Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

1Signalling Programme, The Babraham Institute, 2MRC Group, Cardiff School of Biosciences, Cardiff University
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond. J. Vis. Exp. (77), e50484, doi:10.3791/50484 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Otofaji besinlerin, özellikle amino asit yokluğunda eksikliği tarafından tetiklenen bir hücresel tepkidir. Otofaji sitoplazma, uzun ömürlü proteinler ve hatta protein agregatlarının, kusurlu organeller ve virüs ya da bakteri tecrit Autophagosomes adlandırılan çift cidarlı yapıların formasyonu ile tanımlanır. Autophagosomes sonunda üretilen besin sitoplazmaya geri geridönüştürülerek ile, içerik toplu bozulmasına yol açan lizozomlar ile sigorta. Bu nedenle, otofaji hücre dengesini için çok önemlidir ve otofaji bozulmasına hastalık, özellikle nörodejenerasyon, yaşlanma ve kansere yol açabilir.

Autophagosome oluşumu hücreleri çekirdek otofaji makine adı verilen proteinlerin belirli bir grup, tahsis hangi için, bir çok ayrıntılı bir süreçtir. Çekirdek Otofaji makine işlevsel olarak, çeşitli hücresel işlemleri ile ilgili ek proteinler ile tamamlanır membranında örneğin birmitokondriyal ve lizozomal biyoloji e ticareti,. Autophagosomes oluşumu ve bozulması için bu proteinlerin Koordinasyon otofaji son derece dinamik ve sofistike yanıt oluşturmaktadır. Canlı hücre görüntüleme bir tek autophagosome oluşumu olayın seviyesine her otofaji ile ilgili proteinin moleküler katkısı aşağı izlemenizi sağlar ve gerçek zamanlı olarak, bu nedenle bu teknik, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük sunuyor.

Burada bizim analiz için bir mekansal ve zamansal bağlamda kurmak için, istikrarlı bir şekilde GFP-DFCP1 ifade eden bir hücre hattı kullanın. Autophagosomes oluşumuna yol açan haberci yapılardır DFCP1 işaretleri omegasomes. Ilgi (POI) bir protein, kırmızı ya da mavi floresan etiketi ya ile işaretlenebilir. Mitokondri ve lizozomlar ER gibi farklı organeller,,, tüm autophagosome oluşumu farklı adımlar katılan ve belirli bir izci boya kullanılarak işaretlenebilir. AUTOP zaman atlamalı mikroskopiBu deneysel yukarı hagy, bilgi dördüncü boyutu örneğin, süresi hakkında ayıklanmasını sağlar. Dolayısıyla biz uzay ve zamanda otofaji için POI katkısı takip edebilirsiniz.

Introduction

Otofaji 1-3 autophagosome oluşumunun son sonuç için proteinin çok sayıda koordine gerektiren oldukça dinamik bir işlemidir. Mikroskopi muhtemelen en sık otofaji 4 eğitim için uygulanan bir tekniktir. En Otofaji protein lokalizasyonu yaygın hem de endojen proteinlerin immüno-boyama yöntemi ve floresans ile etiketlenmiş eksojen proteinin ifadesi ile, sabit hücrelerinde incelenmiştir. Buna ek olarak, Elektron Mikroskobu (EM), tek başına ve immün-altın etiketleme, ile birlikte bu yapıların 5,6 ince ayrıntıları nitelendirdi. Zaman - bu tekniklerin alanı 3 boyutlu olarak autophagosome oluşumu anlayışımızı kurduk olmasına rağmen, onlar 4. boyut hakkında bilgi yeterli miktarda sağlamak için başarısız oldu. Bu Possi kadar yakın bir autophagosome oluşumu takip verir gibi canlı hücre görüntüleme Bu bariyer üstesindengerçek zamanlı 7 ble. Bu teknik ilk Yoshimori ve arkadaşları 8 tarafından otofaji incelemek için kullanılmıştır, ve giderek bundan sonra kullanılmıştır.

Time-lapse mikroskopi canlı hücrelerde POI ve bir süre boyunca lokalizasyonu yakalar. Iyi karakterize otofaji ve / veya organel işaretleyici bu bilgileri karşılaştırarak, canlı hücre görüntüleme analizi autophagosome oluşumu büyük mekansal ve zamansal bağlamda POI koyabilirsiniz. Canlı hücre görüntüleme analizi autophagosome oluşumu tüm adımları boyunca POI lokalizasyonu tekrarlayan yakalama dayanır, sabit hücre görüntüleme tek bir yakalama dayalı iken. Sabit hücre görüntüleme sadece lifecy farklı aşamalarında aynı anda yakalanan birçok autophagosomes yılında ortalama lokalizasyonu dayalı POI rolünü, varsayabiliriz ise bu nedenle, canlı hücre görüntüleme, autophagosome oluşumunun belirli adımlar da POI katkısı kanıtlayabilirimcle.

Canlı hücre görüntüleme yüksek analitik güç bir yöntem olmasına rağmen, bu göz önüne alınması gereken bazı doğal sınırlamalar vardır. Her şeyden önce, canlı hücre görüntüleme bir ya da daha fazla dış kaynaklı floresanla işaretlenmiş proteinlerin ekspresyonu gerektirir. Floresan etiketleri boyutu büyük olma eğilimindedir ve bazen sterik nedenlerden dolayı bir protein davranışını değiştirebilir. Bu membran 2 boyutları sınırlı alanda çalışması için gereken bu durumu, membran proteinleri için vurgulanır. Önemli olan, bir Autophagosomes membranöz yapılardır ve buna göre oluşumu membran-ilişkili proteinlerin çok sayıda gerektirir.

Başka bir problem seti POI ifade seviyeleri bağlanır. Prensip olarak, bir eksojen protein endojen protein karşılaştırılabilir seviyelerde ifade edilmelidir. Bu alt hücresel yerleşimi önemli düzenleyiciler doymuş olmayacak sağlar, ve inciE analiz biyolojik ilgili olacaktır. Onlar endojen seviyelerinin üzerinde ifade edilir, onlar otofaji yanıt 9 inhibe eğilimi olarak Ayrıca, otofaji proteinlerin aşırı, kaçınılmalıdır. Tersine, POI ifadesi düzeyleri yana fotoğraf beyazlatma olmadan zaman iyi bir süre için yerelleştirme aşağıdaki sağlayacak kadar yüksek olmalıdır, bir uzlaşma gerekmektedir. Memelilerde hücrelerin bir eksojen proteinin en iyi ifade seviyeleri elde ince ayar bir sürü gerektirir, ancak stabil POI farklı düzeylerde ifade hücre hatları kurulması ve tarama ile mümkündür.

Standart floresan mikroskobu ile elde edilebilir uzaysal çözünürlüğü başka bir sınırlayıcı faktördür. Çözünürlük nedenlerle bir dizi için sınırlı olabilir, ama en iyi, yanal çözünürlük 250 nm civarında olacak. Bu, daha küçük bir mesafe ile ayrılmış herhangi bir nesne (veya tek olarak bağlı görüneceği anlamına gelirnesne) ve 250 nm daha küçük nesneleri olduklarından daha büyük resimde temsil edilecek. Bu nedenle görüntülerin her zaman bu düşünce ile yorumlanmalıdır ve bu EM gibi tamamlayıcı teknikler ince ultra-yapısal detay çözmek için gerekli olacaktır.

Sonuç olarak, canlı hücre görüntüleme doğal olarak, uzun bir zaman süresi için potansiyel olarak, hafif bir hücre açığa gerektirir. Bu bir hücre, fotoğraf-toksisite olarak bilinen bir olgu fizyolojik tepkileri değiştirebilir.

Biz başarıyla autophagosomes ER teller 10,11 ile yakın ilişki içinde olan PI3P zengin halka benzeri yapılar olarak adlandırılan omegasomes, köken, ilk kez açıklamak için PI3P-bağlayıcı protein DFCP1 canlı hücre görüntüleme kullandık. Biz açıkça LC3 pozitif yapıları omegasomes ile yakın ilişki içinde oluşmaya başlar göstermiştir. Biz burada bir hücre hattı istihdam stabil canlı hücre için GFP-DFCP1 ifade öneririzilgi protein görüntüleme, autophagosome oluşumunda rolü karakterizasyonu için sağlam bir mekansal ve zamansal çerçeve kurar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre Hazırlanması

  1. (2 sonra% 80 bir confluency için amaç% 30-40 bir confluency için, Dulbecco'nun Modifiye Eagles Orta (DMEM) gece boyunca kültür hücreleri; HEK-293T hücreleri Tohum düşük geçit sayısı istikrarlı bir şekilde 22 mm yuvarlak lamelleri GFP-DFCP1 ifade gün - canlı hücre görüntüleme gün).

2. Hücre transfeksiyonu

  1. İt serum, orta, 3 ul X-tremeGENE 9 DNA Transfeksiyon Reaktif ve pECFP-LC3 plazmid DNA, 0.5 ug azaltılmış 100 ul OptiMEM içeren, her plaka için transfeksiyon kompleksi karışımı hazırlayın. Ve aşağı yukarı pipetleme hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. [Not: defalarca bu Lipofectamine 2000 gibi diğer transfeksiyon reaktifler, toksisite çok şey var bulduk, ve, ek olarak, birçok mikroskopi teknikleri ile müdahale kendi floresan parçacıklar üretmek.]
  2. Plakalardan ortamı aspire ve taze DMEM önceden ısıtılmış 37 ° C de eklemek
  3. Tran Ekle24 saat inkübe hücreleri; pipetleme hücrelere karmaşık sfection.

3. Organel Marker (opsiyonel) ile hücre Kuluçka

  1. 75 nM'lik bir son konsantrasyonda DMEM Mitotracker / Lysotracker ekleyin ve ışığa maruz kalma ve tekrarlayan dondurma ve eritme döngüsü önlemek için, bütün deney günü boyunca, alüminyum folyo ile kaplı bir Falcon tüpüne, buz üzerinde tutmak.
  2. Mitotracker / Lysotracker-ihtiva eden ortam 2 ml 'lik bir kısım çıkarın ve 37 ° C'de ısıtmak; transfekte hücrelerden aspire orta ve Mitotracker / 30, orta ve inkübe hücreleri içeren Lysotracker ile değiştirin - 60 dak.

4. Canlı Hücre Görüntüleme için Kuluçka Odası hazırlanması (Şekil 1)

  1. Temiz metal ve% 75 etanol ve metal O-ring kenarında silikon gres uygulamak ile O-ring plastik.
  2. Forseps plakadan lamel kaldırmak ve lamel alt taraftan ortamın aşırı kuru kullanarak,Bu gibi, yağ ile çok fazla orta karıştırma önlemek için sızıntı olasılığını artıracaktır.
  3. Kapalı bir oda oluşturmak için, arasında sıkışmış lamel ile, plastik O-ring bir çıkıntı üzerinde dinlenme ve plastik O-ring üstüne metal O-ring uygun lamel bırakın.
  4. Plakadan ortamı ile iyi odası; DMEM bikarbonat tampon sistemi yapay CO2 konsantrasyonu gerektirir ve bu noktadan ve üzerine, meydana pH değişiklikleri önlemek için, bir tampon madde içermeyen DMEM ortamı içinde hücrelerinin uzun süreli inkübasyondan kaçınmak % 5-10 arasında ve ortam havasının CO2 konsantrasyonu çok daha düşüktür.

5. Hücre Açlık

  1. Mikroskop sahnede kuluçka odasına koyun.
  2. Tam orta aspire ve açlık orta 2 ml 3 kez yıkayın, hiçbir amino asitler sonunda otofaji yanıt engeller DMEM, kalma emin olmak için; ayarlayınON zamanlayıcı.

6. Mikroskopla inceleme

  1. Canlı hücre geniş alan epi-floresan için yapılandırılmış uygun bir görüntüleme sistemi gerekecektir. Bu genellikle bir araştırma dereceli ters bir mikroskop çerçeve, floresan proteini (ler) / ilgi çekici boya (lar), yüksek kaliteli objektif lens, hassas bir CCD / sCMOS için özel yoğun bir geniş spektrumlu ışık kaynağı, ayna ve filtre oluşacaktır kamera ve bir kuluçka odası. (Bütün büyük mikroskop üreticileri canlı hücre görüntüleme için uygun tam bir geniş alan sistemleri sunuyoruz, ancak bu üreticilerin çeşitli bileşenleri kullanarak bir sistem ev inşa da mümkündür ve bu mikro-Müdürü olarak açık kaynak kodlu yazılım kullanarak kontrol : http / / valelab.ucsf.edu / ~ AA / MMwiki / ). Bizce en önemli yönü floresan gazetecilere ifade seviyeleri en aza böylece yüksek hassasiyet bir sistem kullanmaktır.
  2. Selgörüntüye uygun hücrelere ecting.
    1. Daha autophagosome oluşumu olayları çekilecek sağlayacak büyük ve düz hücreleri seçin. Aynı zamanda, daha önce omegasomes daha büyük bir sayı üretmek başlamıştır hücreleri için tercih.
    2. Videoyu autophagosome oluşumu olayların daha büyük bir oranı yakalamak için, 30 dakika sonra ya da iyi otofaji yanıt içine video yakalama başlatın.
  3. Görüntüleme.
    1. Bir yüksek büyütme lens (100x 1.4 NA) kullanın.
    2. Fotoğraf beyazlatma önlemek için en fazla% 10-20 uyarma ışık yoğunluğunu ayarlayın.
    3. 100-500 msn maruz kalma, 2x2 binning ve 100 kazanç için kamera (Hamamatsu ORCA ER, piksel boyutu 6.45 mikron) ayarlayın.
    4. Görüntü elde etme oranı 1 kare her 10 saniye olarak ayarlayın.

7. ImageJ ile Autophagosome Oluşumu Etkinlikler Montajları oluşturma

[Bu sadece e birleştirilen videoyu tarayarak bir sistematik olmayan bir şekilde yapılabilirilgi delikleri, ama aşağıda belirtildiği gibi o da sistematize olabilir.]

  1. 3 (veya 2) açık görüntü yığınlarının ImageJ / Fiji kanalları ele geçirdi.
  2. Ilgili kanala, yeşil, kırmızı ve mavi LUT (Arama Tabloları) uygulayın; 3 renk birleştirme ve kaydedin.
  3. Analiz sekmesinden, Araçlar> ROI yöneticisi seçin ... > Belirtin, sonra yığının ilk görüntü tanımlanan boyutu rastgele bir alan seçin.
  4. Görüntü sekmesinden, yığının seçilen alanı çoğaltmak için, yinelenen seçin.
  5. Görüntü sekmesinden, Yığınlar seçin> montaj olun ... içeren geçici bir montaj oluşturmak için tüm kareleri ele geçirdi. Tam autophagosome oluşumu olay için montaj tüm kareleri tarama, olayın ilk ve son kare notlar tutun.
  6. Analiz sekmesinden, Araçlar> ROI yöneticisi seçin ... diğer 2 renk için yığının ilk görüntü hem de birleştirilmiş renkleri görüntü için aynı alanı seçmek ve yığınlar yinelenen.
  7. To sekmesinde Dosya, Yeni> Görüntü seçeneğini belirleyin ve yükseklik için belirlenen yatırım getirisi yöneticisi kullanarak başlangıçta seçilen piksel, sayısına göre genişliği için belirlenen 4 kez ROI yöneticisi belirlenen yüksekliği artı 3 renk ve arasında boşluk için 3 piksel Her yığın kare sayısı olarak birleştirilmiş ve set Dilimleri.
  8. Görüntü sekmesinden seçin Yığınlar> Araçlar> Ekle ..., sonra arasında 1 piksel boşluk bırakarak, üst üste her alt yığın bir takın.
  9. Görüntü sekmesinden, Yığınlar seçin> montaj olun ... Bir montaj başlayan ve yakalanan autophagosome oluşumu olayın ilk ve son kare ile biten oluşturmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol açıklanan olarak, dengeli bir şekilde Otofaji indükleyici koşullar altında, GFP ile işaretlenmiş olan DFCP1 ifade eden bir hücre hattı CFP-etiketli LC3 lokalizasyonu takip zaman atlamalı mikroskobu kullanılmıştır. Bu deneyin sonucu 2 serisi veya GFP-DFCP1 ve CFP-LC3 karşılık gelen görüntüler, yeşil bir ve mavi kanaldan biri olan yığınlarının yakalama olduğunu. Daha ileri olarak, protokol bölümünde açıklanan tek autophagosome oluşumu olaylar, karşılık gelen montajı oluşturmak amacıyla, İmageJ kullanarak bu Resim analiz edilmiştir. Bu analiz bize LC3 pozitif autophagosome bir DFCP1 pozitif omegasome çıktığını kanıtlamak için izin verdi. Şekil 2 'de gösterilen montaj olarak, bir omegasome oluşumu küçük bir nokta şeklinde, ikinci çerçeveden belirgin hale gelir. Omegasome karakteristik halka-benzeri bir yapı oluşturmak amacıyla büyümeye başlar, ve 6 dakika sonra maksimum çapına ulaşır. Sonra, omegasome c başlarYaklaşık 10 dakika sonra, ollapsing ve sonunda kaybolur. Şimdi omegasome oluşumu bağlamında LC3 pozitif yapı ya da autophagosome oluşumu koyarak, böylece autophagosome omegasome sonra görünür ve yaklaşık 1.5 dakika sonra açık bir şekilde görünür hale gelir olduğunu görüyoruz. Autophagosome omegasome, ilk nokta ve daha sonra halka ile yakın ilişki içinde genişleyen başlar ve omegasome autophagosome tomurcukları kapalı çöken başladığında. Sonunda autophagosome omegasome kaybolduktan sonra görünüşe göre, lizozomlar ile kaynaştırmak için, geride kalır. Bu analiz hangi LC3 olumlu autophagosomes ilgili omegasomes kaynaklanan göre, 2 yapılar arasındaki fonksiyonel ilişki hakkında açık bir göstergesi sağlar.

Başka bir örnekte, biz lizozomlar ile şekillendirme autophagosome zamansal ve mekansal ilişki (Şekil 3 yakalamak için bir lizozom izci ekledik

Ancak, analiz aynı tür çeşitli nedenlerden dolayı uninterpretable sonuçlara neden olabilir. Şekil 4 'de yer alan örnekte, sonuçlar uninterpretable odak bir sürüklenme bağlı hale gelir. Video başarıyla autophagosome oluşumu almaya başlıyor, ancak odak bir sürüklenme 3 dakika işaretinden sonra ortaya çıkar. Video yakalama sonraki 6 dakika odak dışında devam ediyor, ama sonunda odak manuel olarak 9 ila 10 dakika işareti sonra düzeltilir. Bu analiz olsa da, odak düzeltilir zaman autophagosome oluşumu olay yakalanan olmadığını ayırt etmek imkansız yaparneredeyse tamamlandı ilk olay veya odak kayması sonra başladı yeni bir.

Ilave sorunlar, kültürlenen hücrelerin birbirine karışmış hale gelinceye bağlanabilir. Örneğin, hücreler en iyi confluency daha yüksek de yetiştirilen, onlar oldukça zor odaklı hale getiren bir komşu hücre, üstüne genişletmek zorunda kalıyor. Ayrıca, yüksek confluency az yetiştirilen hücreler açlık başlamadan önce arka otofaji aktivite düzeyleri artan vurguladı olma eğilimindedir.

Son olarak, floresan ile ilgili sorunlar oldukça yaygındır. OBP GFP göre zayıf floresan aktiviteye sahiptir ve genellikle video çekimi daha sonraki aşamalarında fotoğraf ağartılmış alır. Bu video analizi şekillendirme autophagosomes ile POI mekansal ilişki hakkında yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Ancak, bu sorunların bu mTurquise2 gibi türevleri birini kullanarak aşılabilir. Başka bir ortak phenomenon Kırmızı etiketlerinin floresan lizozomlar düşük pH'da söndürüldü değildir gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Autophagosomes sonunda lizozomlar ile sigorta Birçok otofaji protein fizyolojik, lizozomlar içine yaşam döngüsü bitirmek. Ayrıca, işlevsel olmayan proteinler genellikle lizozomlarında bozulması için hedeflenir. Bu nedenle, yerine kırmızı etiketli POI ve omegasomes arasında gerçek bir fiziksel dernek lizozomlar ile autophagosomes en olmayan ilgili dernek, takip sonunda olabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Kuluçka odası. Plastik O-ring metal O-halkası etrafında uygun ve altındaki içeri uzanan ince bir çıkıntı vardır. Lamel plastik O-ringin çıkıntıya yerleştirilir ve daha sonra plastik bir O-ring metal O-ring altında monte edilmiştir. Bu şekilde, lamel kumkapalı bir oda oluşturmak, 2 O-ring arasında wiched.

Şekil 2,
Şekil 2. GFP DFCP1 ve CFP-LC3 ifade eden hücreler, 30 dakika süre ile aç bırakılmış, 1 çerçeve 10 sn arasında bir hızda görüntülendi. Temsili bir autophagosome oluşum olayı bir montaj sunulmuştur. Yeşil ve mavi kanalları sinyal sözde renkli yeşil ve buna kırmızıdır. Oklar ilk ayırt omegasome ve autophagosome gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
FiGüre 3. GFP DFCP1 ve CFP-LC3 ifade hücreleri, Lysotracker kırmızı ile kuluçkaya 30 dakika boyunca aç ve 1 çerçeve her 15 sn 'lik bir hızda görüntülendi. Temsili bir autophagosome oluşum olayı bir montaj sunulmuştur. , Yeşil, kırmızı ve mavi kanalları sinyal sözde renkli, yeşil, mavi ve kırmızı buna bulunmaktadır. Oklar ilk ayırt omegasome ve autophagosome gösterir. Ok Lizozom ile autophagosome füzyon ilk yakalama gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. GFP DFCP1 ve CFP-LC3 ifade eden hücreler, 30 dakika süre ile aç bırakılmış, 1 çerçeve 10 sn arasında bir hızda görüntülendi. Alt-O bir örnek bir montaj ptimal yakalama sunulmuştur. Yeşil ve mavi kanalları sinyal sözde renkli yeşil ve buna kırmızıdır. Oklar ilk ayırt omegasome ve autophagosome gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Video 1. Şekil 2'de sunulan autophagosome oluşumu günde video. Oynatma hızı saniyede 4 kare. filmi görmek için buraya tıklayın .

Video 2. Şekil 3'te sunulan autophagosome oluşumu günde video. Ok, omegasome oluşumu, ve ikinci, lizozom ile autophagosome en füzyon ilk gösterir. Oynatma hızı saniyede 4 kare."> Filmi görmek için buraya tıklayın.

Video 3. Şekil 4 sunulan autophagosome oluşumu günde video. Oynatma hızı saniyede 4 kare. filmi görmek için buraya tıklayın .

Tablo 1. Karşılık gelen bir sağlayıcı ve katalog numarası ile birlikte, protokol için gerekli olan bazı reaktifler ve ekipman listesi.

BUFFERS

Tampon Kompozisyon İkinci Adım
Açlık orta 20 mM HEPES pH 7.4 5.2
140 mM NaCI
1 mM CaCl2
1 mM MgCl2
5 mM Glukoz
% 1 BSA

Tablo 2'de. Bu protokolde kullanılan tampon listesi. Kullanılan tamponlar, bunların bileşimi ve protokol kullanıldığı ilk adım listelenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde tarif edildiği gibi bir yöntem autophagosome oluşumu sırasında protein lokalizasyonu görselleştirme sağlar. Biz olaylar, disk konfokal ve Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi iplik gelin-tarama konfokal dahil olmak üzere açıklanan görselleştirme çeşitli yöntemler denedim. Biz genel amaçlı standart geniş alan epi-floresan hassasiyet ve çözünürlük arasındaki en iyi dengeyi sağlar bulduk. Bu gürültü, az photo-bleaching/photo-toxicity ve hızlı satın alma için iyi bir sinyal sağlar. Hücrenin uygun bölgelerinde hücre yayılır ve düz olan çevre yani görüntü için seçilir eğer optik kesit eksikliği bir sorun değildir. Ancak, kullanılan görüntüleme sistemi uygun (kullanılan donanım ve sistem ayarları açısından hem de) yapılandırılmış önemlidir.

En iyi uzaysal çözünürlüğü için, bir yüksek büyütme, saat kullanılması tavsiye edilirüksek sayısal diyafram immersiyon yağı lens (suya daldırma lens lamel yakın hiçbir yarar görüntüleme sunacak). Bu sinyal-gürültü en üst düzeye çıkarmak ve ağartma en aza indirmek için aydınlatma yoğunluğunu (nötral yoğunluk filtreleri ile gibi), kamera ayarları (pozlama süresi, binning ve kazanç) dengelemek için önerilmektedir. Bu ampirik yapılması gereken, ancak bir rehber olarak, bir 100x 1.4 NA lens kullanırken biz genellikle en fazla% 10-20 için uyarma ışık gücünü azaltmak ve kamera (Hamamatsu ORCA ER, piksel boyutu 6.45 mikron) ayarlayın 100-500 msn maruz kalma, 2x2 binning ve 100 kazanç için.

Görüntü elde etme oranı 1 kare her 1-10 sn aralığında ayarlanmalıdır. Yüksek kare hızlarında görüntüleri görüntü elde etme (daha iyi temporal çözünürlük) arasında daha iyi devamlılığını sağlamak ancak daha fazla ışık hücreleri ortaya çıkarmak ve böylece photo-bleaching/photo-toxicity artacaktır.

Görüntüleme daha fluorescenc isee kanalları, bu kanal yakalama arasındaki gecikme (hızlı filtre değiştiriciler uygun, pozlama süresini azaltmak) en aza indirecek sağlanmalıdır. Bu birleşik görüntü, görünen hareket eserler şansını azaltacaktır. Hareket eserler bir görüntü ayırıcı (bir kamera ile iki floresan kanal aynı anda satın kolaylaştırmak için bir cihaz) veya bir çift kamera adaptörü kullanmayı düşünün önlemek zor kanıtlamaktadır eğer.

Görüntüleme mavi kanal yeşil kanal için mavi floresan çapraz emisyon önlemek için uygun filtreler ve aynalar seçimi gerektirir. Biz başarılı bir dalga boyu, bant genişliği ve yoğunluğu belirli seçimine imkan tanıyarak, Çok renkli V aydınlatıcı kadar kullanır ve bu yüzden çok esnek bir Olympus CellR mikroskop, kullandık. Ancak, ışık kaynağı biz donatılmış bu nedenle (çok) içinde bant geçiren uyarma filtreleri bazı beyaz ışık seçilen wavelengths.For ek olarak geliyor ile 'sızdıran' olduğuküp, yani uyarma ışık filtreleme ek vardır. Ayna / filtre aşağıdaki kombinasyonu (tüm Semrock) kullanıldı. Eksantrik FF01-479-585, Verici FF02-525/40 (GFP) ve FF01-607/36 (mCherry), Dikroik Ayna FF505/606-Di01: GFP ve mCherry için. Uyarıcı FF01-416/501, Verici FF01-523/610, Dikroik Ayna FF440/520-Di01: OBP için. Ayrıca yeşil kanala mavi floresan çapraz emisyon ile, alt iyi sonuçlar verdi farklı bir CellR mikroskop, kullandık. Bu mikroskop beyaz bir ışık kaynağı kullanır ve uyarma wavelengths.This dalgaboyu seçimi tekerlek 8 filtreleri ile sınırlı olduğu anlamına gelir seçmek için hızlı bir filtre tekerleği, ancak yoğunluğu düzenlemek için ayrı bir tekerlek vardır. Ayna / filtre aşağıdaki kombinasyonu kullanıldı. Uyarıcı FF01-470/40, Verici FF02-525/50, Dikroik Ayna FF495-DI02: GFP (Semrock) için. Uyarıcı FF01-427/10 (OBP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), Verici FF01-472/30 (: OBP ve mCherry içinOBP, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), Dikroik Ayna 89006bs (Chroma).

Diğer görüntüleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında bu tekniğin önemi iki yönlüdür: Birincisi, canlı hücreler ilgi protein lokalizasyonu, ve ikinci yakalayabilir, o zaman dördüncü boyut ekleyerek çıkarılan bilgi artırabilir. Ancak, dışsal proteinlerle olarak mislocalization olasılığı ya, her zaman artan ekspresyon düzeyleri nedeniyle veya etiketleme nedeniyle var, bu nedenle canlı hücre görüntüleme amacıyla, sabit hücrelerde endojen POI immün boyama ile kombine edilmelidir sonuçları doğrulamak için . Son olarak, bu canlı hücre görüntüleme analiz uzaysal çözünürlüğü artırmak amacıyla, immün-EM ile kombine edilebilir belirterek değer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Çalışmalarımız Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir. Biz nazik CFP-LC3 ifadesi için plazmid bize sağlamak için Prof Tamotsu Yoshimori teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 41965
OptiMEM I Invitrogen 31985-062
MitoTracker Red FM Invitrogen M22425
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent Roche Applied Science 6365787001
22 mm coverslips VWR 631-0159
35 mm plates Fisher NUNC 153066
Silicon grease RS Components Ltd. RS 494-124
O-rings Custom made
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A-7816 Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope Olympus IX81 Inverted microscope
Objective Olympus UPLSAPO 100XO N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera Hamamatsu ORCA-R2 C10600 10B Progressive scan interline CCD
Illuminator TILL Photonics Polychrome V Ultrafast monochromator
Incubation chamber Solent Scientific Cell^R IX81
Software Olympus SIS xcellence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
  2. Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
  3. Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
  4. Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
  5. Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
  6. Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
  7. Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
  8. Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
  9. Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
  10. Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
  11. Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics