다, 하위 세포 구획 9 골격 구조에서 변경된 평형에 의해 생성되는 힘. 교양 뉴런은 기판에 부착하고, 개발 과정에서 극성. 편광 단계는 체외에서 처음 다섯 일 동안 발생합니다. 단계에서 편광의 두 extrud 중 하나ING의 신경 돌기는 오래되어, 축삭 10되기 위해 차별화됩니다. 성장 원뿔 견인 힘 님의 질문에 답변 축삭 신장은 이전 Dennerl의 모델 (11)에 의해 모델링되었습니다. 최근이 모델은 세포 외 기질 기판 돌기 접착의 역할을 포함하는 12 확장되었습니다. 실험 관찰 13 후 제안이 생물 물리학 모델은, 신경 돌기를 따라 전파, 성장 콘에 힘을 당기는 기판에 초점 유착에 의해 변조 것으로 나타났다. 마찬가지로, 축삭 병변은 세포체쪽으로 전파 긴장의 로컬 버전을 생성합니다. 따라서, 우리는 병변과 셀 소마 사이의 축삭을 따라 위치에 같은 발표 장력을 측정하는 것은 영향을받지 초점 유착 꺾는 결과를 평가할 수있는 가능성을 제공하는 제안했다.

우리는 잊어 버리고 축삭은 damag의 범위를 제어하는​​ 데 필요한 에너지 레이저 해부학자의 광자 플럭스 보정E, 완전 절개에서 부분적인 병변. 교정 후, 우리는 몇 가지 차별화 된 뉴런의 축색 돌기에 부분적으로 병변을 반복 장력 릴리스를 계량 프로토콜을 개발하고, 따라서 기판 (14)에 축삭의 접착력을 측정하는 정량적 매개 변수를 얻을.

본 연구에서, 우리는 세부에서 이러한 화학적 처리 14, 또는 세포 배양 지원의 다른 유형과 같은 다른 실험 조건에서 기판에 축삭 접착력을 평가하고 piconewton 감도와 비교하는 정확한 실험 절차를 나타냅니다 개발 된 프로토콜을 설명합니다.

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Protocol

1. 광 설치

전체 광학 시스템은 이전 15 설명했다. 간단히, 광 핀셋 시스템은 1064 nm의 (IPG 레이저 GmbH의)에서 이테르븀 연속파 (CW) 광섬유 레이저 운영을 기반으로합니다. 공간 광 변조기 (SLM) (LCOS-SLM 모델 X10468-07 - 하마 마츠) 컴퓨터 생성 홀로그램하여 배양 접시에 포획 초점 반점의 위치를​​ 제어하는​​ 수신 IR 레이저 빔의 위상을 다릅니다. 자유롭게 사용할 수있는 블루 핀셋 소프트웨어 (장비 테이블에 웹 링크)가 생성 홀로그램은 공간 광 변조기에 투사. 와 포토 다이오드 (PD, PDA100A-EC - THORLABS) - 힘 분광 측정을위한 간섭계는 4 사분면 다이오드 (하마 마츠 C5460SPL 6041 보드 QPD, S5980)에 근거했다.

355 nm의 (- 가득 찬다 포토닉스 PNV-001525-040, 파워 칩 나노 펄스 UV 레이저)에서 YAG 레이저 : 레이저 해부 소스 펄스 서브 나노초 UV 노스 다코타이었다. 음향광 변조기 (MQ110-A3-UV, 실리카-AA-옵토 - 전자 융합 355 nm의)는 시료에 전달 UV 레이저의 힘을 통제했다.

현미경의 objective.The 단계는 3 축 리니어 DC 모터의 마이크로 위치로 구성되어 찍기 60X, 0.9 NA 물 장착 - 홀로그램 광학 핀셋 및 레이저 마이크로 해부는 수정 직립 현미경 (올림푸스 BX51)에 통합되었다 의 서브 나노 미터 해상도로 샘플의 거친 움직임을 결합하는 별도의 3 축 압전 나노 포지셔닝 스테이지 (P-733.3DD, 물리학 악기​​) 운반 시스템 (M-126.CG1, 물리 악기) 압전 무대. 현미경 스테이지 시스템은 두 개의 컨트롤을 탑재 한 시너지 효과를 선택한 작동 모드 (정적 또는 동적 위치 또는 힘 클램프) 16에 따라 올바른 위치에 포획 초점 자리를 유지하기 위해 행동을 반복합니다. 특히, 내부 피드백 루프는 선택에 구슬을 유지하기 위해, 압전 단계에 작용트랩 센터 ED 거리. 다른 외부 루프는 스트로크 가능 17보다 큰 영역 압전 액츄에이터에 포함되는 지역을 악용하는 자동화 된 단계의 위치를 제어합니다. 이 샘플을 준수 갇혀 비드를 추적하기 때문에 압전 단계 한 방향에서 사용할 수있는 뇌졸중의 제한에 도달하면, 외부 루프는 반대 방향으로 마이크로 스테이지를 이동, 따라서 압전는 중심 위치를 향해 복구합니다. 압전 단계는 물론 범위의 중심 위치에 도달했을 때, 마이크로 단계는 중단. 시스템의 더 자세한 사항은 Guiggiani 16, 17에보고됩니다.

펠티어 장치 (TC-344B 듀얼 채널 히터 컨트롤러와 QE1 저항 가열 - 워너 인스트루먼트는) 현미경 (37 ° C)에 따라 세포 배양의 온도를 제어합니다. 문화, pH와 습도 맞춤 디자인 폴리 디메틸 레이팅에 의해 생리적 조건에서 유지되었다가습 carbogen (95 % O 2, 5 % CO 2)와 실록산 (PDMS) 소매 (현미경 목표를 통합).

2. 세포 배양 준비

모든 실험 프로토콜은 건강의 이탈리아 교육부에 의해 승인되었습니다. 차 문화는 배아 일 18 (E18)에서 생쥐의 해마 (C57BL6J, 찰스 강)에서 하였다.

  1. 신경 세포는 유리 바닥 배양 접시에 25,000 세포 / ㎖의 농도 (- MATEK 회사 P35G-0-14-C)에 도금 하였다. 배양 세포의 낮은 농도는 이미 체외에서 첫 번째 일 조밀 한 네트워크의 형성을 방지하기 위해 필요합니다. 언급 세포 농도에서 다른 셀에 연결되지 않은 긴 신경 돌기 격리 된 세포를 찾을 가능성이 훨씬 높다.

3. 비드 코팅

  1. 폴리머 마이크로는 (Ø 4 μm의, COOH-종료-앞머리 연구소, 제품 코드 PC05N/6700) 폴리 코팅 하였다polyLink 단백질 커플 링 키트 (Polysciences, 제품 코드 19539)에 설명 된 절차에 따라-D-라이신. 구슬 문화 지원과 호의 세포 접착을 커버하는 데 사용 된 것과 동일한 분자로 코팅되어 있습니다.

4. 고립 된 신경 세포를 선택합니다. 문화 기판, 트랩에서 비드를 분리하고 신경 옆에 이동

  1. 현미경 스테이지에 문화 페트리 접시를 넣어. 무대 동작하여 샘플에 포커스를 설정 한 후, 콜러 - 조명을 설정하는 조명 목적 콘덴서의 위치를​​ 수정합니다. Kolher - 조명 조건을 설정하는 조명 광학계를 정렬하면 시야 영상 품질을 개선 할 필요가있다. 이러한 정렬 조건을 사용하여, 그것은 QPD와 PD하여 간섭 추적을 수행하기 위해, 산란 갇혀 조사에서, 또한 IR 레이저 수집 효율 (목적 콘덴서를 통해) 극대화 할 필요가있다.
  2. 에 코팅 된 microsphere의 주식 솔루션의 몇 가지 μl를 피펫배양 접시에. 마이크로는 예금과 문화를 기판에 부착됩니다. 배양 접시에 주입 μL의 수는 원액 microsphere의 농도에 따라 달라집니다. 이상적인 조건은 뷰의 영상 분야마다 미세 하나 사이에 두을 가지고있다. 너무 많은 마이크로는 배양 접시에 추가 될 때, 그들은 이미 배양 된 뉴런 무작위로 첨부 할 수 있습니다.
  3. 긴 돌기 (축삭)와 격리 된 신경 세포를 검색, 문화 접시 주위에 이동하고, 현미경 스테이지의 위치를​​ 저장합니다.
  4. 이동 및 문화 지원에 부착 비드를 검색합니다.
  5. IR 트래핑 레이저를 켭니다. 이 단계에서, 아니 홀로그램은 SLM에 투영되지 않으며, IR 레이저 스폿의 위치는 UV 레이저 스폿의 위치와 일치한다. 현미경 스테이지 운동에 의해 2 ~ 3 μm의 문화 지지체 표면 위에 IR 현장의 축 위치를 설정합니다.
  6. 미만 μW에 샘플 전달 UV 레이저 파워를 설정합니다.UV 레이저 해부학자는 이전에 14 보정되었습니다
    5-6 μW는 유리 지원 소작됩니다
    4 μW 신경 세포의 연결이 완전히 해부
    신경 돌기가 부분적으로 lesioned되어 2.5 μW
    <1 μW이 충격파는 배양 접시에서 생산된다. 광 충격파 유리 지원에서 비드를 분리 할 수​​있을만큼 강하다.
  7. 에 IR 레이저를 유지하면서, UV 레이저를 켜고 현미경 스테이지 운동에 의해 준수 비드 위에 UV 자리를 이동합니다. 비드 표면에서 분리, 그리고 그것은 IR 레이저에 의해 갇혀있다. 그런 다음, UV 레이저를 끄십시오.
  8. 유리 지원 (20 ~ 30 μm의) 위의 트랩 구슬 몇 마이크로 미터를 이동합니다. 이 위치에 구슬을 해제하면이 이전에 선택한 뉴런을 향해 이동하는 동안 다른 세포에서 그것을 방지 할 수 있습니다. 이전에 저장 한 무대 위치에 구슬을 가져옵니다. 드래그 유체 힘 광학 트랩을 초과하지 않도록 낮은 값 (10 ㎛ / 초)로 단계 속도 설정핑 힘.

5. 컴퓨터 생성 홀로그램에 의한 레이저 해부 스폿 및 축삭 위치에 따라 트랩의 위치를​​ 이동하고, 광학 핀셋 강성 보정

  1. 축삭을 시각화하기 위해 유리 지원을 향해 구슬을 이동합니다. 비드합니다 (약 5 μm의 유리 지원 위)과의 접촉을 피하기 위해 셀 위에 개최됩니다.
  2. 축삭의 폭의 중앙에 UV 초점 자리를 이동하는 현미경 스테이지를 이동합니다. 현재 단계 위치를 저장합니다.
  3. 컴퓨터 생성 홀로그램에 의한 IR 초점 반점의 위치를​​ 이동합니다. 이 단계에서는 단계는 이전 단계에서 선택한 위치에 중단됩니다. 컴퓨터 생성 홀로그램 SLM에 투영 될 때, 트랩 비드 축삭에 대해 이동합니다. 우리는 너무 같은 돌기를 중심으로 UV 레이저 반점과 더불어 갇힌 구슬 돌기의 중앙에 정렬하도록 IR 레이저 자리를 이동합니다. IR 자리하고 따라서 트랩 비드 돌기를 따라 배치됩니다멀리 UV 반점 5-10 μm의. 우리는 신경 돌기 구조에 따라 UV 반점에 대하여 IR의 위치를​​ 이동합니다. 광 핀셋은 SLM 시스템이 장착되지 않은 경우에, 위치는 IR 광 경로의 기울기 거울, 또는 음향 광학 디플렉터에 의해 변경 될 수 있습니다. IR 레이저 스폿의 브라운 운동에 영향을하고 힘 분광 흔적을 변경할 수 갇혀 프로브와 해부 빔의 광학 상호 작용을 방지하기 위해 UV 지점에서 멀리 ~ 10 μm의를 배치 할 수 있습니다.
  4. UV 반점 및 축삭의 위치와 관련하여 새로운 IR 현장의 위치를​​ 정의한 후, 멀리 축삭에서 갇혀 비드를 배치하고 충돌을 피하기 위해 무대를 이동합니다. 커버 유리 위에 약 2 μm의 덫 비드의 축 위치를 이동합니다.
  5. 중앙 그것에 간섭 변두리에 QPD를 정렬 : QPD가 중앙에 때 x와 y QPD 차동 신호는 제로입니다. interfero에 의해 갇혀 비드의 브라운 운동의 5 초를 취득미터, 50 kHz 샘플링 속도. 파워 스펙트럼 방법 18에 의해 광 트랩의 강성 (PN / NM) 및 감도 (V / NM) 구하십시오.

6. 축삭에 비드를 부착합니다. Axotomy과 동시 힘 측정을 수행

  1. 커버 유리 위 4 μm의 갇힌 구슬의 위치를​​ 올리고, (단계 3.2 참조) 이전에 저장된 단계의 위치로 이동합니다.
  2. 축삭을 향해 갇혀 비드 아래로 이동이 접촉 돌기를 때까지. 갇혀 비드와 축삭 사이의 충돌은 축 방향 갇혀 비드의 변위를 감지 Z QPD 신호에 의해 모니터링됩니다.
  3. 트랩 비드와 10 초를 기다립니다 돌기 막에의 부착을 선호하는 축삭에 밀어.
  4. 축삭에서 갇혀 비드를 치환하는 마이크로 스테이지를 이동하고, 따라서 세포의 막에의 접착력을 확인합니다. 구슬 부착하면 광학 트랩에서 탈출.
  5. 준수 비드에 레이저 트랩을 뒤로 이동0으로 똑같은 힘의 상태와 힘 클램프 루프 전환합니다. 같은 방법으로, 광학 트랩 중앙에, 세포에 부착 된 압전 단계 재배치 구슬,. 시스템이 피드백 루프 제어가없는 경우, 레이저 트랩 위치는 부착 프로브를 중심 그것에 현미경 스테이지로 이동할 수 있습니다. QPD 신호가 구슬 갇혀 셀 (x와 0이 Y QPD 신호와 Z QPD 신호 사분면의 동일한 전압 금액을 제공을 준수하지 않을 때와 같은 경우 트랩의 중심에 도달 로 비드)는 어떤 표면에서 멀리 갇혀됩니다.
  6. 준수 갇혀 프로브 텐션을 생성하는 비드의 중심 (약 100 nm의)에 약간 트래핑 레이저의 위치를​​ z 축에 힘 클램프 상태를 설정합니다. 시스템이 강제 클램프 제어가 장착되어 있지 않은 경우, 광학 트랩 위치는 현미경 스테이지로 25 나노의 단계에서 제기 될 수있다. Z QPD 신호를 모니터링 할 수 있습니다. 따라서 생을 사용s는 부착 된 프로브에 대해 레이저 트랩의 위치를​​ 설정하는 신호. 이러한 사전 장력 축삭 병변 후 막에 긴장하고 준수 프로브의 브라운 운동의 필연적 인 감소를 감지하는 데 필요합니다. 유사한 접근 방식은 비디오 영상 19으로 막 밧줄에 긴장의 방출을 측정을 제안하고있다.
  7. 스위치 - 오프 위치 클램프 조건 (피에조 스테이지 차단)에 부착 된 프로브의 힘을 측정하는 힘 - 클램프의 피드백.
  8. 레이저 axotomy 시간 경과 시야 영상 (20 Hz의 프레임 속도) 동안 간섭계 (20 kHz 샘플링 주파수) 및 세포를 포획 프로브 위치의 동시 녹음을 시작합니다.
  9. 병변은 축삭의 이미지 (. 보통 200-400 광 펄스가 펄스 당 에너지 필요합니다 : 25 NJ)에 표시 될 때까지 레이저 펄스를 전달하기 위해 UV 레이저를 켠 후 UV 레이저를 끄십시오.
  10. 약 3 마일을 위해 간섭계 녹음을 계속N, X, Y 및 Z QPD 트레이스 고원에 도달 할 때까지.

7. 총 장력 릴리스를 정량화

  1. 나노 미터 각각의 트레이스를 얻기 위해, 광학 트랩의 보정 감도가 기록 QPD 흔적 (볼트)로 변환합니다.
  2. 10 Hz에서에서 잘라와 하이 패스 필터에 의해 X, Y 및 Z 변위 추적을 필터링합니다.
  3. 갇혀 비드의 브라운 운동을 대표하는 필터링 흔적의 총 분산을 계산합니다. 500 밀리 초 (10,000 데이터 포인트) 20 시간 창을 겹치지 25 밀리 초 단계로 분산을 계산합니다. 추적 필터링 하이 패스 막 변동 또는 대뇌 피질 굴지의 움직임에 의한 브라운 운동의 변화를 제외합니다. 구슬의 브라운 운동은 세포막에 광학 힘과 접착 힘에 의해 감소​​된다. 막 때문에 점도가 증가 긴장의 방출, 따라서 구슬의 브라운 운동의 긴장 될 때, immedi 감지ately axotomy 후 감소하기 시작합니다.
  4. T0를 정의 브라운 운동 분산의 감소의 시작을, UV 레이저 에너지의 전달 후. 시간 인스턴트 T0는 막 변형의 시작을 나타냅니다.
  5. 브라운 운동 분산 (가 고원에 도달 할 때)의 감소의 끝 : T1을 정의합니다. 시간 인스턴트 T1은 막 긴장의 끝을 나타냅니다.
  6. 힘 측정하는 동안 시료의 변위를 측정하기 위해, 커버 유리 지원에 이물질이나 스크래치 비디오 추적을 수행합니다. 유리 지원에 입자를 추적하기 위해 우리는 먼저 검정색 배경에 흰색 입자와 함께 바이너리 이미지의 스택을 얻기 위해, 시야 이미지에 임계 값을 적용합니다. 다음, 우리는 서브 픽셀 정밀도 (프리웨어 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여)와 질량 입자의 중심을 추적 할 수 있습니다.
  7. 변위 QPD 흔적에서 측정 된 드리프트를 뺍니다. 각각의 보정 광학 강성 (k x, k 님 드리프트 보정 QPD 흔적을 곱 Z)는 piconewtons에서 FX는, FY, FZ 흔적을 구하십시오.
  8. 로 전체 힘 추적을 계산 F TOT = √ (FX 2 + 기 2 + FZ 2).
  9. 로 T0와 T1 사이의 힘의 전체 버전을 계산 F 출시 = F TOT (T1) - F TOT (T0). 이 트랩 센터에서 프로브의 변위에 의한 것입니다 때문에 T0에서 측정 된 힘은, 차감되어야 할 때 신경 돌기의 구슬을 준수합니다.
  10. 갇혀 비드와 UV 레이저 스팟 위치 사이의 신경 돌기의 접촉 면적을 계산 갇혀 비드와 UV 레이저 스팟 위치 사이의 신경 돌기의 밝은 필드 이미지 측정에 긴 (L) 및 단기 (D) 축. 축삭의 접촉 면적은 축삭입니다 = L X D.
  11. 발표 한 총 출시 힘 F를 정상화 축삭 접촉 면적 축삭.

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Representative Results

세포는 초점 유착에 의해 기판에 견인 힘을 생성합니다. 세포 골격 요소에 의해 생성 된 힘은 문화 기판의 반작용 힘 평형에 있습니다. 신경 돌기의 레이저 유도 병변 후, 긴장된 골격 케이블 중 일부는 중단되고 기판 접착의 반대 힘이 제거되기 때문에 해당 평형 장력이 해제됩니다. 출시 긴장 부분적으로 영향을받지 초점 유착에 배포하고, 광학 트랩에서 개최 세포막에 부착 구슬 (회로도 그림 1 참조) 기판에 셀을 고정 골격 요소에 의해 상쇄되지 같은 릴리스의 부분을 측정합니다 .

우리는 그림 2, 상술 한 실험 프로토콜의 대표적인 결과에보고합니다. 신경 세포는 그림 2a 왼쪽 패널에서 차별화 N의 축삭을 식별하는 긴 신경 돌기를 제공합니다EURON. 그림 2a 오른쪽 패널에서 동일한 신경 세포가 유도 축삭 병변 (흰색 화살표로 표시) 한 후 표시됩니다. 그림 2B는 X, Y, Z 방향에서 기록 된 비드 변위 흔적을 보여줍니다. 그림 2C는 처음의 영상 추적을보고 유리 지원에 고려하고하려면 측정 도중 무대 드리프트를 제거합니다.

그림 3A에서, 왼쪽 패널에, 우리는 lesioned 돌기, 우리는 긴장 방출 측정하는 동안 신경 돌기의 직경의 kymograph을 계산 흰색 선 상류 병변 사이트를 보여줍니다. 오른쪽 패널에 kymograph는 신경 돌기의 직경이 약간 즉시 병변 이후 증가하고 세포 소마 향한 긴장의 방출로 인해 얇은되는 방법 보여주는 것입니다. 그림 3b에서, 우리는 kymograph 결과를 정량화. 우리는 아타을 배치 때문에 신경 돌기는 배경에 대해 밝게 표시목표의 초점 센터에서 비드 CHED, 따라서 축삭 초점이 약간 있습니다. 사실, 시간 경과 비디오 녹화의 각 프레임에서 kymograph 라인을 따라 픽셀 농도의 합을보고하여, 우리는 긴장의 방출 동안 돌기 직경의 추정치를 얻을 수 있습니다. 패널 3C에, 우리는 긴장 발매 중 첨부 비드의 총 분산을보고, 하이 패스 10 Hz의 컷 - 오프 주파수를 필터링 한 후 간섭계 (그림 2B)에 의해 기록 된 트레이스 기반으로 계산. 우리는 변화가 병변 사이트의 상류 물질의 축적 과정 돌기 직경이 증가한다는 것을 관찰 할 수 있습니다. 그런 변화는 막 긴장 될 때 (그림 3C에서 T0)에서 감소하기 시작하고, 신경 돌기 직경이 너무 줄어 듭니다. 분산 감소는 긴장의 방출 중단 고원 (그림 3C에서 T1에서)에 도달합니다. T1 후, 브라운 운동이 증가하기 시작하기 때문에exocytosis를 21 (그림 3C 참조) 가능성으로 인해 막 휴식.

그림 4A에 흰색 상자는 신경 돌기 접촉 면적 문화 지원 축삭의 추정을 나타냅니다. 축삭은 UV 레이저 스폿의 위치와 포획 프로브의 중심 사이에 계산됩니다. 그림은 교정 각으로 드리프트 수정 QPD 변위 추적 (그림 2B)에 곱한 후 얻은 총 출시 된 힘 F의 진폭 추적이 해제 4B 보고서 광학 트랩 강성 (K X, K Y, K Z). 우리는 시간 T1과 T0 (그림 4b에서 ΔpN)에서 측정 된 힘의 차이를 계산 한 다음, 우리는 PN / μm의 2의 측면에서 풀어 긴장을 얻기 위해, 축색 돌기로 나눕니다.

샘플 다른 뉴런에 동일한 프로토콜을 반복함으로써, 우리는 시작할 수 있습니다여러 문화에 대한 실험 세션은 화학적 요인과 치료 또는 다른 지원에 도금하고, 마지막으로 별개의 실험 조건에서 얻은 평균 값을 비교합니다. 그림 5에서, 우리는 축삭 병변 후 긴장의 방출은 기판에 초점 유착에 적신 보여, 따라서 높은 장력 릴리스 값은 축삭이 적은 기판에 부착을 의미합니다. 우리는 부분, 그리고 완벽하지, 축삭의 병변을 유발하기 때문에, 우리는 전달 된 총 에너지의 측정 긴장 릴리스의 의존성을 조사하고 병변 사이트 갇혀 비드 사이의 신경 돌기 접촉 면적에. 우리는 광 펄스의 높은 번호를 제공하여 더 많은 세포 골격 요소를 파괴하고, 그 결과 긴장의 높은 방출을 유도하기 위해 노력했다. 그렇지 않으면, 증가 된 신경 돌기의 접촉 면적으로, 우리는 긴장 릴리스의 낮은 양을 측정 할 것으로 예상. 그림 5에서, 우리는 두 가지 위에서 언급 한 매개 변수에 대한 종속성 것을 보여명확하지. 같은 현미경 목표와 같은 에너지를 사용할 때 변화하지 않는 절제 자리 8의 차원과 관련되어 있으므로, 우리는 유도 부분 병변 (프로토콜 4.5 단계를 참조하십시오 펄스 당 이전에 교정 낮은 에너지) 추론 샘플의 펄스 당. 그것은 잘 이러한 매개 변수는 기판에 세포 접착의 좋은 견적을 나타내지 않는 것으로 알려져 있기 때문에 초점 유착의 1 %를 점유로 더욱 긴장의 방출이 접촉 면적에 상관 관계가 아니라는 사실은 놀라운 일이 아니다 기저 표면 22.

그림 1
그림 1. 레이저 axotomy 동안 중단 골격 평형의 그래픽 표현. 셀 초점 유착에 의한 기판을 준수합니다. 파란색 화살표의세포 골격 요소 (스프링으로 표시됨)에 의해 생성 된 견인 힘을 pecify. 밝은 파란색 화살표는 엄격한 문화 기판에 의해 생성 된 반작용 힘을 나타냅니다. 간단한 시나리오에서 병변하기 전에, 골격 기판 힘은 쌍과 평형합니다. 신경 돌기의 레이저 유도 병변 후 일부 온천과 기판 사이의 연결이 중단됩니다. 따라서, 기판 cytoskletal 요소의 견인력을 방해를 더 이상 사용할 수 없습니다. 갇혀 구슬, 막에 부착 출시 골격 힘의 방향을 추적합니다.

그림 2
그림 2. , 구슬 갇혀 레이저 유도 병변 동안 해마 신경 세포의 축삭의 세포막에 부착. () 시야의 간섭 추적 이미지 축삭의 절제시 획득. 왼쪽 패널에있는 병변 전에. 오른쪽 패널에있는 병변 후. 폴리-D-라이신 코팅 된 비드는 멤브레인 (polystirene 구슬, 4 μm의 Ø)에 부착 광학 트랩에서 개최됩니다. 시료의 IR 레이저의 평균 전력이 14 mW의 것입니다. 흰색 화살표는 병변의 위치를​​ 나타냅니다. 바 5 μm의 수 있습니다. 광학 트랩 비드 위치에 다시 초점 평면 간섭에 의해 (B) 녹화 흔적. 파란색, 녹색, 빨간색 흔적은 각각 x, y 및 z 축을 따라 구슬의 위치를​​ 나타냅니다. 샘플링 속도가 20 kHz입니다. (C) 비디오 추적에 의해 측정 된 문화 지원에 스크래치 변위 단계 드리프트를 모니터링 할 수 있습니다. 파란색과 녹색 흔적 비디오 추적하여 얻은 x와 y 위치입니다. 프레임 속도는 5.5 Hz입니다.

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그림 3. 긴장 발매 중 축삭의 직경과 lesioned 축삭의 세포막 변형 분석. 왼쪽 패널에 lesioned 축삭 () 밝은 필드 이미지. 축삭에 흰색 선에 수직이 kymograph이 계산되는 위치를 나타냅니다. 상류 병변 사이트의 축삭 직경의 오른쪽 패널에서 kymograph. kymograph의 각 행은 0.18 초에 해당합니다. (b) 장력 발매 중 축삭 직경의 견적을 나타내는 kymograph의 각 행의 픽셀 농도의 합입니다. (C) 비드의 브라운 운동의 총 분산은에 연결 축삭 (T0와 T1은 각각 절개 후 축삭의 시작과 긴장의 방출의 끝을 나타냅니다).

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그림 4. axotomy 이후에 출시 된 긴장의 정량화. lesioned 축삭 () 밝은 필드 이미지. 흰색 상자는 병변 사이트 갇혀 비드의 중심 사이의 신경 돌기 접촉 영역의 예상을 나타냅니다. (B) axotomy (F TOT = √ (FX 2 + 기 2 + FZ 후 측정 된 힘의 전체 진폭의 추적 2)). FX, 회계 및 FZ는 변위 흔적 그림 2B에 표시되는 것들 훅의 법칙 (F = KX)에 의해 계산 하였다. 광학 트랩의 세 직교 방향의 강성은, 파워 스펙트럼 방법 (K X, Y = 7.9 PN / μm의, K Z = 2.3 PN / μM)에 의해 계산 하였다. ΔpN의 시간 순간 T0와 T1 사이의 측정 발매 힘을 나타냅니다.

그림 5 그림 5. 샘플에 전달되는 에너지의 양에 대한 측정 장력 릴리스의 의존성 및 신경 돌기 접촉 면적에. 3 DIV에서 마우스 hippocamapal 뉴런의 축색 돌기에서 수행 26 실험 데이터입니다. 신경 돌기의 접촉 부위에 비해 장력 릴리스 () 산점도 병변 갇혀 비드 위치 사이. 긴장 출시 대 샘플 돌기 접촉 면적에 전달 에너지의 총계의 (b) 산포도.

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Discussion

우리는이 연구에서 레이저 유도 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 수행하여 문화 기판에 돌기 접착력을 비교하는 정량 방법을보고합니다. 긴장의 측정 자료는 기판 세포의 부착 정도와 관련되어 초점 유착의 높은 숫자를 가진 세포는 덜 긴장을 해제해야합니다. piconewtons의 측면에서 긴장의 방출을 측정하는 것은 서로 다른 실험 조건 14 문화 지원에 축삭 접착력을 평가하는 물리적 인 양을 제공합니다.

여러 실험실 독특한 광학 디자인에게 23을 채택, 광 핀셋 시스템과 레이저 해부를 통합. 우리의 선택은 고정 된 광학 경로 및 현미경 스테이지 모션 설정했다. 이를 위해, 우리는 UV 레이저의 위치와 관련하여 트래핑 자리를 이동하는 IR 레이저 빔 경로에 공간 광 변조기를 소개합니다. 하지만 galvanometrIC 거울 샘플을 이동하지 않고 레이저 초점의 위치를​​ 조종 할 수, 그들은 힘 분광 측정에 영향을 미치는 시스템에 기계적 소음이 발생할 수 있습니다. 브라운 운동 분석 광학 강성의 빠른 재 교정을 허용 때문에 더욱, 우리는 샘플을 다시 배치 IR 레이저 초점을하기로 결정했다. 샘플에 UV 레이저 스폿의 위치를​​ 이동하는 경우에만 그 중앙 위치에서 빔의 작은 변위에 대해 무시할 UV 초점 반점 자체의 품질에 영향을 미치는 구면 수차를 생성 할 수 있습니다. 따라서, 레이저 해부학자의 광학 특성의 수정 엔티티에 손상 대 전달 레이저 파워의 드 노보 교정이 필요할 수 있습니다.

힘 분광 측정함으로써, 우리는 긴장 릴리스는 몇 초의 빠른 단계, 초 몇 수만을 지속 할 수있는 느린 단계로 구성되어 것을 알 수 있습니다. 때로는 이전의 연구 14, 천천히보고단계는 몇 분을 지속 할 수 있습니다. 그 이유를 들어, 우리는 문화 지원에 상처를 추적하는 비디오로 힘 측정을 수정했습니다. 미래에 더 나은 방법은 커버 유리에 부착 된 비드의 비디오 나 간섭 추적하여 현미경 스테이지의 위치를​​ 자동으로 수정하는 피드백 루프와 함께 무대 드리프트를 취소하는 것입니다. 이러한 유형의 구성은 이미 문헌에보고, 첨부 된 비드를 중심으로 두 번째 레이저 빔을 필요로하고, 서브 나노 미터의 정밀도 24,25와 함께 무대 안정화를 보장합니다.

미래에, 우리는 분화의 여러 단계에서 문화 지원에 축삭 접착력을 비교하고 다른 병적 인 상태에서 약물 치료에 대한 정량적 인 분석을 제공하기 위해 개발 된 프로토콜을 적용합니다. 또한, 같은 프로토콜은 별개의 기계화와 물​​자의 다른 종류의 신경 세포 접착을 비교, 이식 발판의 설계에 적용 할 수anical 화학적 특성 26.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

실시간 제어 시스템, 통찰력 토론, 자코모 Pruzzo와 알레산드로 PARODI 사용자 정의 전자 제품과 소프트웨어의 개발, 그리고 클라우디아 Chiabrera과 전문가의 조언 및 세포 배양 준비에 도움 마리나 Nanni에 대한 에벨 리나 Chieregatti와 하나코 쓰시마 개발을위한 알베르토 Guiggiani.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated Bangs laboratories PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit Polyscience 19539
EQUIPMENT
IR laser IPG Laser GmbH YLM-5-SC-LP ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator Hamamatsu LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software Optics group, University of Glasgow Free downloadable software http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ Hamamatsu Free downloadable software http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD Thorlabs S5980 with C5460SPL 6041 board Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD Teem Photonics PDA100A-EC Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser AA-optoelctronics PNV-001525-040 Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator Olympus MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope Andor BX51 Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD Warner Instruments V887ECSUVB EMCCD
Peltier device Physic Instruments QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage National Instruments Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq NI PCI-6229 Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop

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References

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