Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione

Bioengineering

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Summary

Abbiamo misurato il rilascio della tensione in un assone, parzialmente lesionati con un dissettore laser per la misurazione simultanea della spettroscopia di forza eseguita su una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell'assone. Il protocollo sperimentale sviluppato valuta l'assone adesione al substrato cultura.

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Vassalli, M., Basso, M., Difato, F. Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution. J. Vis. Exp. (75), e50477, doi:10.3791/50477 (2013).

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Abstract

La formazione di connessioni funzionali in una rete neuronale sviluppo è influenzato da stimoli estrinseci. La crescita dei neuriti dei neuroni in via di sviluppo è oggetto di segnali chimici e meccanici, ed i meccanismi con cui percepisce e risponde a segnali meccanici sono poco conosciuti. Chiarire il ruolo di forze nella maturazione delle cellule consentirà la progettazione di scaffold che può promuovere l'adesione cellulare e citoscheletro accoppiamento al substrato, e quindi migliorare la capacità di diversi tipi neuronali di rigenerarsi dopo una lesione.

Qui, descriviamo un metodo per applicare misure di spettroscopia di forza simultanee durante laser della lesione cellulare indotta. Misuriamo il rilascio della tensione nel assone parzialmente lesionata dal simultaneo monitoraggio interferometrico di una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell'assone. Il nostro protocollo sperimentale rileva il rilascio della tensione con la sensibilità piconewton, e la dinamica del rilascio della tensione arisoluzione temporale millisecondo. Pertanto, offre un metodo ad alta risoluzione per studiare come l'accoppiamento meccanico tra cellule e substrati può essere modulata mediante trattamento farmacologico e / o da distinti proprietà meccaniche del substrato.

Introduction

Microscopia ottica è uno del sistema di imaging meno invasiva disposizione per osservare le cellule viventi. Con lo sfruttamento degli effetti, come la pressione di radiazione (come in pinzetta ottica 1), o flusso di fotoni ad alta energia (come nel laser dissettore 2), questa tecnologia è stata estesa a nano-manipolazione. Il sistema di imaging ottico fornisce un controllo preciso di visualizzare e manipolare gli obiettivi sub cellulari 3. Allo stesso tempo, grazie alla calibrazione accurata della potenza del laser consegnato, strumenti ottici realizzano sia la manipolazione del campione morbido o invasivi con riproducibilità senza precedenti.

Diversi laboratori integrati, nello stesso setup sperimentale, pinzette ottiche e laser dissettore per ablazione organelli 4, a fondere 5 celle diverse, o per stimolare le cellule dai guidato otticamente carichi 6,7. Mentre pinzette ottiche, dopo la calibrazione della rigidezza ottica, consentonoil controllo della forza applicata alla cella su scala piconewton, sistemi dissezione laser può modulare manipolazione ottica, che varia da membrana foto-porazione all'ablazione di singoli organelli o dissezione di strutture sub-cellulari. Tuttavia, calibratura dissezione laser si basa sulla valutazione qualitativa dell'entità di manipolazione ottica rispetto alla energia fornita al campione, principalmente sulla base di analisi di immagini che illustra i cambiamenti morfologici dovuti al campione 8. Nel metodo presentato, dimostriamo come eseguire la misurazione spettroscopia di forza durante la dissezione laser assonale di un neurone sviluppo, quantificare, su scala piconewton, la forza prodotta da un equilibrio alterato nella struttura citoscheletro di un compartimento subcellulare 9. Neuroni coltivati ​​aderiscono al substrato, e polarizzano durante lo sviluppo. La fase di polarizzazione si verifica durante i primi cinque giorni in vitro. Alla seconda fase di polarizzazione, una delle estrusorizione neuriti diventa più lungo, e sarà differenziarsi per diventare l'assone 10. Allungamento assonale in risposta alla forza di traino presso il cono di crescita è già stato modellato dal modello di Dennerl 11. Recentemente, questo modello è stato esteso da 12 a includere il ruolo di neuriti adesione ai substrati della matrice extracellulare. Questo modello biofisico, proposto dopo 13 osservazioni sperimentali, ha mostrato che tirando forze sul cono di crescita, si propaga lungo i neuriti, sono modulati da adesioni focali al substrato. Allo stesso modo, lesione assonale produce un rilascio locale di tensione propagare verso il corpo cellulare. Pertanto, abbiamo proposto che la misura tale tensione rilasciato in una posizione lungo l'assone tra la lesione e la soma cellulare offre la possibilità di valutare l'esito di smorzamento di adesioni focali inalterati.

Calibriamo l'energia necessaria fotone-flusso del laser dissettore per controllare l'entità del damag assonale inflittoe, da completo transection a lesione parziale. Dopo la calibrazione, si è ripetuta lesione parziale ai assoni di diversi neuroni differenzianti e sviluppato il protocollo di quantificare il rilascio della tensione, e così ottenuto un parametro quantitativo per stimare l'adesione del assone al substrato 14.

Nel presente lavoro, si descrive in dettaglio il protocollo sviluppato, che rappresenta una precisa procedura sperimentale per valutare e confrontare con sensibilità piconewton assonale l'adesione al substrato in diverse condizioni sperimentali come trattamento chimico 14, o diversi tipi di supporto di coltura cellulare.

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Protocol

1. Setup Optical

L'intero sistema ottico è stato descritto in precedenza 15. Brevemente, il sistema di pinzette ottiche è basato su un onda continua itterbio (CW) fibra laser operante a 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulatore spaziale di luce (SLM) (LCOS-SLM, modello X10468-07 - Hamamatsu) varia la fase del fascio laser in ingresso IR per controllare la posizione del punto di messa a fuoco trapping sul piatto di coltura da Computer ologrammi generati. I Blu-pinzette software (collegamento web sul tavolo attrezzature) ologrammi generati liberamente disponibili proiettate sul modulatore spaziale di luce. L'interferometro per misure di spettroscopia di forza era basata su un fotodiodo a quattro quadranti (QPD, S5980 con C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) ed un fotodiodo (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

La fonte dissezione laser pulsato è stato un sub-nanosecondo UV Nd: YAG laser a 355 nm (PNV-001.525-040, POWERCHIP nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Un acustico-modulatore ottico (MQ110-A3-UV, 355 nm silice fusa-AA-opto-elettronico) controllava la potenza del laser UV consegnato al campione.

L'ottica olografica pinzette laser e micro dissettore stati integrati su un microscopio verticale modificato (BX51 - Olympus) dotata di un 60X, 0,9 NA acqua immergendo objective.The fase del microscopio è composto da un motore 3-asse lineare DC micro-posizionamento sistema (M-126.CG1, Fisica-Instruments) che porta un piezoelettrico fase nano-posizionamento a 3 assi separati (P-733.3DD, Fisica-Instruments) per combinare il movimento grossolana del campione con la risoluzione sub-nanometrica della piezo- stadio. Il sistema del microscopio è stato dotato di due circuiti di controllo che agisce sinergicamente per mantenere il punto fuoco intrappolamento nella posizione giusta, a seconda della modalità di funzionamento selezionata (posizione o forza di serraggio, statica o dinamica) 16. In particolare, un circuito di retroazione interna agisce su un palco piezoelettrico, per mantenere il tallone in una selectndr distanza dal centro trappola. L'altro circuito esterno controlla la posizione del portaoggetti motorizzato di sfruttare la regione attraversato dal piezoattuatore su un'area maggiore della sua corsa 17 disponibili. Quando il piezo stadi, raggiunge il limite della corsa disponibile in una direzione, il loop esterno sposta il micro percorso nella direzione opposta, così il piezo recupera verso la sua posizione centrale perché sta rilevando la perlina intrappolato aderito al campione. Quando il piezo-stadio raggiunge la posizione centrale della sua gamma naturalmente, il micro fase interrotta. Ulteriori dettagli del sistema sono riportati in Guiggiani et al 16,17.

Un dispositivo Peltier (QE1 riscaldamento resistivo con TC-344B del riscaldatore a doppio canale - Warner Instruments) controlla la temperatura della coltura cellulare al microscopio (37 ° C). Nella cultura, pH e umidità sono stati mantenuti in condizioni fisiologiche per aerare un polidimetil custom-designedsilossano (PDMS) manicotto (integrando l'obiettivo microscopio) con CARBOGEN umidificata (95% O 2, 5% di CO 2).

2. Cell Culture Preparazione

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano. Colture primarie sono state ottenute da ippocampo di topi (C57BL6J, Charles River) giorno embrionale 18 (E18).

  1. I neuroni sono state piastrate ad una concentrazione di 25.000 cellule / ml su fondo di vetro Petri (P35G-0-14-C - matek Corporation). La bassa concentrazione di cellule in coltura è necessaria per evitare la formazione di una fitta rete già nei primi giorni in vitro. Alla concentrazione cellulare menzionato, la probabilità di trovare cellule isolate con un neurite più lungo non collegato ad altre cellule è molto più alta.

3. Rivestimento Bead

  1. Polymer microsfere (Ø 4 micron, COOH-terminato-Bangs Laboratories, codice prodotto PC05N/6700) sono stati rivestiti con poli-D-lisina seguendo la procedura descritta nel Polylink Protein Coupling Kit (Polysciences, codice prodotto 19539). Le perle sono rivestite con la stessa molecola utilizzata per coprire il supporto e la coltura favore cellule adesione.

4. Scegli isolato Neuron. Staccare un tallone dalla cultura substrato, Trappola e spostarlo Accanto al Neuron

  1. Mettere il piatto cultura Petri sul palco microscopio. Dopo aver impostato la messa a fuoco sul campione di moto fase, correggere la posizione del illuminante obiettivo condensatore per impostare Kohler-illuminazione. Allineamento delle ottiche di illuminazione per impostare la condizione Kolher-illuminazione è necessaria per migliorare la qualità delle immagini luminose campo. Utilizzando tali condizioni di allineamento, è anche necessario per massimizzare l'efficienza di raccolta del laser IR (tramite condensatore oggettivo), dalla dispersione sonda intrappolato, effettuare il tracciamento interferometrica dal QPD e PD.
  2. Pipettare pochi microlitri della soluzione patinati microsfere inal piatto cultura. Microsfere depositerà e di aderire al substrato della cultura. Il numero di microlitri iniettato nel piatto cultura dipende dalla concentrazione microsfere della soluzione di riserva. La condizione ideale è avere tra uno e due microsfere per campo dell'imaging di vista. Quando troppi microsfere vengono aggiunti al piatto di coltura, possono già attaccare caso ai neuroni coltivati.
  3. Muoversi nel piatto cultura, alla ricerca di un neurone isolato con una neurite più lungo (l'assone), e salvare la posizione del palco microscopio.
  4. Muoversi e cercare una perlina aderito al sostegno della cultura.
  5. Accendere il laser a infrarossi cattura. In questa fase, non ologrammi vengono proiettate su SLM, e la posizione del punto laser IR coincide con la posizione spot laser UV. Impostare la posizione assiale dello spot IR 2-3 micron sopra la superficie di supporto cultura, dal movimento del microscopio.
  6. Impostare la potenza del laser UV consegnato al campione da meno di 1 μW. GliUV laser dissettore è stato precedentemente tarato 14:
    5-6 μW il supporto di vetro viene ablata
    4 μW una connessione neuronale è completamente sezionato
    2,5 μW una neurite è parzialmente lesionati
    <1 μW un'onda d'urto è prodotto nel piatto di coltura. L'onda d'urto ottico è abbastanza forte da staccare il tallone dal supporto di vetro.
  7. Accendere il laser UV, lasciando il laser IR, e spostare il punto UV sopra il tallone aderito al movimento palco microscopio. Gli stacca tallone dalla superficie, ed è intrappolato dal laser IR. Quindi, spegnere il laser UV.
  8. Spostare le intrappolati tallone diversi micrometri di sopra del supporto di vetro (20-30 micron). Sollevamento del tallone a questa posizione sarà impediva di contattare altre cellule mentre viene spostato verso il neurone precedentemente scelto. Portare il tallone nella posizione precedentemente salvata stadio. Impostare la velocità di fase a un valore basso (10 micron / sec), cosicché la forza di trascinamento del fluido non superi la trappola otticaforza ping.

5. Spostare la posizione Trappola rispetto al Dissector Spot Laser e Axon posizione da Computer Generated Hologram e calibrare il Optical pinzette Rigidità

  1. Spostare il tallone verso il supporto in vetro di visualizzare l'assone. La sferetta è tenuta sopra la cella per evitare il contatto con essa (circa 5 micron sopra del supporto di vetro).
  2. Spostare la fase di microscopio per spostare il punto attivo UV sul centro della larghezza del assone. Salvare la posizione attuale fase.
  3. Spostare il focus posizione a pronti IR da ologramma generato al computer. In questa fase, la fase viene arrestato nella posizione scelta nel passaggio precedente. Quando il computer ologramma generato è proiettato sul SLM, il tallone intrappolata viene spostata rispetto alla assone. Abbiamo spostare il punto laser IR avere il tallone intrappolata allineato al centro del neurite, con il punto laser UV centrata sulla stessa neurite troppo. Lo spot IR e quindi il intrappolata tallone sono posizionati lungo i neuriti5-10 micron di distanza dal punto UV. Muoviamo la posizione del IR rispetto alla macchia UV in funzione della geometria neurite. Nel caso le pinzette ottiche non sono dotati di un sistema SLM, la posizione può essere variata specchi ribaltabili, o deflettori acustici ottiche, sul percorso ottico di IR. Il punto laser IR potrebbe essere posizionata 5-10 micron dalla macchia UV per evitare interazioni ottico del fascio dissezione con la sonda intrappolato, che potrebbe influenzare il moto browniano e alterare le tracce spettroscopia di forza.
  4. Dopo aver definito la nuova posizione a pronti IR rispetto a macchia UV e posizione assone, spostare la fase di posizionare il tallone intrappolato dalla assone ed evitare collisioni con esso. Spostare la posizione assiale del tallone intrappolata di circa 2 micron sopra il vetro di copertura.
  5. Allineare il QPD al centro le frange di interferenza su di esso: x e segnali differenziali y QPD sono zeri quando il QPD è centrato. Acquisire 5 secondi del moto browniano del tallone intrappolati dalla interferometrichemetro, a 50 KHz frequenza di campionamento. Avere la rigidità (pN / nm) e sensibilità (V / nm) della trappola ottica dal metodo spettro di potenza 18.

6. Fissare il tallone alla Axon. Eseguire assotomia e simultanea Misura della forza

  1. Sollevare la posizione tallone intrappolato circa 4 micron sopra il vetro di copertura, e spostarlo nella posizione di fase precedentemente salvata (vedi punto 3.2).
  2. Spostare il tallone giù intrappolato verso l'assone finché non tocca la neuriti. La collisione tra tallone intrappolati e l'assone è controllata dal segnale QPD z rilevamento spostamento del tallone intrappolato nella direzione assiale.
  3. Attendere 10 sec con il tallone intrappolata spinto contro l'assone di favorire l'adesione alla membrana neuriti.
  4. Spostare il micro fase di spostare il tallone intrappolato dal assone, e quindi verificare la sua adesione alla membrana cellulare. Se il tallone aderito, sfugge dalla trappola ottica.
  5. Spostare indietro la trappola laser sul tallone aderitoe attivare il ciclo forza-clamp con condizione forza pari a zero. In tal modo, i riposiziona piezo-fase del tallone, allegate alla cella, sul centro trappola ottica. Se il sistema non dispone di un controllo di retroazione, la posizione trappola laser può essere spostata dal palco microscopio per centrarlo sulla sonda aderito. Il centro della trappola è raggiunto quando i segnali QPD sono gli stessi quando il tallone è bloccata e non aderisce alla cella (x ed y segnali QPD pari a zero, e il segnale z QPD dà la stessa tensione somma dei quattro quadranti come quando il tallone è intrappolato lontano da qualsiasi superficie).
  6. Impostare una condizione forza-clamp sull'asse z, posizionando il laser trapping leggermente nel centro del tallone (circa 100 nm), per generare un precarico sul aderito sonda intrappolato. Nel caso il sistema non è dotato di un controllo di forza-clamp, la posizione trappola ottica può essere sollevato fino a passi di 25 nm dalla fase microscopio. Il segnale z QPD permette il monitoraggio. Pertanto, utilizzare thiil segnale s per impostare la posizione della trappola laser rispetto alla sonda aderito. Tale pre-tensionamento è necessario per rilevare la tensione sulla membrana dopo la lesione assonale, e la conseguente diminuzione del moto browniano della sonda aderito. Un approccio simile è stato proposto di misurare il rilascio di tensione in un tether membrana da immagini video 19.
  7. Spegnere il ritorno di forza-clamp per misurare la forza sulla sonda aderito nella condizione di posizione-clamp (il piezo-stadio è bloccato).
  8. Avviare la registrazione simultanea delle posizioni del tastatore intrappolate attraverso l'interferometro (20 KHz frequenza di campionamento), e la cellula durante laser assotomia time-lapse imaging in campo chiaro (20 Hz frame rate).
  9. Accendere il laser UV per fornire impulsi laser fino a una lesione diventa visibile sull'immagine del l'assone (solitamente 200-400 impulsi ottici sono necessari Energia per impulso: 25. NJ), quindi spegnere il laser UV.
  10. Continuare la registrazione dal interferometro per circa 3 min, fino a quando la x, yez QPD tracce di raggiungere un plateau.

7. Quantificare il totale tensione di uscita

  1. Convertire le tracce QPD registrati (in Volt) per la sensibilità calibrata della trappola ottica, per ottenere le rispettive tracce in nanometri.
  2. Filtrare il x, y, z e tracce di spostamento da un filtro passa alto con tagliato a 10 Hz.
  3. Calcolare la varianza totale delle tracce filtrati rappresentano il moto browniano del tallone intrappolato. Calcola la varianza a 25 msec per le finestre di tempo di 500 msec (10.000 punti dati) 20 sovrapposte. L'elevato filtraggio delle tracce passaggio esclude le variazioni del moto browniano a causa della fluttuazione della membrana o movimento actina corticale. Il moto browniano del tallone è ridotta dalle forze ottici e le forze di adesione sulla membrana cellulare. Quando la membrana è tesa a causa del rilascio di tensione sua viscosità è aumentata e quindi il moto browniano della perlina, rilevata immediatamente dopo assotomia, inizia a diminuire.
  4. Definire t0: l'inizio della diminuzione del moto browniano varianza, dopo la consegna di energia laser UV. L'istante t0 tempo indica l'inizio del ceppo membrana.
  5. Definire t1: la fine della diminuzione del moto browniano varianza (quando raggiunge un plateau). L'istante t1 tempo indica la fine del ceppo membrana.
  6. Eseguire video tracking di detriti o un graffio sul supporto vetro di copertura, per misurare qualsiasi deriva del campione durante la misurazione della forza. Per tenere traccia della particella sul supporto di vetro, per prima cosa applicare soglie per le immagini in campo chiaro, per ottenere una pila di immagini binarie con la particella in bianco su sfondo nero. Poi, si traccia il centro particella di massa con una precisione sub-pixel (utilizzando il software freeware ImageJ).
  7. Sottrarre la deriva misurato dalle tracce QPD spostamento. Moltiplicare le tracce QPD drift-corretti dai rispettivi rigidità ottico calibrato (k x, k z) per ottenere le Fx, Fy, Fz tracce in piconewtons.
  8. Calcolare la traccia forza totale come F tot = √ (2 + Fx Fy Fz 2 + 2).
  9. Calcola il rilascio totale di forza tra T0 e T1 come F rilasciato = F tot (t1) - F tot (T0). La forza misurata in t0 deve essere sottratto perché è dovuto allo spostamento della sonda dal centro trappola, quando aderisce al tallone neuriti.
  10. Calcolare l'area di contatto tra il tallone neuriti intrappolati e la posizione di punto laser UV: sulla misura di immagine in campo chiaro le lunghe (L) e corto (D) assi del neuriti intrappolato tra il tallone e la posizione di punto laser UV. L'area di contatto assone assone è A = L x D.
  11. Normalizzare il totale rilasciato dalla pubblicato forza F l'area di contatto Un assone assone.

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Representative Results

La cella genera forze di trazione sul substrato dai suoi adesioni focali. Forza generata da elementi del citoscheletro sono in equilibrio con la forza di contrasto del substrato cultura. Dopo laser indotta lesione del neurite, alcuni cavi citoscheletro Tensed sono interrotti e la loro tensione equilibrata viene rilasciato perché la forza opposta del substrato adesione è eliminato. La tensione rilasciata è parzialmente distribuita sulle adesioni focali inalterati, e il tallone attaccato alla membrana cellulare, tenuto in una trappola ottica, misura la porzione di tale rilascio non contrastato da elementi di ancoraggio del citoscheletro della cellula al substrato (vedi schema figura 1) .

Riportiamo, nella figura 2, a seguito rappresentante del protocollo sperimentale descritto sopra. Il neurone, nella figura 2a pannello sinistro, presenta un neurite più lunga, che identifica l'assone della differenziazione neuron. Nella figura 2a pannello destro, lo stesso neurone compare dopo la lesione assonale indotta (indicata dalla freccia bianca). Figura 2b mostra le tracce registrate spostamento tallone in x, ye z. Figura 2c riporta il tracciamento video di un graffio sul supporto di vetro, per tener conto ed eliminare la deriva fase durante la misurazione.

In figura 3a, sul pannello di sinistra, mostriamo la neurite lesionato, e la linea bianca a monte del sito della lesione, in cui si calcola il chimografo del diametro neurite durante la misurazione della tensione di rilascio. Sul pannello di destra è il chimografo, mostrando come il diametro del neurite aumenta leggermente immediatamente dopo la lesione, e quindi diventa più sottile a causa del rilascio di tensione verso il soma cella. In figura 3b, si quantifica il risultato chimografo. La neurite appare più luminoso rispetto al fondo in quanto abbiamo posizionato il Attached tallone al centro fuoco dell'obiettivo, e quindi l'assone è leggermente fuori fuoco. Infatti, riportando la somma delle intensità dei pixel lungo la linea chimografo ad ogni frame di registrazione time-lapse video, si ottiene una stima del diametro neurite durante il rilascio di tensione. Sul pannello 3c, segnaliamo la varianza totale del cordone attaccato durante il rilascio della tensione, calcolato sulla base delle tracce registrate dal interferometro (Figura 2b) dopo il filtro passa alto a 10 Hz di frequenza di cut-off. Possiamo osservare che la varianza aumenta con il diametro del neurite durante accumulo di materiale a monte del sito di lesione. Poi, la varianza inizia a diminuire (a t0 in figura 3c) quando la membrana viene filtrata, ed il diametro dei neuriti diminuisce anche. La diminuzione varianza raggiunge un plateau (a t1 in figura 3c), quando il rilascio tensione cessa. Dopo t1, il moto browniano inizia ad aumentare a causadi membrana rilassamento possibilmente dovuto esocitosi 21 (cfr. figura 3c).

Nella figura 4a, la casella bianca indica la stima dell'area di contatto neurite Un assone con il supporto cultura. Un assone è calcolata tra la posizione di punto laser UV e il centro del tastatore intrappolato. Figura 4b relazioni la traccia ampiezza del totale liberato forza F Liberatoria ottenuti dopo moltiplicando i drift-corretti tracce spostamento QPD (in Figura 2b) dalla rispettiva calibrato rigidità trappola ottica (x k, y k, k z). Calcoliamo la differenza tra la forza misurata al tempo t1 e t0 (ΔpN nella figura 4b), e poi ci dividiamo da un assone, per ottenere la tensione rilasciata in termini di PN / micron 2.

Ripetendo lo stesso protocollo sui neuroni differenti nel campione, possiamo iniziaresessioni di esperimenti su diverse colture trattate con fattori chimici o piastrate su supporti diversi, e infine confrontare il valore medio ottenuto nelle condizioni sperimentali distinte. Nella Figura 5, mostriamo il rilascio di tensione dopo lesione assonale viene smorzata da adesioni focali sul substrato, quindi un valore di rilascio di tensione più alto significa un assone meno aderire al substrato. Perché si induce una parziale e non completa, lesione dell'assone, abbiamo studiato la dipendenza della tensione di rilascio misurata sulla energia totale erogata, e sulla superficie di contatto tra il sito neuriti lesione e il tallone intrappolato. Abbiamo cercato di distruggere più elementi del citoscheletro, fornendo un più alto numero di impulsi di luce, e di conseguenza indurre un rilascio maggiore di tensione. In caso contrario, con un aumento della superficie di contatto dei neuriti, ci aspettavamo di misurare una quantità inferiore di rilascio di tensione. Nella Figura 5, si dimostra che la dipendenza dei due parametri suddetti ènon è chiaro. Pertanto, abbiamo dedotto che la lesione parziale indotta (con la bassa energia precedentemente tarato per impulso; vedi protocollo step 4.5), è legato alla dimensione dello spot ablazione 8, che non varia quando si usa lo stesso obiettivo microscopio e la stessa energia per impulso al campione. Inoltre, il fatto che il rilascio di tensione non è correlata all'area di contatto non è sorprendente perché è ben noto che tali parametri non rappresentano una buona stima della adesione delle cellule al substrato, come adesioni focali occupano solo 1% del superficie basale 22.

Figura 1
Figura 1. Rappresentazione grafica degli equilibri citoscheletro interrotto durante laser assotomia. Una cellula aderisce ad un substrato di adesioni focali. Frecce blu specify forze di trazione tra elementi del citoscheletro (indicati da molle). Frecce azzurre indicano le forze contrastanti generati dalla cultura substrato rigido. In uno scenario semplificato, prima lesione, le forze del citoscheletro e substrato sono accoppiati ed equilibrata. Dopo lesione indotta da laser del neurite, le connessioni tra alcune sorgenti e il substrato sono interrotti. Così, il substrato è più contrastando la forza di trazione dell'elemento cytoskletal. Il tallone intrappolato, attaccato alla membrana, replica la direzione delle forze citoscheletro chiarificati.

Figura 2
Figura 2. Monitoraggio interferometrico di un (a) Campo chiaro intrappolato tallone, attaccato alla membrana del assone di un neurone dell'ippocampo durante laser indotta lesione. immagini acquisite durante l'ablazione di un assone. Prima che la lesione sul pannello sinistro. Dopo la lesione sul pannello di destra. Un tallone rivestito poli-D-lisina è attaccato alla membrana (polistirolo perlina, O 4 micron) e tenuto in una trappola ottica. Potenza media del laser IR al campione è di 14 mW. Freccia bianca indica il sito della lesione. Bar è di 5 micron. (B) le tracce registrate da indietro sul piano focale interferometria della posizione tallone nella trappola ottica. Blu, verde e rosso le tracce rappresentano la posizione tallone lungo x, y, e Z, rispettivamente. Frequenza di campionamento è di 20 kHz. (C) Spostamento di un graffio sul supporto cultura misurata dal video tracking per monitorare la deriva palco. Blu e verde le tracce sono le xey posizioni ottenute dai video tracking. Frame rate è di 5,5 Hz.

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Figura 3. Analisi del diametro dell'assone durante il rilascio della tensione, e la tensione della membrana dell'assone lesionato. (A) campo immagine luminosa di dell'assone lesionato, sul pannello di sinistra. La linea perpendicolare bianca per l'assone indica la posizione in cui viene calcolata una chimografo. Sul pannello di destra, chimografo del diametro dell'assone, a monte del sito di lesione. Ogni riga del chimografo corrisponde a 0,18 sec. (B) Somma di intensità dei pixel di ogni riga della chimografo rappresenta una stima del diametro dell'assone durante il rilascio della tensione. (C) varianza totale del moto browniano del tallone attaccato alla assone (t0 e t1 indicano rispettivamente l'inizio e la fine del rilascio della tensione nel assone dopo dissezione).

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Figura 4. Quantificazione della tensione rilasciato dopo assotomia. (A) campo immagine luminosa di dell'assone lesionato. Il riquadro bianco indica la stima della superficie di contatto tra il sito neuriti lesione e il centro del tallone intrappolato. (B) La traccia di ampiezza totale della forza misurata dopo assotomia (F tot = √ (2 + Fx Fy Fz 2 + 2)). Fx, Fy e Fz sono stati calcolati dalla legge di Hooke (F = kx), dove le tracce del trasferimento sono quelli mostrati nella Figura 2b. Le rigidezze, nelle tre direzioni ortogonali, della trappola ottica sono stati calcolati con il metodo dello spettro di potenza (k x, y = 7.9 micron, PN / K Z = PN / 2,3 micron). ΔpN indica la forza rilasciata misurata tra il momento istanti T0 e T1.

Figura 5 Figura 5. Dipendenza del rilascio della tensione di misura sulla quantità di energia erogata al campione, e sulla superficie di contatto dei neuriti. Dati provenienti da 26 esperimenti condotti sugli assoni dei neuroni di topo hippocamapal a 3 DIV. (A) Diagramma di dispersione dei rilascio della tensione contro neuriti area di contatto tra sedi tallone lesione e intrappolati. (b) Diagramma di dispersione dei rilascio della tensione contro quantità totale di energia fornita per l'area di contatto neurite campione.

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Discussion

Riportiamo in questo lavoro un metodo quantitativo per confrontare l'adesione al substrato neuriti cultura, effettuando la misurazione simultanea forza spettroscopia laser durante lesione cellulare indotta. Il rilascio della tensione misurata è correlato al grado di adesione della cellula al substrato: celle con un numero più elevato di adesioni focali dovrebbero rilasciare meno tensione. Misurando il rilascio di tensione in termini di piconewtons fornisce una grandezza fisica da cui calcolare la assonale adesione al supporto coltura in diverse condizioni sperimentali 14.

Diversi laboratori integrati un dissettore laser con un sistema di pinzette ottiche, adottando i disegni ottici distinti 23. La nostra scelta è stata una messa a punto con il percorso ottico fisse e in movimento palco microscopio. Per fare questo, si introduce un modulatore spaziale di luce nel percorso del raggio laser IR per spostare il punto di cattura rispetto alla posizione del laser UV. Sebbene galvanometric specchi permettono governare la posizione del fuoco del laser senza spostare il campione, possono introdurre rumore meccanico del sistema che interessano le misure di spettroscopia di forza. Inoltre, abbiamo deciso di riposizionare il fuoco del laser IR del campione, dato che l'analisi del movimento browniano consente una rapida ri-taratura della rigidità ottico. Spostando la posizione di punto laser UV sul campione può produrre aberrazioni sferiche che incidono sulla qualità del punto fuoco UV stesso che sono trascurabili solo per piccoli spostamenti della trave dalla sua posizione centrale. Pertanto, variazione delle proprietà ottiche del laser dissettore potrebbe richiedere una taratura de novo della potenza laser emesso contro danni all'entità.

Mediante misurazione spettroscopia di forza, abbiamo potuto osservare che il rilascio della tensione è composto da una fase rapida di pochi secondi, e una fase lenta che potrebbe durare alcune decine di secondi. Come riportato nel precedente lavoro 14, a volte la lentafase potrebbe durare alcuni minuti. Per questo motivo, abbiamo dovuto correggere la misura della forza in video il monitoraggio di un graffio sul sostegno della cultura. In futuro, un approccio migliore sarebbe quello di annullare la tappa deriva con un anello di retroazione, che auto-corregge la posizione del microscopio per video o il monitoraggio interferometrico di un cordone attaccato al vetro di copertura. Questo tipo di configurazione, già riportata in letteratura, richiede un secondo raggio laser centrato sulla sferetta allegato, e garantisce la stabilizzazione palco con precisione sub-nanometrica 24,25.

In futuro, vogliamo applicare il protocollo sviluppato per confrontare l'adesione al supporto assonale cultura a diversi stadi di differenziazione e in diverse condizioni patologiche di fornire un saggio quantitativo per il trattamento farmacologico. Inoltre, lo stesso protocollo potrebbe interessare la progettazione di ponteggi impiantabili, per confrontare l'adesione neuronale a diversi tipi di materiali con distinte meccmeccanicaa o chimiche 26.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Alberto Guiggiani per lo sviluppo del sistema di controllo in tempo reale, Evelina Chieregatti e Hanako Tsushima per penetranti discussioni, Giacomo Pruzzo e Alessandro Parodi per lo sviluppo di elettronica custom e software, e Claudia Chiabrera e Marina Nanni per la loro consulenza e assistenza nella preparazione della coltura cellulare esperto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated Bangs laboratories PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit Polyscience 19539
EQUIPMENT
IR laser IPG Laser GmbH YLM-5-SC-LP ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator Hamamatsu LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software Optics group, University of Glasgow Free downloadable software http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ Hamamatsu Free downloadable software http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD Thorlabs S5980 with C5460SPL 6041 board Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD Teem Photonics PDA100A-EC Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser AA-optoelctronics PNV-001525-040 Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator Olympus MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope Andor BX51 Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD Warner Instruments V887ECSUVB EMCCD
Peltier device Physic Instruments QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage National Instruments Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq NI PCI-6229 Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop

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References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
  2. Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
  3. Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
  4. Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
  5. Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
  6. Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
  7. Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
  8. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  9. Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
  10. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
  11. Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  12. O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
  13. O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
  14. Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1, (183), (2011).
  15. Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. 191-216 (2011).
  16. Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
  17. Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. (2011).
  18. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
  19. Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
  20. Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
  21. Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
  22. Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
  23. Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
  24. Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
  25. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
  26. Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).

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