주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

1Reference and Translation Centre for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University Rostock, 2Institute for Experimental Surgery, University of Rostock
Biology

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Summary

마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.

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Donndorf, P., Ludwig, M., Wildschütz, F., Useini, D., Kaminski, A., Vollmar, B., Steinhoff, G. Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration. J. Vis. Exp. (81), e50485, doi:10.3791/50485 (2013).

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Abstract

회생 세포 치료의 맥락에서 혈관 세포 애플리케이션 프로토콜의 시대에서, 조직 nonmarrow 줄기 세포 이동의 기본 메커니즘은 완전히 명확하지 않았다. 우리는 여기에서 생체 내에서 주변의 골수 줄기 세포 이동의 분석을 위해 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술을 설명합니다. M.의 cremaster의 현미경의 intravital 이전 혈관 내피 세포와 백혈구 작용의 직접적인 관찰에 염증 연구 분야에 도입되었다. 충분한 주변 줄기 및 전구 세포의 이동은 내피와 intravasculary 관리 줄기 세포의 상호 작용의 관찰과 정량 M.의 cremaster 모델을 적용하기 위해 생각할 수있다 안감 내피에 따라 확고한 접착 롤링 유사한 초기 단계를 포함하기 때문에. 각종 화학 성분을 선택적으로 표적 t에 적용될 수있는 바와 같이superfusion 간단한 기술에 의해 문제는 그것이 골수 변두리 살아있는 유기체에서 일어나는 초기 줄기 세포 모집위한 필수적인 전제 조건의 미세 환경을 확립하는 것이 가능하다.

Introduction

본 문서의 목적은 주변의 골수 줄기 세포 이동의 직접 관찰 및 분석을위한 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술 (IVM)를 설명하는 것입니다.

줄기 세포의 현재 개념 기반의 조직 및 장기 재생은 손상된 조직 1 골수 유래 줄기 세포의 원점을 포함한다. 성공적인 줄기 세포의 이동을위한 중요한 단계는 내피 마이그레이션 결국 장기 생착 2 다음에 부상 기관 내에서 지방의 내피 세포와 세포의 상호 작용을 줄기가 포함되어 있습니다. 이러한 줄기 세포의 intravital 분석 - 내피 세포 상호 작용은 생체 내에서 서로 다른 병태 생리 학적 설정에서 줄기 세포 기반 재생 반응의 정량화를위한 ​​이상적인 매개 변수를 형성한다. 게다가 생각할 보인다, 미래에 특정 줄기 세포 (P)의 이동성 용량의 intravital 분석표준화 된 미세 순환 환경 내 opulations는 이전에 추가 임상 시험에이 인구를 전진 적용 할 수 있습니다.

의 intravital 현미경 초기 염증 연구 3의 분야에서 생체 내에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 관찰 및 정량화를 위해 개발되었다. 의 intravital 현미경 연구의 첫 번째 성공 기록은 광학 현미경 4에서 개구리 '방언과 mesenteries을 공부하고, 19 세기에 이미 Cohnheim에 의해보고되었다. 처음 사용 IVM은 엄청난 기술 개발과 오늘을받은 이후 특정 필수 구성 요소는 양적 IVM을 수행하기 위해 전제 조건을 형성 : (I) 조직 광 액세스를 허용 준비, (ⅱ) 현미경으로 검출 할 수있다 분자 프로브, (ⅲ ) 검출 시스템 및 화상 데이터로부터 그 파라미터를 추출 할 수있다 (iv) 컴퓨터 기반 분석 시스템에 연결된 현미경4를 설정합니다.

조직 준비의 다양한 mesenteries 및 마우스와 쥐 5, 마우스, 6, 햄스터, 토끼 귀 및 이름에 햄스터 뺨 주머니의 등쪽 피하 지방 챔버의 간을 포함 IVM의 연구에 도입되었습니다.

그러나, 준비 및 시각화가 잘 표준화 된 수술로 가능으로 다음에 우리의 intravital 관찰을위한 이상적인 조직을 나타내는 마우스 cremaster 근육에 초점을 맞출 것이다, 그리고 일반적으로 운동의 유물 아무런 문제가 발생하지 않습니다. 오픈 cremaster 근육 준비는 바에즈에 의해 1970 년대에 처음 실시와 동료 7되었다. 원래 쥐에 대해 기재된, 그것은 마우스 (8)에 성공적으로 채택되었다. 이전의 연구는 주로 혈관 벽 백혈구의 상호 작용에 초점을 맞추고 난 후에, 우리 자신의 그룹은 최근에를 증명하는 등의 마우스 cremaster 근육 준비를 도입직접 시각화 및 정의 미세 내에서 줄기 세포 - 내피 세포 상호 작용의 정량적 분석을위한 상상력 도구입니다. 각종 줄기 세포 모집단은 뮤린 C-KIT + 골수 줄기 세포 및 중간 엽 줄기 세포뿐만 아니라 인간의 CD (133) + 골수 줄기 세포 10-12 등이 모델을 이용하여 연구되었다. 기증자의 골수 및 시각화를위한 형광 표지로부터 세포 격리 다음, 줄기 세포를 선택적으로함으로써 원격 장기 내의 세포 포획을 회피 대퇴 동맥을 통해 동맥 주입을 이용하는 cremaster 미세 혈관에 적용된다. 잠재적으로 각각 설정 내의 로컬 줄기 세포의 이동을 매개 각종 케모카인이 국소 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수 있기 때문에 한층 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다.

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Protocol

세포 격리 후 전체 프로토콜은 약 2 시간 소요됩니다.

1. 미세 수술 준비

  1. 9,12은 세포가 동물의 동작을 행하는 시간 동안 휴식을 허용하는 표준화 된 프로토콜에 따라 도너 골수 및 절연 모집단의 형광 라벨링에서 줄기 세포 분리를 수행한다. 형광 표지를 위해 우리는 CFDA (카르복시 디 아세테이트 숙신 이미 딜 에스테르)를 추천합니다.
  2. 케타민 (75 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (2.5 ㎎ / ㎏) 20-25 g의 무게 남성 마우스를 마취. (일반적으로 매일 30 ~ 60 분) 필요에 따라 수술 및 실험 프로토콜을 통해, 마취 보조제로 (초기 주입의 10 %, IP)을 유지해야한다.
  3. 부드럽게 오른쪽 음낭의 앞쪽 측면뿐만 아니라 오른쪽 허벅지와 사타구니를 면도. 모든 적신 면봉으로 머리를 잃을 수집합니다. 플렉시 글라스 시청 무대에서 마우스 복부 측면을 배치하고 수수료를 수정탄력있는 주름을 사용하여 t. 무대는 다리와 음낭 모두 상승의베이스 플레이트의 꼬리 가장자리에베이스 플레이트와 제 2 플레이트로 구성, 맞춤 제작된다. 37 ℃의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 스테이지를 놓고 스테이지에 고정 후, 조작 현미경 동물을 배치하고 (10)를 사용하여 다음의 조작을 수행하는 단계 - 16 배 배율로.
  4. 사타구니까지 오른쪽 허벅지, 무릎에서 대퇴 혈관의 바로 앞쪽에 피부 가위를 사용하여 초기 절개를합니다.
  5. 대퇴 동맥을 확인하고 주위 조직에서 동맥을 동원, 근위를 따릅니다. 확인하고 thermocautery 사용하여 왼쪽 고환에 큰 가지를 잘라. 그 후 왼쪽 고환에 표면적으로 숙박 봉합을 배치합니다. 부드러운 견인은 대퇴 동맥의 추가 근위 동원을 용이하게합니다.
  6. 근위 동원 종료 후, 식별하고 대규모 분기 실행 mediall 컷thermocautery에 의해 허벅지에 y를 입력합니다. 그 후 오른쪽 허벅지의 말단 부분에있는 대퇴 동맥을 결찰. 합자에 부드러운 견인 더 준비를 도움이됩니다.
  7. 다시 근위 대퇴 동맥에 지금 관심을 뒤집어 근위 가능한 동맥 주위의 봉합을 배치합니다. 매듭을 준비했지만 아직 묶어하지 않습니다. 봉합에 부드러운 견인을 적용하고 동맥 꼬임을 만들 수 있습니다.
  8. 꼬임을 설정 한 후, 동맥 신중 microscissor을 사용하고 절개. 대퇴 정맥이 손상되지 않도록 특별한주의를 기울입니다.
  9. 절개를 통해 준비된 microcatheter (내경 0.28 mm)를 삽입합니다. 카테터 (0.9 % 염화 나트륨, 염화나트륨)을 탈기하고 1 ㎖ 주사기 삽입 이전에 연결되어야한다.
  10. 카테터의 성공적인 삽입 후, 정중 카테터의 통과를 용이하게하기 위하여 꼬임을 풀어. 동맥 혈류량은 카테터 내에 즉시 볼 수 있어야한다. 부드럽게 카테터를 몇 밀리미터를 진행이전 꼬임 이후의. 그 후, 카테터의 고정을위한 준비 합자를 묶어.
  11. 부드럽게 정확한 위치를 확인하기 위해 카테터 (0.9 % 염화나트륨)과 대기음을 세척하십시오. 추가 작업 단계에 카테터를 확보하기 위해 테이프의 조각을 사용합니다.
  12. 적절한 고정 후, cremaster 근육의 다음과 같은 준비 단계를 따로 카테터를 넣어. 혈전 형성을 방지하기 위해 정기적 인 세척 및 카테터마다 5 ~ 10 분의 열망을 적용합니다.
  13. 오른쪽 음낭에 지금 관심을 켜고 오른쪽 음낭의 복부 측면 위의 피부와 근막을 절단하여 절개를합니다. 모든 악기와 기본 조직을 건드리지 않도록주의하십시오.
  14. 최대 사타구니 배와 꼬리 쪽 음낭의 말단부에 절개를 확장합니다.
  15. 그것을 건드리지 않고 cremaster 자루 위를 조심스럽게 분리 기본 부드러운 결합 조직. cremaster의 말단부를 식별하고, SL 여기 숙박 봉합을 배치ightly 근육을 확장 할 수 있습니다. 부드럽게 꼬리 쪽과 앞쪽 근육을 당겨 근육 자루 아래에 지금 남아있는 연부 조직을 절제.
  16. 결합 조직에서 완전히 분리 한 후, 가위를 사용하여 두개골 가장자리에 한 지점에서 cremaster의 자루를 엽니 다. 근육의 선단이 개방 아래에서 절개를 확장합니다.
  17. 그 후 가위를 사용하여 근육과 고환 사이의 나머지 연결을 절단, thermocautery 사용하여 고환과 cremaster를 연결하는 작은 용기를 밀봉.
  18. 현미경 필드 중에 고환을 옆으로 누워.
  19. 열린 cremaster 이제 무대에 평평. cremaster 근육 조직을 확산하기 위해 조직의 가장자리에 네 6-0 Prolene으로 숙박 봉합을 배치하고 탄력있는 주름으로 수정합니다. 지금부터 연속적으로 1 ㎖ 주사기 (도 1)를 사용하여 인산염 완충 식염수 (PBS)로 조직을 적실.
  20. 지금 15 분 동안 휴식을 준비 할 수 있습니다. 그 후 주입미세 혈관의 콘트라스트 향상을위한 좌측 대퇴 동맥을 통해 1 % 로다 민 - 덱스 트란의 0.05 ~ 0.1 ML. 어떤 케모카인이나 염증성 에이전트가 응용 프로그램에 대한 계획하는 경우, 당신은 지금 화제로 1 ML의 주사기를 사용하여 각각의 시약과 근육을 습하게한다. 대조 실험의 경우, PBS로 가습 계속.

2. 의 intravital 현미경

  1. 가동 스테이지 상에 고정 된 마우스를 유지하고 에피 조명용 변성 및 CCD (전하 결합 소자) 비디오 카메라에 접속 형광 현미경으로 움직인다. 대퇴 동맥 카테터를 탈구하지 않도록 특별한주의를 기울입니다.
  2. 침수 목표를 사용하여 실험을 실시하고 있습니다.
  3. cremaster의 미세 혈관의 충분한 시각화 및 세포 주입하기 전에 목표를 조정 한 후, 확률 적으로 회사의 줄기 세포 부착 이후 분석을 위해 여섯 후 모세관 세정맥을 정의합니다.
  4. 형광 표지 된 줄기 세포를 관리,대퇴 동맥 카테터를 이용하여 다섯 경기를 연속으로 주사의 총과 1 ML의 주사기와 주입 당 0.4 × 10 6 세포에 200 ㎕의 PBS에 용해. 에 앞서 첫 번째 주사로 세포 샘플을 흔들어.
  5. 기록 줄기 세포함으로써 일반적인 세​​포와 함께 내피 안감을 따라 셀 속도의 50 % 이상 감소로 "만들기"를 정의, 세포 주입 후 즉시 롤링 "스틱 및 해제"운동을. 롤링 줄기 세포의 카운팅과 매 사출 다음 관찰 한 분 동안 미리 정의 세정맥 거리를 통과하는 모든 줄기 세포를 수행한다. 줄기 세포 말기의 양은 모두 전달 세포의 백분율로서 표현된다. 롤링 세포로 무작위 간단한 테 더링 현상을 보이는 세포를 계산하지 않습니다.
  6. 마지막 셀 사출 카운트함으로써 단단히 부착 줄기 세포의 수를 결정하고 번째의 계산 내피 표면 관계로 양을 표현 다음전자 사전 정의 된 6 개의 작은 정맥 (직경 x 길이 x π) 부착 세포 / mm 2로. 어떤 세포의 움직임이 30 초 동안 감지 할 수 없을 때 회사 접착 간주됩니다.
  7. 의 intravital 현미경을 완료 한 후 신중하게 cremaster 근육을 제거하고 나중에 분석 (면역 조직 화학이나 분자 생물학)에 대응하여 저장합니다. 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 줄기 세포 압연 회사 내피 부착뿐만 아니라, 적혈구 속도 (mm / 초), 선박 길이 (μm의), 혈관 직경 (μm의), 벽의 공유 속도와 같은 미세 혈관 혈류 역학의 정량의 intravital 현미경 기록의 분석 (초 -1), 이미지 처리 소프트웨어를 이용하여 각 실험 조직 치료 멀게 조사자에 의해 오프라인으로 수행되어야한다.

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Representative Results

일반적으로, 직접적으로 상호 작용이 cremaster 근육 미세 혈관 내에서 혈관 내피 세포와 줄기 또는 전구 세포를 주입하는 것은 드문 경우이며, 후 모세관 세정맥 (직경 : 30 ~ 80 μm의)에 독점적으로 발생합니다. 때문에 형광 라벨 압연에 단단히 부착 줄기 세포는 명확하게 (그림 2) 관찰 세정맥에서 내생 백혈구 순환에서 분리 정량화 할 수있다.

혈액 유속 및 벽 전단 속도로 나타내는 미세 순환 조건은 일반적으로 다른 케모카인 치료 (표 1)와 각 실험 그룹간에 큰 차이가 없다.

염증 반응의 다른 케모카인 또는 매개체로 cremaster 근육 조직의 국소 치료, 예를 들어, SDF-1α (간질 세포 유래 인자-1 알파) 또는 TNF-α (종양 괴사 인자 - 알파)는 특정 마일을 모방 할 수있다croenvironmental 조건. 이러한 조건은 특정 케모카인 / 매개체에 따라 서로 다른 양의 줄기 세포 - 내피 세포 상호 작용을 바로 적용 줄기 세포 집단은 (도 3) (12)을 주입했다. 분명히 줄기 세포 내피 세포의 상호 작용이 서로 다른 패턴을 정량화 할 수있는 가능성은 임상 시험을 발전하기 위하여이 인구를 진행하기 전에 생체 내에서 정의 된 미세 환경 내에서 특정 줄기 세포 인구의 철새 잠재력의 평가를 위해 수 있습니다.

또한, 이러한 질소 산화물 결핍 같은 내피 기능에 영향을 미치는 특정 병태 생리 학적 조건의 영향은 녹아웃 동물 (9)의 사용에 의해 나타났다.

그림 1
그림 1. 마우스 cremaster 뮤스의 주요 미세 수술 단계 (AF)의 그림이후의 intravital 현미경 사이클 준비.

그림 2
그림 2. 쥐 cremaster 근육 준비에 C-키트 + 세포의 intravital 현미경. 혈관 내 배경은 rhodamin-덱스 트란에 의해 제공됩니다. 여섯 (검은 색 화살표)를 압 연 연속 이미지와 세정맥 혈관. 연구소 투자 2008, 권 88에 단단히 부착 (흰색 화살표) 카르복시 플루오 레세 인 D-아세테이트 succinimidylester 표지 C-키트 + 세포의 (AF) 시리즈. 카민스키, A., 엄마, N., Donndorf, P. 등.

그림 3
그림 3. 의 intravital 형광 현미경 이미지를 기반으로 C-키트 + 세포와 내피 세포 사이의 상호 작용의 정량 분석. + 세포 롤링의 수는 모두 C-키트에 비해 + 케모카인 전처리 (제어)없이 세포 주입. 혼자 SDF-1α와 치료 및 SDF-1α + TNF-α의 조합은 롤링 C-키트 + 세포의 비율을 증가했다. (B) 세정맥 내피 안감의 mm 2 당 단단히 부착 C-키트 + 세포의 수는 크게 만 SDF-1α + TNF-α의 조합으로 치료 후 증가한다. ± SEM 의미로 데이터가 표시된다 (* P <제어 대 0.05). 연구소 투자, 2008 권 88. 카민스키, A., 엄마, N., Donndorf, P. 등.

마우스 유형 실험 그룹 적혈구 속도(mm / 초) 벽의 전단 속도 (초 -1)
야생형 제어 0.7 ± 0.2 43 ± 32
야생형 SDF-1α 0.5 ± 0.2 51 ± 31
야생형 TNF 0.4 ± 0.2 45 ± 24
야생형 SDF-1 α + TNF α 1.0 ± 0.5 117 ± 26

표 1. 기준에 쥐 cremaster 근육의 작은 정맥에서 혈액 세포의 속도와 벽 전단 율 레드. 분석은 SDF-1α, TNF-α와 치료 후 야생형 생쥐의 근육 준비에 CapImage 소프트웨어 (Zeintl, 바덴 뷔 르템 베르크, 독일)를 사용하여 수행 하였다. 각 그룹 간의 평균 ± 표준 편차의 차이가 큰 것을 찾을 수 없습니다로 데이터가 표현된다. 등.

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Discussion

의 intravital 형광 현미경 직접 시각화 및 줄기 세포 내피 세포 상호 작용의 정량 분석​​을 할 수 있습니다. 노광 및 미세 수술 기술의 intravital 시각화가 잘 백혈구 - 내피 세포 상호 작용 및 다양한 화학 성분에 대한 연구 중에 선택적 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수있는 확립 된 이후 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다. 인해 움직임 아티팩트 심한 화상 노이즈의 부재로,이 특정 모델이 좀더의 intravital-현미경 설정에 비해, 세포 - 세포 상호 작용의 시각화를위한 최적의 조건을 제공한다.

이 모델은 살아있는 유기체에서 개최하는 최초의 줄기 세포 모집에 필수적인 미세 환경 전제 조건을 공개 할 수 있습니다. 필요한 경우, 내생 백혈구는 유효성 검사를 위해 긍정적 인 컨트롤을 제공하고 줄기 세포 행동의 원리를 증명할 수 있습니다.

jove_content는 "> 급성 동물 모델을 나타내는 대신 정맥 응용 프로그램의 직접 동맥 주입을 활용, 만성 세포 이동 모델 및 / 또는 조직 세포 전달의 잠재적 인 제한 -으로 인해 원격 기관 내에서 함정 수사에 예를 들면 세포의 손실은 -. 다른 한편으로 방지 할 수 있습니다 한편, 급성 수술 조직 외상 따라서 atraumatic 수술 준비 cremaster 근육 준비는 실험 그룹과 재현 패션 전에 시작에서 달성해야 할 다음과 같은 미세 순환 조건 필수 및 안정되어있다. 조직 활성화 자체의 어느 정도를 유도 할 가능성이있다.

후 모세관 세정맥 및 제어 동물의 intravital 현미경 녹음의 시작 부분에있는 주변 조직에 형광 염료의 중요한 누설 내에서 광범위한 백혈구 축적의 존재는 주요 수술 조직 외상을 나타냅니다.

그러나 세심한 prepa을 적용하는 경우에도다른 조사에서 파생 배급 기술, 결과는 반드시 인해 약간 기본 조직 활성화를 다른 완전히 비교할 수 없습니다. 이후의 실험은 가능한 한 같은 조사가 수행해야하는 이유입니다.

조직을 표적으로하는 줄기 세포 모집의 초기 단계의 분석 및 정량화를 위해 설계된 현재의 모델은 명확한 줄기 세포 기관 - 생착에 문을 허용하지 않습니다.

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Disclosures

이 원고를 실시 모든 동물 실험은 지역 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA C1157
Rhodamine 6 G (1%) Sigma-Aldrich, Munich, Germany 83697
Ketamin (Ketanest) Pfizer, Berlin, Germany not available
Xylacin (Rompun) Bayer, Leverkusen, Germany not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS) PAN Biotech, Aidenbach, Germany P04-36500

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References

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