Leve Cell Imaging av Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

1Signalling Programme, The Babraham Institute, 2MRC Group, Cardiff School of Biosciences, Cardiff University
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Time-lapse mikroskopi av fluorescensmerkede autophagy markører tillater overvåking av den dynamiske autophagy respons med høy tidsmessig oppløsning. Ved hjelp av spesifikke autofagi og organellesystemer markører i en kombinasjon av tre forskjellige farger, kan vi følge bidraget av et protein til autophagosome formasjonen i en robust romlig og tidsmessig sammenheng.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond. J. Vis. Exp. (77), e50484, doi:10.3791/50484 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Autophagy er en cellulær respons som utløses av mangel på næringsstoffer, særlig fraværet av aminosyrer. Autophagy er definert ved dannelsen av dobbel membran struktur, kalt autophagosomes, som binder cytoplasma, langlivede proteiner og protein aggregater, defekte organeller, og selv virus eller bakterier. Autophagosomes til slutt satt sammen med lysosomer fører til bulk nedbrytning av sitt innhold, med de produserte næringsstoffer blir resirkulert tilbake til cytoplasma. Derfor er autofagi avgjørende for celle homeostase, og feilregulering av autofagi kan føre til sykdom, spesielt nevrodegenerasjon, aldring og kreft.

Autophagosome formasjonen er en svært omfattende prosess, der cellene har tildelt en bestemt gruppe proteiner som kalles kjernen autophagy maskiner. Kjernen autophagy maskiner er funksjonelt supplert med ekstra proteiner som er involvert i ulike cellulære prosesser, for eksempel i membrane menneskehandel, i mitokondrie og lysosomale biologi. Koordinering av disse proteinene for dannelse og nedbrytning av autophagosomes utgjør høyst sofistikert og dynamisk respons av autophagy. Sanntids avbildning celle gjør det mulig å følge den molekylære bidraget fra hver autophagy-relatert protein ned til nivået for en enkelt autophagosome formasjon arrangement og i sann tid, og derfor denne teknikken gir en høyere tids-og romlig oppløsning.

Her bruker vi en cellelinje stabilt uttrykker GFP-DFCP1, for å etablere en romlig og tidsmessig sammenheng for vår analyse. DFCP1 merker omegasomes, som er forløperen strukturer som fører til autophagosomes formasjon. Et protein av interesse (POI) kan merkes med enten en rød eller cyan fluorescerende tag. Ulike organeller, som ER, mitokondrier og lysosomer, er alle involvert i ulike trinn av autophagosome formasjon, og kan merkes ved hjelp av en bestemt tracker fargestoff. Time-lapse mikroskopi av AUTOPHagy i denne eksperimentelle oppsettet, gjør at informasjon som hentes ut om den fjerde dimensjon, dvs. tid. Derfor kan vi følge bidraget av POI til autophagy i rom og tid.

Introduction

Autophagy er et høyt dynamisk prosess, som krever koordinering av et stort antall proteiner for det endelige resultat av autophagosome formasjon 1-3. Mikroskopi er trolig den teknikken som oftest brukt for å studere autophagy fire. Lokalisering av de fleste autophagy proteiner har blitt grundig studert i faste celler, både ved immuno-farging de endogene proteiner og ved uttrykk for fluorescently merket eksogene protein. I tillegg har Electron Microscopy (EM), alene og i kombinasjon med immuno-gull merking, beskrives de fine detaljene i disse strukturene 5,6. Til tross for at disse teknikkene har etablert vår forståelse av autophagosome formasjonen i de tre dimensjonene av plass, har de unnlatt å gi tilstrekkelig mengde informasjon om den 4. dimensjon - tid. Live-cell imaging overvinner denne barrieren som gjør det mulig å følge dannelsen av en autophagosome så nær som muBle å sanntid 7. Denne teknikken ble først ansatt for å studere autofagi av Yoshimori og kolleger 8, og har blitt stadig mer brukt nå av.

Time-lapse mikroskopi fanger lokalisering av POI i levende celler og over en tidsperiode. Ved å sammenligne denne informasjonen med en godt karakterisert autofagi og / eller organeller markør, kan levende celle bildebehandling analyse sette POI i større romlig og tidsmessig sammenheng med autophagosome formasjon. Live-cell imaging Analysen er basert på repeterende fangst av POI lokalisering langs alle trinnene autophagosome formasjon, mens avbildning av faste celler er basert på en enkelt fangst. Derfor kan levende celle bildebehandling bevise at bidraget fra POI på bestemte trinn på autophagosome formasjon, mens avbildning av faste celler kan bare anta rollen som POI, basert på gjennomsnittlig lokalisering i mange autophagosomes samtidig fanget på ulike stadier av lifecy derescle.

Selv om levende celle bildebehandling er en metode for høy analytisk kraft, har det noen iboende begrensninger, som bør tas i betraktning. For det første krever levende celle avbildning ekspresjonen av ett eller flere eksogene fluorescensmerkede proteiner. Fluorescerende koder en tendens til å bli store i størrelse, og de kan noen ganger endre oppførselen til et protein på grunn av steriske grunner. Denne situasjonen er fremhevet for membranproteiner, som de trenger for å fungere i det begrensede området i to dimensjoner av membraner. Til opplysning, autophagosomes er membran-strukturer, og følgelig deres dannelse krever et stort antall membran-assosierte proteiner.

Et annet sett av problemer er knyttet til uttrykket nivåer av POI. I prinsippet skal et eksogent protein uttrykkes ved nivåer sammenlignbare med det endogene protein. Dette sikrer at viktige regulatorer av sin sub-cellulær lokalisering vil ikke bli mettet, og the analysen vil være biologisk relevant. Videre bør overekspresjon av proteinene autophagy unngås, som når de blir uttrykt over det endogene nivået, har de en tendens til å inhibere responsen autophagy 9.. Omvendt skal ettersom uttrykket nivåer av POI være høy nok til å tillate etter at den er lokalisert til en god periode uten foto-bleking, er et kompromiss for å nås. Oppnå den optimale uttrykk nivåer av et eksogent protein i pattedyr celler krever mye finjustering, men det er mulig ved å etablere og screening cellelinjer stabilt uttrykker ulike nivåer av POI.

Den romlig oppløsning som kan oppnås med standard fluorescens mikroskopi er en annen begrensende faktor. Oppløsning kan være begrenset av en rekke grunner, men i beste fall vil lateral oppløsning være rundt 250 nm. Dette betyr at eventuelle gjenstander adskilt med en avstand som er mindre enn dette vil vises koblet til (eller som en enkeltobjektet) og objekter som er mindre enn 250 nm vil være representert i bildet større enn de faktisk er. Derfor bildene skal alltid tolkes med dette i tankene og komplementære teknikker som EM vil være nødvendig for å løse fin ultra-strukturelle detaljer.

Endelig krever levende celle avbildning iboende eksponere en celle for lys, eventuelt i en lengre tidsperiode. Dette kan endre de fysiologiske responser i en celle, et fenomen kjent som foto-toksisitet.

Vi har med hell brukt levende celle avbildning av PI3P-bindende protein DFCP1 å beskrive for første gang at autophagosomes stammer fra PI3P-rik ring-lignende strukturer kalt omegasomes, som er i nært samarbeid med ER tråder 10,11. Vi har klart vist at LC3-positive strukturer begynne å danne i nært samarbeid med omegasomes. Vi her tyder på at ansette en cellelinje stabilt uttrykker GFP-DFCP1 for live cellavbildning av protein av interesse, etablerer et robust romlig og tidsmessig ramme for karakterisering av sin rolle i autophagosome formasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Celleforberedelsen

  1. Seed lav passasje antall HEK-293T celler stabilt uttrykker GFP-DFCP1 på 22 mm runde Dekkglass, kultur celler overnatter i Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM), til en confluency på 30-40% (mål for en confluency av 80% etter 2 dager - dag av levende celle bildebehandling).

2. Cell Transfection

  1. Forbered transfeksjon kompleks blanding for hver plate, som inneholder 100 mL OptiMEM jeg redusert serum medium, 3 ul X-tremeGENE ni DNA Transfection Reagens, og 0,5 mikrogram pECFP-LC3 plasmid DNA. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned og inkuberes 15 minutter ved romtemperatur. [Merk: Vi har gjentatte ganger funnet at andre transfeksjon reagenser, for eksempel Lipofectamine 2000, har mye av toksisitet, og i tillegg produserer de fluorescerende partikler på egenhånd som forstyrrer mange mikroskopi teknikker.]
  2. Aspirer mediet fra platene og tilsett friskt DMEM forvarmet ved 37 ° C.
  3. Legg til transfection komplisert å celler ved pipettering, inkuber celler for 24 hr.

3. Cell Inkubasjon med Organelle Marker (valgfritt)

  1. Legg mitotracker / lysotracker til DMEM ved en endelig konsentrasjon på 75 nM, og holder på is, i en Falk rør dekket med aluminiumsfolie, langs hele eksperimentelle dagen, for å unngå lyseksponering og repeterende frysing og tine sykluser.
  2. Ta en delmengde av 2 ml av mitotracker / lysotracker-holdig medium og varmes opp til 37 ° C; aspirate medium fra transfekterte celler og erstatte med mitotracker / lysotracker-holdig medium og inkuberes cellene i 30 - 60 min.

4. Utarbeidelse av Inkubasjon Chamber for Live Cell Imaging (figur 1)

  1. Rent metall og plast O-ringer med 75% etanol og anvende silikonfett på felgen av metallet O-ringen.
  2. Ved å anvende pinsett fjerne dekkglass fra platen og tørk overskudd av medium fra den nedre side av dekkglass,for å unngå blanding for mye medium med fett, da dette vil øke sannsynligheten for lekkasje.
  3. La dekkglass til å hvile på avsatsen av plasten O-ringen og monter metall O-ring på toppen av plast O-ring, med dekkglasset klemt i mellom, for å skape et lukket kammer.
  4. Topp opp kammeret med mediet fra platen, fra dette punkt og videre, unngå langvarig inkubering av cellene i DMEM-medium uten et buffermiddel, for å hindre endringer i pH for å forekomme, da bikarbonatbuffer system av DMEM krever kunstig CO2-konsentrasjonene på 5-10% og at CO2-konsentrasjonene av omgivende luft er mye lavere.

5. Utsulting av celler

  1. Sett inkubasjon kammer på mikroskopet scenen.
  2. Aspirer komplett medium og vaskes med 2 ml av sult medium 3 ganger, for å sikre at ingen aminosyrer har forblitt fra DMEM, som til slutt vil hemme autophagy reaksjon; angitidsur PÅ.

6. Mikroskopi

  1. En passende imaging system konfigureres for live celle bredt felt epi-fluorescens vil være nødvendig. Dette vil typisk omfatte et forsknings-grade invertert mikroskop ramme, en intens bredspektrede lyskilde, speil og filtre spesifikke for den fluorescerende protein (s) / fargestoff (r) av interesse, høy kvalitet objektiv, en følsom CCD / sCMOS kamera og en inkubasjonstid kammer. Alle de store mikroskop produsenter tilbyr komplette wide-feltet systemer passer for live cell imaging, men det er også mulig å hjemme-bygge et system med komponenter fra en rekke produsenter og kontrollere den ved hjelp av åpen kildekode programvare som Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). Det viktigste aspekt ved vår mening, er å bruke et system med høy følsomhet, slik at uttrykket nivåer av de fluorescerende reportere kan holdes på et minimum.
  2. Selecting de riktige cellene til bilde.
    1. Velg store og flate celler som vil tillate mer autophagosome dannelse hendelser som skal fanges. Også velge celler som allerede har begynt å produsere et større antall omegasomes.
    2. Start videoopptak etter 30 min eller godt inn autophagy respons, for å ta en større andel av autophagosome dannelse hendelser per video.
  3. Imaging.
    1. Bruk en høy forstørrelse objektivet (100x 1,4 NA).
    2. Juster intensiteten av eksiteringslys til 10-20% av maksimum for å forhindre foto-bleking.
    3. Sett kameraet (Hamamatsu ORCA ER, pixel størrelse 6,45 mikrometer) til 100-500 msek eksponering, 2x2 binning og 100 gevinst.
    4. Sett bildet oppkjøpet sats til en ramme hvert 10 sek.

7. Opprette Montages av autophagosome Formasjon Hendelser med ImageJ

[Dette kan gjøres i et ikke-systematisk måte ved å skanne det fusjonerte video for events av interesse, men det kan også være systematisert som beskrevet nedenfor.]

  1. Åpne bildestakker for tre (eller to) fanget kanaler i ImageJ / Fiji.
  2. Påfør grønn, rød og blå LUT (søketabeller) til tilsvarende kanal, flette tre farger og lagre.
  3. Fra kategorien Analyser, velger du Verktøy> ROI leder ... > Spesifiser, og velg deretter et tilfeldig område definert størrelse i det første bildet av stabelen.
  4. Fra kategorien Bilde, velg duplisere, for å duplisere det valgte området av stabelen.
  5. Fra kategorien Bilde, velg Stacks> Gjør montage ... å lage en tentativ montage inneholder alle rammer fanget. Skann alle rammer i montasjen for en komplett autophagosome formasjon hendelse, holde notater av det første og siste bildet av hendelsen.
  6. Fra kategorien Analyser, velger du Verktøy> ROI leder ... velge det samme område i det første bildet av stabelen for de andre to farger, så vel som for den sammenslåtte farger bilde og duplisere stabler.
  7. Fra tHan kategorien Fil, velg Ny> Bilde og satt for bredde i henhold til antall piksler i utgangspunktet valgt ved hjelp av ROI leder, satt for høyde 4 ganger høyden satt i ROI leder pluss tre piksler for plass i mellom de tre fargene og de sammen, og satt Slices som antall bilder i hver bunke.
  8. Fra kategorien Bilde velger Stakker> Verktøy> Sett ..., og sett hver sub-stack oppå hverandre, slik plass av en piksel i mellom.
  9. Fra kategorien Bilde, velg Stacks> Gjør montage ... å lage en montasje start og etterbehandling med den første og siste bilde i autophagosome dannelsen hendelsen fanget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I protokollen beskrevet, har vi brukt time-lapse mikroskopi å følge lokalisering av CFP-merket LC3 i en cellelinje stabilt uttrykker GFP-merket DFCP1 under autophagy induserende forhold. Utfallet av dette eksperimentet er fangst av to serier eller stabler av bilder, ett fra den grønne og en fra den blå kanalen, tilsvarende GFP-DFCP1 og CFP-LC3. Vi har videre analysert disse videoene ved hjelp ImageJ, for å skape montasjer som tilsvarer én autophagosome dannelse hendelser, som beskrevet i protokollen delen. Denne analysen tillot oss å bevise at en LC3-positive autophagosome stammer fra en DFCP1-positive omegasome. I montasjen vist i figur 2, blir dannelsen av en omegasome fremgå fra den andre ramme, i form av en liten flekk. Den omegasome begynner ekspanderer for å danne den karakteristiske ring-lignende struktur, og når sin maksimale diameter etter 6 min. Deretter starter den omegasome collapsing og til slutt forsvinner, etter ca 10 min. Putting nå dannelsen av LC3-positive struktur eller autophagosome i sammenheng med omegasome formasjon, ser vi at autophagosome vises etter omegasome, og blir godt synlig etter ca 1,5 min. Den autophagosome begynner å utvide i nært samarbeid med den omegasome, første spot og deretter ringen, og når omegasome begynner å kollapse de autophagosome knopper av. Omsider autophagosome blir igjen, tilsynelatende å fusjonere med lysosomene, etter omegasome forsvinner. Denne analysen gir en klar indikasjon om den funksjonelle sammenhengen mellom de to strukturene, i henhold til hvilke LC3 positive autophagosomes stammer fra tilsvarende omegasomes.

I et annet eksempel, har vi lagt et lysosome tracker for å fange den tidsmessige og romlige foreningen av forming autophagosome med lysosomer (figur 3

Imidlertid kan den samme type av analyse produsere uninterpretable resultater, på grunn av en rekke årsaker. I eksempelet vist i figur 4, blir resultatene uninterpretable grunn av en dor i fokus. Videoen starter lyktes å fange dannelsen av en autophagosome, men en drift i fokus oppstår etter 3 min mark. Videoopptak fortsetter ute av fokus for neste 6 min, men til slutt fokuset manuelt korrigert etter de 9 til 10 min mark. Denne analysen skjønt, gjør umulig å diskriminere om autophagosome dannelsen hendelsen fanget når fokus blir rettet opp er deninnledende hendelse som er nesten ferdig, eller en ny en som har startet etter drift i fokus.

Ytterligere problemer kan tilskrives den konfluens av de dyrkede celler. For eksempel, når cellene er dyrket til konfluens høyere enn optimalt, blir de tvunget til å ekspandere på toppen av en tilstøtende celle, som blir fokuseringen ganske tung. Videre celler som er dyrket ved høy confluency tendens til å bli stresset, øker nivåene av bakgrunnen autophagy aktivitet før oppstart av sult.

Til slutt, fluorescens-relaterte problemer er ganske vanlig. CFP har svakere fluorescens aktivitet sammenlignet med GFP, og ofte får foto-bleket på senere stadier av video fange. Analyse av slike videoer kan føre til falske negative konklusjoner om den romlige sammenslutning av POI med forming autophagosomes. Imidlertid kan disse problemene løses ved å bruke en av variantene som mTurquise2. En annen vanlig fenomenologisken stammer fra det faktum at fluorescensen av røde koder ikke slukkes ved den lavere pH av lysosomer. Mange autophagy proteiner fysiologisk fullføre sin livssyklus i lysosomer, mens autophagosomes slutt smelte sammen med lysosomer. Videre er ikke-funksjonelle proteiner ofte målrettet for degradering i lysosomene. Derfor kan man ende opp med å følge den ikke-relaterte sammenslutning av autophagosomes med lysosomer, i stedet for en faktisk fysisk sammenheng mellom en rød-merket POI og omegasomes.

Figur 1
Figur 1.. Inkubasjon kammeret. Plasten O-ringen passer rundt kanten av metallet O-ring, og har i bunnen en tynn avsats som strekker seg innover. Dekkglass plasseres på hylle av plasten O-ringen, og deretter av plast O-ringen er montert i bunnen av metall-O-ring. På denne måten er dekkglass sandwiched mellom de to O-ringer, noe som skaper et lukket kammer.

Figur 2
Figur 2. Cellene uttrykker GFP-DFCP1 og CFP-LC3 ble sultet i 30 min og avbildes med en hastighet på 1 frame hvert 10 sek. En montasje av en representant autophagosome formasjon arrangementet er presentert. Signaler fra grønne og blå kanalene er pseudo-farget grønn og rød tilsvarende. Pilene viser først merkbar omegasome og autophagosome. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figure tre. Cellene uttrykker GFP-DFCP1 og CFP-LC3, ble inkubert med lysotracker rød, sultet i 30 min og avbildes med en hastighet på en ramme hvert 15 sek. En montasje av en representant autophagosome formasjon arrangementet er presentert. Signaler fra grønne, røde og blå kanalene er pseudo-farget grønn, blå og rød tilsvarende. Pilene viser først merkbar omegasome og autophagosome. Pilspissen angir første fangst av autophagosome fusjon med lysosome. Klikk her for å se større figur .

Figur 4
Figur 4. Cellene uttrykker GFP-DFCP1 og CFP-LC3 ble sultet i 30 min og avbildes med en hastighet på 1 frame hvert 10 sek. En montasje av et eksempel på sub-o ptimal fangst er presentert. Signaler fra grønne og blå kanalene er pseudo-farget grønn og rød tilsvarende. Pilene viser først merkbar omegasome og autophagosome. Klikk her for å se større figur .

Video 1. Video av autophagosome dannelsen hendelsen presentert i Figur 2. Avspillingen satsen er 4 bilder per sekund. Klikk her for å se film .

Video 2. Video av autophagosome dannelsen hendelsen presentert i Figur 3.. Pilen viser først, dannelsen av omegasome, og andre, er sammensmeltingen av det autophagosome med lysosome. På avspillingen er fire bilder per sekund."> Klikk her for å se filmen.

Video tre. Video av autophagosome dannelsen hendelsen presentert i Figur 4. Avspillingen satsen er 4 bilder per sekund. Klikk her for å se film .

Tabell 1. Liste over spesifikke reagenser og utstyr som kreves for protokollen, sammen med den tilsvarende leverandør og katalognummer.

BUFFERE

Buffer Sammensetning Trinn Brukes
Sult medium 20 mM HEPES pH 7,4 5.2
140 mM NaCl
1 mM CaCl 2
1 mM MgCl2
5 mM Glukose
1% BSA

Tabell 2. Liste av buffere som brukes i denne protokollen. Bufferene som benyttes, er deres sammensetning og i første trinn ved hvilken de brukes i protokollen oppført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som beskrives i denne protokollen tillater visualisering av et protein lokalisering under autophagosome formasjon. Vi har prøvd ulike metoder for å visualisere hendelsene beskrevet inkludert point-skanning confocal, spinning disk confocal og Total Internal Reflection fluorescens (TIRF) mikroskopi. Vi har funnet at for generelle formål standard bredt felt epi-fluorescens gir det beste kompromiss mellom sensitivitet og oppløsning. Dette sikrer godt signal til støy, minimal photo-bleaching/photo-toxicity og rask oppkjøpet. Mangelen på optiske snitting ikke er et problem hvis passende regioner av cellen er valgt for å bilde dvs. periferien hvor cellen er spredt og flat. Det er imidlertid viktig at den avbildning som brukes er hensiktsmessig konfigurert (både i form av den maskinvare som brukes og systemet innstillinger).

For best romlig oppløsning, er det anbefalt å bruke en høy forstørrelse, high numerisk aperture olje nedsenking objektiv (vann nedsenking objektiver vil gi ingen fordel bildebehandling på nærhet til dekkglass). Det er foreslått å balansere intensiteten av belysning (f.eks med nøytral tetthet filter), kamerainnstillingene (eksponeringstid, binning og gevinst) for å maksimere signal-til-støy og minimere bleking. Dette må gjøres empirisk, men som en guide, når du bruker en 100x 1,4 NA objektiv vi vanligvis redusere kraften i vår eksiteringslys til 10-20% av maksimal og sett kameraet (Hamamatsu ORCA ER, pixel størrelse 6,45 mikrometer) til 100-500 msek eksponering, 2x2 binning og 100 gevinst.

Bildeinnlastingen bør angis i størrelsesorden en ramme hvert 1-10 sek. Hente bilder ved høyere bildefrekvens vil sikre bedre kontinuitet mellom bilder (bedre tidsmessig oppløsning), men vil utsette celler til mer lys og dermed øke photo-bleaching/photo-toxicity.

Hvis bildebehandling mer fluorescence-kanaler, må det sikres at forsinkelsen mellom kanal fangst er minimert (redusere eksponeringstid, passe rask filter skiftere). Dette vil redusere sjansene for bevegelsesfeil vises i det sammensatte bildet. Hvis bevegelsesfeil viser seg vanskelig å unngå vurdere å bruke et bilde splitter (en enhet for å lette samtidig kjøp av to fluorescens kanaler ved hjelp av ett kamera) eller en to kamera adapter.

Imaging blå kanalen krever valg av hensiktsmessig filtere og speil for å unngå kryss-utslipp av den blå fluorescens til den grønne kanalen. Vi har med hell brukt en Olympus CellR mikroskop, som bruker Till Polychrome V-lys, slik at spesifikke valg av bølgelengde, båndbredde og intensitet, og så er veldig fleksibel. Imidlertid er lyskilden 'lekk "med noen hvite lys som kommer gjennom i tillegg til den valgte wavelengths.For denne grunn vi har montert (multi) båndpass-filtre i eksiteringsposisjonerkuber, slik at det er ekstra filtrering av eksiteringslys. Den følgende kombinasjon av speil / filter ble anvendt (alle Semrock). For GFP & mCherry: Exciter FF01-479-585, Emitter FF02-525/40 (GFP) og FF01-607/36 (mCherry), Dichroic Mirror FF505/606-Di01. For CFP: FF01-416/501 Exciter, Emitter FF01-523/610, Dichroic FF440/520-Di01 Mirror. Vi har også brukt en annen CellR mikroskop, som har gitt sub-optimale resultater, med kryss-utslipp av blå fluorescens til den grønne kanalen. Denne mikroskop bruker en hvit lyskilde og har en rask filter for å velge det eksitasjon wavelengths.This betyr at bølgelengden valget er begrenset til de åtte filtre i hjulet, men det er en separat hjul for å regulere intensiteten. Den følgende kombinasjon av speil / filter ble benyttet. For GFP (Semrock): FF01-470/40 Exciter, Emitter FF02-525/50, Dichroic Mirror FF495-DI02. For CFP og mCherry: Exciter FF01-427/10 (CFP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), Emitter FF01-472/30 (CFP, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), Dichroic Mirror 89006bs (Chroma).

Betydningen av denne teknikken i forhold til andre imaging teknikker er todelt: For det første kan den fange lokalisering av proteinet av interesse i levende celler, og andre, kan det øke informasjon hentet legge den fjerde dimensjonen tid. Men som med eksogene proteiner er det alltid mulighet for mislocalization, enten på grunn av økte ekspresjonsnivåer eller på grunn av tagging, bør derfor levende celle avbildning kombineres med immuno-farging av det endogene POI i faste celler, for å underbygge resultatene . Til slutt er det verdt å merke seg at levende celle avbildning kan kombineres med immuno-EM, for å øke den romlige oppløsningen av analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Vårt arbeid er støttet av bioteknologi og Biological Sciences Research Council. Vi ønsker å takke Prof Tamotsu Yoshimori for vennlig forsyne oss med plasmidet for uttrykket av CFP-LC3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 41965
OptiMEM I Invitrogen 31985-062
MitoTracker Red FM Invitrogen M22425
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent Roche Applied Science 6365787001
22 mm coverslips VWR 631-0159
35 mm plates Fisher NUNC 153066
Silicon grease RS Components Ltd. RS 494-124
O-rings Custom made
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A-7816 Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope Olympus IX81 Inverted microscope
Objective Olympus UPLSAPO 100XO N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera Hamamatsu ORCA-R2 C10600 10B Progressive scan interline CCD
Illuminator TILL Photonics Polychrome V Ultrafast monochromator
Incubation chamber Solent Scientific Cell^R IX81
Software Olympus SIS xcellence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
  2. Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
  3. Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
  4. Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
  5. Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
  6. Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
  7. Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
  8. Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
  9. Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
  10. Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
  11. Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics