Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Клетки человека нейрональные (NPC) были расширены под пролиферирующих условиях. НПС дифференцировались в нейронных богатых культур в присутствии комбинации нейротропинов. Нейронные маркеры были обнаружены иммунофлуоресцентного окрашивания. Чтобы изолировать чистую популяцию нейронов, НПС были дифференцированы на PEN мембранных горками и лазерная захвата микродиссекции была выполнена.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bouchard, R., Chong, T., Pugazhenthi, S. Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture. J. Vis. Exp. (79), e50487, doi:10.3791/50487 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Нейрональные клетки-предшественники (НПК), выделенные из головного мозга плода человека были расширены при пролиферативных условиях в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF), чтобы обеспечить избытке клеток. НПС дифференцировались в присутствии новой комбинации фактора роста нервов (NGF), головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), дибутирил цАМФ (DBC) и ретиноевой кислоты на чашки, покрытые поли-L-лизин и мыши ламинин, чтобы получить нейрон богатых культур. НПС также дифференцированы в отсутствие нейротропинов, DBC и ретиноевой кислоты и в присутствии цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), получая астроцитов богатых культур. Дифференцированные НПС характеризовались иммунофлюоресцентного окрашивания для панели нейронных маркеров, включая NeuN, synapsin, ацетилхолинэстеразы, синаптофизина и GAP43. Глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и STAT3, астроцитов маркеры, были обнаружены в 10-15% дифференцированных NPC. Для облегчениякамерного типа конкретных молекулярная характеристика, лазерная захвата микродиссекции было проведено с целью изолировать нейроны культивировали на полиэтиленнафталата (PEN) мембранные горки. Методы, описанные в данном исследовании ценный инструмент для продвижения нашего понимания молекулярного механизма нейродегенерацией.

Introduction

Пожизненное нейрогенез как известно, происходит в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и в субгранулярной слоем зубчатой ​​извилине взрослом мозге млекопитающих 1. Нейрональные клетки (NPC), которые происходят из этих регионов мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты 2. НПС породили интерес из-за их потенциала для пересадки у больных с различными нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, инсульт и болезни Альцгеймера (БА) 3. Исследования с НПС в целом направлены на этого угла трансплантации но потенциал NPC-производных нейронов в качестве модели клеточной культуры, чтобы определить механизм нейродегенерацией не в полной мере. Предыдущие исследования обычно используется постмитотические нейроны, выделенные из головного мозга грызунов тканей, которые должны быть выделены для каждого эксперимента, поскольку они несамообновлению. Хотя человеческая нейробластома клеточные линии, включая SH-SY5Y и SK-N-MC клетки могут быть расширены, они не имеют характеристики первичных нейронов. Человеческие НПС, с другой стороны, предлагают как преимущества, так как они могут быть расширены для многократного прохода и могут быть дифференцированы, чтобы генерировать клеточной популяции с характеристиками первичных нейронов 4,5. В текущем исследовании, мы описываем новый протокол дифференциации получить последовательную нейронов богатых населения из коммерчески доступных НПС, выделенных из мозга человеческого плода. Поскольку эти культуры действительно содержат небольшой процент клеток глии, нужно использовать дополнительные методы, чтобы изолировать чистую популяцию нейронов для молекулярных характеристик. Лазерный захват микродиссекции (LCM) представляет собой новый метод, с помощью которого гомогенной популяции клеток из раздела тканей могут быть селективно захватывается для анализа экспрессии генов 6. Мозг представляет собой гетерогенную ткань, состоящая из нейронов, глии и другие мобильные типес. LCM была использована для определения экспрессии генов нейронов конкретных анализов 7-10. Ранее мы уже выполняется НОК нейронов гиппокампа от AD (Tg2576) разделов мозга мыши, чтобы показать снижение экспрессии циклического элемента AMP ответ связывающего белка (CREB) и BDNF в частности, в нейронах гиппокампа 11. В настоящем исследовании мы описываем процедуры для расширения человеческих НПС, дифференцировки нейронов, иммунофлуоресцентного окрашивания нервных маркеров и LCM для выделения нейронов культивируемых на PEN мембранных слайдов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Расширение человека НПС (рис. 1)

  1. Оживить Замороженный исходный материал человека НПС из мозга плода (Lonza, Walkersville, MD, США) и культуры их в суспензии в Т-75 колб как нейросферы (рис. 1А) в Neurobasal среде, содержащей распространения добавки, EGF (10 нг / мл) и FGF (10 нг / мл).
  2. После 3 дней в культуре, передавать нейросферы в 15 мл пробирку и центрифугируют при 500 оборотах в минуту в течение 5 мин.
  3. Жидкость над осадком сливают, оставляя за ~ 100 мкл среды выше клеточного осадка и передавать в пробирку Эппендорфа. 100 мкл осадок клеток достаточно разделить на 2 Т-75 колб. Если меньше, уменьшить количество колб как нейрональные клетки-предшественники не могут размножаться если разделить тонкими.
  4. Растирают с осадок мкл 50х наконечника 200, удерживая наконечник 200 мкл против нижней части трубы. Разделите клеточной суспензии поровну на две части и добавить их в 2 Т-75 колб (1-2 Сплит), по одному для продолжалирасширение и другой для дифференциации.
  5. Продолжить культуру нейрональных клеток для расширения (в первую колбу) путем изменения среды каждые 4-5 дней, пока нейросферы не достигают своего оригинальный размер 300-500 мкм. Изменение среды путем центрифугирования (500 оборотов в минуту; 5 мин), отказаться от старого среду и добавить новую среду.

2. Дифференциация человека НПС в Нейрон-богатой культуры (рис. 2)

  1. Для дифференциации нейрональных клеток-предшественников нейронов в богатой культурой, поместите один покровное в каждую лунку 24-луночного планшета и покрыть 100 мкг / мл поли-L-лизина путем добавления 500 мкл в каждую лунку. Инкубировать посуду в течение 30 мин при комнатной температуре.
  2. Аспирируйте поли-L-лизин раствор и сполосните пластину стерильной водой.
  3. Далее, покрывают лунки планшета с 500 мкл 5 мкг / мл мышиного ламинина и инкубируют в течение 30 мин. После инкубации промойте лунки с PBS.
  4. 4 дня после splittiнг клетки (шаг 1.4), передать небольшие нейросферы в колбу, помеченные 'для дифференциации' в блюда, покрытые с плотностью ~ 500 нейросферы на лунку в 24-луночный планшет.
  5. Через 6 ч, когда нейросферы приложить к чашке, удалить среды пролиферацию и дифференцировку добавить среду, состоящую из Neurobasal среды, B27 добавка, NGF (20 нг / мл), BDNF (10 нг / мл), DBC (100 мМ), и ретиноевой кислоты (2 мкМ).

3. Иммунофлуоресценции Окрашивание дифференцированных НПС (рис. 3)

  1. После культуре нейрональных клеток в дифференцировке в нейроны среды в течение двух недель, нейрон-богатой культурой получается. Промыть нейроны раз в PBS, а затем исправить их в 4% параформальдегида в течение 30 мин. После фиксированной, промыть клеткам три раза PBS.
  2. Инкубируйте клетки с пермеабилизации буфера (5% BSA и 0,2% Тритон Х-100 в ЗФР) при комнатной температуре в течение 60 мин.
  3. Выдержите посуду O / N при 4 ° C Iпа шейкер со следующим сочетанием поликлональные и моноклональные антитела в 3% БСА в PBS: NeuN (1:250) и synapsin (1:250); ацетил холинэстеразы (1:500) и синаптофизин (1:250); BDNF (1 : 500) и GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) и GFAP (1:1000).
  4. Промыть покровные три раза ЗФР, а затем инкубируют с их анти-кроличьего-Cy3 и анти-мыши-FITC вторичными антителами при комнатной температуре в темноте в течение 90 мин. После инкубации, мыть покровные три раза PBS.
  5. Поместите 10 мкл монтажной среды на предметное стекло, вынуть покровное из культуральной блюдо с пинцетом, и поместить его вниз головой на монтажную среду. Аккуратно протрите лишнюю монтажную среду и запечатать края с лаком для ногтей.
  6. Изучите иммуноокрашиванию нейронов в флуоресцентным микроскопом.

4. Лазерная Захват микродиссекция нейронов (рис. 4)

  1. Дифференцировать НПС в нейронной богатых культуры на PEN мембраны слайдаы покрывают поли-L-лизин и мыши ламинина в соответствии с процедурами, описанными в рисунке 2.
  2. Выполните все последующие шаги в рамках РНКазы условиях.
  3. Пятно культуры с использованием HistoGene Пятно (Arcturus) для визуализации клеток.
  4. Найти области чистых популяций нейронов, лишенных астроцитов с помощью дорожной карты образ всего слайда с системой Veritas LCM. Отметить нейроны используя инструменты рисования.
  5. Выполните лазерный захват этих областях с использованием компьютерным управлением точность и автоматизацию в два этапа. Во-первых, ИК (инфракрасный) обжигают при нескольких пятен с током, лазерным 70 мВт и импульса 2500 мкс, чтобы получить мембрана приложить к крышке. Далее, отмеченные область вырезали с помощью режущего инструмента УФ на условиях низкого уровня 10 мВ.
  6. Сочетание этих процессов выборочно захватывает отмеченные районы от мембраны PEN на CapSure LCM макро колпачками. Когда колпачок снят, мембрана с пeurons придерживается крышки.
  7. Изолировать общей РНК из образцов LCM использованием изоляции комплект PicoPure РНК (Arcturus) и лечения ДНКазой.
  8. Amplify выделенной РНК с помощью РНК RiboAMP усиления комплект в соответствии с инструкциями из комплекта.
  9. Выполните реального времени RT-PCR анализ с использованием TaqMan зонды для обнаружения человеческого нейрофиламентов тяжелую цепь (hNFHc).

Сокращения:

AD, болезнь Альцгеймера; BDNF, мозговой нейротрофический фактор; CREB, циклический АМФ элемент ответ связывающий белок; DBC, дибутирил цАМФ; EGF, эпидермальный фактор роста; FGF, фактор роста фибробластов; GFAP, глиальных фибриллярного кислого белка; LCM, лазерная захватить микродиссекции; ФРН, фактор роста нервов; NPC, нейрональные клетки; PEN, полиэтиленнафталат.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Расширение НПС (рис. 1)

Когда нейросферы разбита на суспензии отдельных клеток растиранием, наконечник пипетки должна касаться дна трубки так, чтобы было некоторое сопротивление, когда суспензию пипеткой вверх и вниз. Количество раз растирания будет варьироваться между отдельными лицами и должно быть принято решение методом проб и ошибок, изучив полученную суспензию клеток под микроскопом. Очень важно, чтобы обеспечить достаточную плотность клеточной суспензии, потому что распространение будет более быстрыми темпами, когда НПС приходят в тесном контакте. Если НПС не растут, плотность клеток должна быть увеличена за счет уменьшения количества колб. Мы смогли расширить нейросферы для до 10-15 проходов. Таким образом избытке человека НПС могут быть получены, сокращения использования эмбриональной ткани человека. Для непрерывных поставок НПС и нейронов, желательно расширить их первоначально в течение 3-4 проходов, а затем, Половина из НПС может быть расширена как нейросферы а другая половина может быть дифференцирована для текущих экспериментов. Кроме того, НПС может быть также расширен за несколько проходов, замороженных в жидком азоте, как в случае клеточных линий, чтобы генерировать больший запас запасов, и возродил при необходимости. Желательно также проводить эксперименты с нейронами, полученных из различных партий NPC.

Нейронов Дифференциация НПС (рис. 2)

НПС мультипотентные клетки и могут быть дифференцированы в нейроны, астроциты или олигодендроциты в зависимости от условий культивирования. Наш протокол дифференциация предусматривала посев 4-дневных нейросферы в покрытых блюд (рис. 2а). Мы заметили, что очень важно, чтобы отобрать достаточное плотность нейросферы так, чтобы дифференцирующие нейроны разбросаны по всему и образуют густую сеть нервных процессов. Изображения после 1 (рис. 2В) и 4 дня (рис.Юр 2C) посева показаны. Нейронные богатой культуры, дающие 80-90% нейронов и астроцитов 10-15%, были получены после дифференциации НПС в присутствии комбинации NGF, BDNF, DBC и ретиноевой кислоты в течение двух недель (фиг. 2D). Насколько нам известно, протокол, описанный в данном исследовании для дифференцировки нейронов не сообщалось ранее другими. В районах с низкой плотностью, NPC дифференцированы в астроциты (рис. 2Е). Для получения астроцитов богатой культуры, NPC можно культивировать в присутствии CNTF (10 нг / мл) и в отсутствие NGF, BDNF, DBC и ретиноевой кислоты. Таким образом, нейрон-астроцитов состав можно манипулировать во время дифференцировки в зависимости от цели эксперимента.

Характеристика дифференцированных нейронов (рис. 3)

Для дальнейшего охарактеризовать эти дифференцированные НПС, мы провели двойную иммуноокрашивания для нейронных маркеров жIth поликлональные и моноклональные антитела, а затем воздействия на кроликов и мышей вторичных антител, связанных с Су3 (красный) и FITC (зеленый) соответственно. Следующие нейронов маркеры были обнаружены: рисунок 3A:. NeuN и synapsin 3В:. Ацетил холинэстеразы (Ache) и синаптофизин 3С: BDNF и GAP43. Таким образом, дифференцированные НПС имеют характеристики первичных нейронов. Кроме того, астроцитов маркеры STAT3 и GFAP были обнаружены в небольшой популяции клеток (рис. 3А). Поэтому дополнительные методы необходимы для нейронов конкретных анализа экспрессии генов.

Лазерная Захват микродиссекция (НОК) нейронов (рис. 4)

Хотя LCM могут быть использованы для выделения клеток из культуральной чашке, наших первоначальных попыток LCM с нейронами не удалась, поскольку они прочно прикреплены к посуде с покрытием. Чтобы преодолеть эту проблему, мы дифференцированы НПС Oн слайды с ручкой мембранных вставками, покрытые поли-L-лизина и мыши ламинином. На слайде был помещен 100 мм клеточной культуры блюдо (рис. 4А). Аранжировки мембранного слайд PEN и LCM шапки показаны на рисунке 4В. Культуры окрашивали HistoGen пятно (Арктур) для визуализации клеток (рис. 4в). На слайде был помещен в микроскоп в приборе Арктур ​​Veritas. Нейроны, которые будут захвачены были отмечены инструментов для рисования (рис. 4D). CapSure УГ Крышки были размещены на мембране PEN. Используя сочетание УФ лазерной резки и ИК захвата лазерного, отмеченных областях были собраны на крышке. Захваченные нейроны показано на крышке при низких (рис. 4F) и высокой (Рисунок 4F) увеличении.

Рисунок 1
Рисунок 1.Расширение человека NPC. А. НПС культивировали в суспензии в колбах Т75, как нейросферах. B. Когда нейросферы достигла размер 300-500 мкм, они были переведены в 15 мл пробирки и центрифугировали при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. С. Супернатант отбрасывали и Осадок клеток в 200 мкл среды переносили в пробирки Эппендорфа и растирают. D. Нейросферы готов быть разделены показаны. E. отдельные нейросферы следующие растирание показаны.

Рисунок 2
Рисунок 2. Дифференциация человека NPC. А. Нейросферы были разбиты растиранием и культивировали в течение четырех дней, чтобы генерировать новые нейросферы. Б. Четыре суточных нейросферы высевали в чашки, покрытые поли-L-лизина и мыши ламинином. С. дифференциацииции НПС наблюдалось в присутствии NGF, BDNF, DBC и ретиноевой кислоты в течение трех дней после посева. D. Neuron богатой культуры был получен после двух недель. E. НПС дифференцировались в астроциты в районах с низкой плотностью. F. НПС дифференцированы в культуре астроцитов богатых в присутствии CNTF (10 нг / мл) и в отсутствие NGF, BDNF, DBC и ретиноевой кислоты.

Рисунок 3
Рисунок 3. Нейронов и астроцитов маркеры в дифференцированных человека NPC. НПС дифференцированных в течение двух недель фиксировали и иммунологически окрашивали двойной для указанных целей с поликлональные и моноклональные антитела, а затем воздействия на кроликов и мышей вторичных антител, связанных с Су3 (красный) и FITC (зеленый) соответственно. Следующие нейронов маркеры были обнаружены: А. Neun и synapsin.Б. ацетил холинэстеразы (АХЭ) и синаптофизин. С. BDNF и GAP43. Кроме того, следующие астроцитов маркеры были обнаружены: D. STAT3 и GFAP.

Рисунок 4
Рисунок 4. Лазерная захвата микродиссекции нейронов. А. НПС были дифференцированы на PEN мембраны слайда, покрытого поли L лизина и мыши ламинином. На слайде был помещен 100 мм клеточной культуры блюдо. Б. Аранжировки PEN мембраны горкой и LCM крышкой в приборе Арктур ​​Veritas показаны. С. Культуры окрашивали HistoGen пятно (Арктур) для визуализации клеток. Д. нейроны, которые будут захвачены были отмечены инструментов для рисования. Захваченные нейроны показано на крышке при низких (E) и высокой (F) Магнификации. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описываем в этом исследовании нейрона богатых модель клеточной культуры по дифференциации самообновляющихся нейрональных клеток человека и способ, чтобы изолировать чистую популяцию нейронов лазерным захвата микродиссекции. Мы использовали комбинацию NGF, BDNF, DBC и ретиноевой кислоты для нейронов дифференциации NPC. DBC используется для активации CREB, транскрипционный фактор, который усиливает нейрогенез 12. Ретиноевой кислоты вызывает выход из клеточного цикла и снижает глиальных население 13. Метод, описанный в данном исследовании включает модификации более нашем предыдущем докладе 14. Мы ранее использовали стадию растиранием нейросферы к суспензии отдельных клеток, а затем посев их в блюдах покрытием. Это может привести к неэффективному дифференцировки нейронов в районах с низкой плотностью (рис. 2Е). Мы уже ввели процедуру посева четырехдневных старые маленькие нейросферы (рис. 1b), чтобы обеспечить контакты между дифферентин нейроны (рис. 1в). Кроме того, дифференциация добавка (Stem Cell Technologies) заменяется B27 добавки (Invitrogen), через 4-5 дней после посева. Нынешний метод дает 80-90% нейронов последовательно. Эти нейроны с обширной сетью процессов может поддерживаться в культуре в течение 2-3 месяцев, явное преимущество перед нейронной модели в результате дифференциации линий клеток нейробластомы человека. Иммуноокрашивание течение нескольких нейронных маркеров, включая NeuN, synapsin, ацетилхолинэстеразы, синаптофизина и GAP43 наблюдались с дифференцированными НПС (рис. 3). STAT3 и GFAP, маркеры астроцитов были также обнаружены в небольшой популяции клеток. При увеличении концентрации ретиноевой кислоты до 2-5 мкм, население астроцитов может быть дополнительно уменьшено. Тем не менее, такие культуры не может поддерживаться в течение длительного срока, потому что глиальные клетки поддерживают выживание нейронов путем секреции факторов роста. Мы заметили, что этоЖелательно, чтобы увеличить концентрацию ретиноевой 3-5 дней перед проведением экспериментов.

Неоднородный характер дифференцированных нейронов создает проблемы с точки зрения определения клеток определенного типа экспрессии генов профилирования. Таким образом, мы оптимизировали условия для LCM культивируемых нейронов (рис. 4). В текущем исследовании, мы дифференцированы НПС на слайдах с ручкой мембранных вставками и выполняемой LCM потому эта техника представлена ​​трудности с нейронами, культивируемые на регулярных клеточных культур блюд, поскольку они прочно прикреплены. Хотя цели LCM могут быть удовлетворены путем иммуногистохимического анализа, НОК имеет ряд преимуществ, включая возможность усиления сигнала на уровне РНК, выполнять мультиплекс анализ и точная количественного. В сочетании с микрочипом, НОК позволяет анализировать экспрессии тысяч генов в отдельных типов клеток 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявить.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом заслуги обзору (NEUD-004-07F) из делам ветеранов (в СП).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neuroprogenitor cells (NPCs) Lonza PT-2599
Neurocult NS-A human basal medium Stem cell technology 5750
Neurocult NS-A Proliferation supplement Stem cell technology 5753
Neurocult NS-A Differentiation supplement Stem cell technology 5754
B-27 Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Human epidermal growth factor Stem cell technology 2633
Fibroblast growth factor Sigma F0291
Brain Derived Neurotrophic Factor Cell signaling 3897S
Nerve Growth Factor Invitrogen 13257-019
Dibutyryl cyclic AMP Sigma D-0627
poly-L-lysine Sigma P-5899
Mouse laminin Sigma L-2020
Retinoic acid Sigma R-2625
STAT3 antibody Cell signaling 9132
GFAP antibody Cell signaling 3670
GAP43 antibody Transduction laboratories 612262
BDNF antibody Millipore AB1534SP
Acetyl cholinesterase antibody Santz cruz Sc-11409
Synaptophysin antibody Abcam ab18008-50
NeuN antibody Chemicon MAB377
Synapsin antibody Novus NB300-104
Anti mouse FITC Jackson Immuno 115-095-146
Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3 Jackson Immuno 711-165-152
Research Laboratories
BSA Sigma A1653
Triton-X 100 Acros 21568-2500
Paraformaldehye Fisher 4042
Coverslip (Big circle cover slip) Fisherbrand 12-545-102
Mounting medium (Prolong Gold) Invitrogen P36930
Pen membrane Applied biosystems LCM0521
Histogene LCM frozen section staining kit Applied biosystems KIT0401
RiboAmp RNA Amplification kit Applied biosystems KIT0201
Picopure RNA Isolation kit Applied biosystems KIT0202
CapsureMacro LCM caps Applied biosystems LCM0211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
  2. Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
  3. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
  4. Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
  5. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
  6. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  7. Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
  8. Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
  9. Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
  11. Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
  12. Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
  13. Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
  14. Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
  15. Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics