Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine
Neuroscience

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Summary

Cellules neuroprogenitor humaines (CNP) ont été élargis dans des conditions de prolifération. NPC ont été différenciées en cultures de neurones riches en présence d'une combinaison de neurotrophines. Marqueurs neuronaux ont été détectés par immunofluorescence. Pour isoler une population pure de neurones, les PNJ ont été différenciés sur des lames de membrane PEN et microdissection laser a été effectuée.

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Bouchard, R., Chong, T., Pugazhenthi, S. Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture. J. Vis. Exp. (79), e50487, doi:10.3791/50487 (2013).

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Abstract

cellules Neuroprogenitor (PNJ) isolés du cerveau fœtal humain ont été développés dans des conditions de prolifération en présence de facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) de fournir une offre abondante de cellules. NPC ont été différenciées en présence d'une nouvelle combinaison de facteur de croissance nerveuse (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le dibutyryl cAMP (DBC) et de l'acide rétinoïque sur des boîtes revêtues de poly-L-lysine et de laminine de souris pour obtenir neurone riches cultures. NPC ont également été différenciés en l'absence de neurotrophines, DBC et l'acide rétinoïque et en présence de facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) pour produire des cultures d'astrocytes riches. PNJ différenciés ont été caractérisées par immunofluorescence pour un panel de marqueurs neuronaux dont NeuN, synapsine, l'acétylcholinestérase, synaptophysine et GAP43. Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et STAT3, marqueurs d'astrocytes, ont été détectés dans 10-15% des PNJ différenciées. Pour faciliterCaractérisation moléculaire spécifique de type cellulaire, microdissection par capture laser a été réalisée pour isoler des neurones en culture sur le polyéthylène naphtalate (PEN) coulisse de la membrane. Les méthodes décrites dans cette étude constituent des outils précieux pour faire avancer notre compréhension du mécanisme moléculaire de la neurodégénérescence.

Introduction

Long de la vie neurogénèse est connu pour se produire dans la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et dans la couche sous-granulaire du gyrus denté de l'adulte cerveau des mammifères 1. cellules Neuroprogenitor (PNJ) qui proviennent de ces régions sont des cellules multipotentes qui peuvent se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes 2. PNJ ont suscité un intérêt en raison de leur potentiel à être transplantés chez des patients atteints de divers troubles neurodégénératifs, y compris la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, accidents vasculaires cérébraux et la maladie (AD) 3 d'Alzheimer. Des études avec des PNJ ont généralement porté sur cet angle de la transplantation mais le potentiel de neurones NPC dérivés comme un modèle de culture cellulaire afin de déterminer le mécanisme de neurodégénérescence n'a pas été pleinement exploité. Des études antérieures ont généralement utilisé des neurones post-mitotiques, isolé à partir de tissus de cerveau de rongeur qui doivent être isolés pour chaque expérience comme ils ne sont pasauto-renouvellement. Bien que des lignées de cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y, y compris les cellules et SK-N-MC peuvent être étendus, ils n'ont pas les caractéristiques des neurones primaires. PNJ humains, d'autre part, offrent des avantages car ils peuvent être développées pour de multiples passages et peuvent être différenciées pour générer une population de cellules avec des caractéristiques de neurones primaires 4,5. Dans la présente étude, nous décrivons un nouveau protocole de différenciation pour obtenir une population de neurones riches en uniforme de PNJ disponibles dans le commerce isolées de cerveau fœtal humain. Parce que ces cultures ne contiennent un petit pour cent des cellules gliales, nous avons besoin d'autres méthodes pour isoler une population pure de neurones pour la caractérisation moléculaire. microdissection par capture laser (LCM) est une nouvelle technique par laquelle une population homogène de cellules provenant d'une section de tissu peut être capturé de manière sélective pour l'analyse de l'expression du gène 6. Le cerveau est un tissu hétérogène constitué par les neurones, des cellules gliales et des cellules d'autres types. LCM a été utilisée pour déterminer l'expression génique spécifique des neurones analyses 7-10. Nous avons déjà effectué LCM de neurones de l'hippocampe de AD (Tg2576) des coupes de cerveau de souris pour montrer diminution de l'expression de la protéine de liaison cyclique élément de réponse AMP (CREB) et BDNF spécifiquement dans les neurones hippocampiques 11. Dans la présente étude, nous décrivons les procédures pour l'expansion des PNJ humains, la différenciation neuronale, immunofluorescence pour marqueurs neuronaux et LCM pour l'isolement des neurones cultivés sur des lames de membrane PEN.

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Protocol

Une. Expansion des PNJ humaines (Figure 1)

  1. Renouer avec le stock congelé de PNJ humains de cerveau fœtal (Lonza, Walkersville, MD, USA) et de la culture leur en suspension dans flacons T-75 que neurosphères (figure 1A) en milieu neurobasal contenant des suppléments de prolifération, l'EGF (10 ng / ml) et FGF (10 ng / ml).
  2. Après 3 jours de culture, les neurosphères transférer à un tube de 15 ml et centrifuger à 500 rpm pendant 5 min.
  3. Jeter le surnageant laissant derrière lui ~ 100 ul de milieu au-dessus du culot de cellules et les transférer dans un tube Eppendorf. Un culot cellulaire 100 pi est assez de se scinder en deux T-75 flacons. Si moins, réduire le nombre de flacons que les cellules neuroprogenitor incapables de proliférer si diviser mince.
  4. On triture le culot avec un embout de 200 ul 50x tout en maintenant la pointe de 200 pi par rapport au fond du tube. Divisez la suspension cellulaire aussi en deux parties et les ajouter à 2 T-75 flacons (1-2 split), un pour la poursuitel'expansion et l'autre pour la différenciation.
  5. Continuer la culture des cellules neuroprogenitor d'expansion (premier flacon) en changeant le milieu tous les 4-5 jours jusqu'à ce que les neurosphères atteignent leur taille originale de 300 à 500 um. Changer le milieu par centrifugation (500 rpm, 5 min), jetez le support et ajouter un nouveau milieu.

2. Différenciation des PNJ humain dans une culture Neuron riche (Figure 2)

  1. Pour la différenciation des cellules dans un neuroprogenitor riche culture des neurones, placer une lamelle couvre-objet unique dans chaque puits d'une plaque à 24 puits et le manteau avec 100 ug / ml de poly-L-lysine en ajoutant 500 ul dans chaque puits. Incuber les boîtes pendant 30 minutes à température ambiante.
  2. Aspirer le-poly L-lysine solution et rincez la plaque avec de l'eau stérile.
  3. Ensuite, recouvrir les puits de la plaque avec 500 pi de 5 ug / ml de laminine de la souris et incuber pendant 30 min. Après incubation, laver les puits avec du PBS.
  4. 4 jours après splitting les cellules (étape 1.4), transférer les petites neurosphères dans le flacon étiqueté «pour la différenciation» dans les boîtes revêtues à une densité de ~ 500 neurosphères par puits d'une plaque de 24 puits.
  5. Après 6 heures, lorsque les neurosphères attachent à plat, retirez le support de la prolifération et ajouter du milieu de différenciation consistant en milieu neurobasal, supplément B27, NGF (20 ng / ml), le BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), et l'acide rétinoïque (2 uM).

3. Immunofluorescence de PNJ différenciés (Figure 3)

  1. Suite à la culture de cellules dans un milieu de neuroprogenitor différenciation neuronale pendant deux semaines, une culture de neurones riche est obtenu. Rincer les neurones une fois dans du PBS, puis les fixer à 4% de paraformaldéhyde pendant 30 min. Une fois fixé, rincer les cellules trois fois avec du PBS.
  2. Incuber les cellules avec un tampon de perméabilisation (5% de BSA et 0,2% de Triton X-100 dans du PBS) à température ambiante pendant 60 min.
  3. Incuber les boîtes O / N à 4 ° C ina shaker avec la combinaison suivante d'anticorps polyclonaux et monoclonaux dans 3% de BSA dans du PBS: NeuN (1:250) et synapsine (1:250); acétylcholinestérase (1:500) et la synaptophysine (1:250); BDNF (1 : 500) et GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) et GFAP (1:1000).
  4. Laver trois fois les lamelles couvre-objet avec du PBS, puis de les incuber avec des anticorps anti-lapin-Cy3 et des anticorps secondaires anti-souris-FITC à la température ambiante dans l'obscurité pendant 90 min. Après l'incubation, les lamelles laver trois fois avec du PBS.
  5. Placer 10 ul de milieu de montage sur une lame de verre, prendre la lamelle de la boîte de culture avec une pince, et placez-le à l'envers sur le support de montage. Doucement, essuyer tout support de montage excès et sceller les bords avec du vernis à ongles.
  6. Examiner les neurones immunocolorées dans un microscope à fluorescence.

4. Microdissection laser de neurones (Figure 4)

  1. Différencier les PNJ dans une culture de neurones riches sur PEN lame de membranes recouvertes de poly-L-lysine et de laminine de souris en suivant les procédures décrites pour la figure 2.
  2. Effectuez toutes les étapes ultérieures dans des conditions RNAse-libres.
  3. Colorer les cultures en utilisant HistoGene Stain (Arcturus) pour visualiser les cellules.
  4. Trouver les zones de populations neuronales purs dépourvus des astrocytes en utilisant l'image de feuille de route de la diapositive entière avec le système Veritas LCM. Marquez les neurones en utilisant les outils de dessin.
  5. Effectuer capture laser de ces zones à l'aide de précision contrôlé par ordinateur et d'automatisation d'un processus en deux étapes. Tout d'abord, IR (infrarouge) est tiré à plusieurs endroits avec un réglage de la puissance du laser de 70 mW et une impulsion de 2500 microsecondes pour obtenir la membrane joindre à la capsule. Ensuite, la zone marquée est excisée à l'aide d'un outil de coupe UV à un réglage bas de niveau de 10 mV.
  6. Combinaison de ces procédés capture sélectivement les zones marquées de la membrane PEN sur CapSure LCM macro bouchons. Lorsque le capuchon est levé, la membrane avec le neurons adhère à la capsule.
  7. Isoler l'ARN total à partir d'échantillons LCM en utilisant un kit d'isolement PicoPure ARN (Arcturus) et traiter avec de la DNase.
  8. Amplifier l'ARN isolé en utilisant le kit d'amplification RiboAMP ARN en suivant les instructions du kit.
  9. Effectuer l'analyse en temps réel RT-PCR utilisant des sondes TaqMan pour détecter neurofilaments humaine chaîne lourde (hNFHc).

Abréviations:

AD, la maladie d'Alzheimer; BDNF, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau; CREB, protéine de liaison à l'élément de réponse à l'AMP cyclique; DBC, dibutyryl AMP cyclique, l'EGF, le facteur de croissance épidermique; FGF, facteur de croissance fibroblastique, GFAP, protéine acide fibrillaire gliale, LCM, laser microdissection, NGF, facteur de croissance nerveuse; PNJ, neuroprogenitor cellule; PEN, polyéthylènenaphtalate.

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Representative Results

Expansion des PNJ (Figure 1)

Lorsque neurosphères sont décomposées à une suspension de cellules individuelles par la trituration, l'embout de pipette a besoin de toucher le fond du tube de sorte qu'il existe une certaine résistance lorsque la suspension est introduite à la pipette de haut en bas. Le nombre de fois de trituration varie entre les individus et doit être décidé par essais et erreurs en examinant la suspension cellulaire obtenue sous un microscope. Il est essentiel de fournir une densité suffisante de suspension cellulaire, car la prolifération sera à un rythme plus rapide lorsque les PNJ sont en contact étroit. Si CNP ne poussent pas, la densité cellulaire doit être augmenté en réduisant le nombre de flacons. Nous avons été en mesure d'étendre les neurosphères pour jusqu'à 10-15 passages. Ainsi l'offre abondante de PNJ humains peut être généré, en réduisant l'utilisation de tissu foetal humain. Pour l'alimentation continue des PNJ et des neurones, il est souhaitable de les développer d'abord pendant 3-4 passages et par la suite, La moitié des PNJ peut être étendu comme neurosphères et l'autre moitié peut être différencié selon les expériences en cours. Alternativement, les PNJ peuvent être également élargi pour plus de passages, congelés dans l'azote liquide comme dans le cas de lignées cellulaires pour générer plus grande quantité des stocks, et relancé en cas de besoin. Il est également souhaitable de réaliser des expériences avec des neurones issus de différents lots de PNJ.

Neuronale différenciation des PNJ (Figure 2)

NPC sont des cellules multipotentes et peuvent être différenciées en neurones, astrocytes ou oligodendrocytes, selon les conditions de culture. Notre protocole de différenciation impliqué ensemencement de 4 jours anciens neurosphères dans les plats revêtus (figure 2A). Nous avons observé qu'il est essentiel de semer une densité suffisante de neurosphères de sorte que les neurones de différenciation réparties autour et forment un réseau dense de processus neuronaux. Images après 1 (figure 2B) et 4 jours (figureure 2C) de l'ensemencement sont présentées. des cultures de neurones riche rendement de 80 à 90% des neurones et des astrocytes de 10 à 15%, ont été obtenus après différenciation des NPC, en présence d'une combinaison de NGF, BDNF, DBC et l'acide rétinoïque pendant deux semaines (Figure 2D). Au meilleur de notre connaissance, le protocole décrit dans l'étude de la différenciation neuronale n'a pas été rapportée précédemment par d'autres. Dans les zones de faible densité, PNJ différenciés en astrocytes (figure 2E). Pour obtenir une culture d'astrocytes riches, NPC peuvent être cultivées en présence de CNTF (10 ng / ml) et en l'absence de NGF, BDNF, DBC et l'acide rétinoïque. Ainsi, la composition neurone-astrocyte peut être manipulé au cours de la différenciation en fonction de l'objectif de l'expérience.

Caractérisation des neurones différenciés (Figure 3)

Pour caractériser ces PNJ différenciés, nous avons effectué deux immunologique des marqueurs neuronaux wvec des anticorps polyclonaux et monoclonaux, suivie d'une exposition à lapin et de souris Anticorps secondaires liés à Cy3 (rouge) et FITC (vert), respectivement. Les marqueurs neuronaux suivantes ont été détectées: Figure 3A:. NeuN et synapsine figure 3B:. Acétyl cholinestérase (Ache) et synaptophysine figure 3C: BDNF et GAP43. Ainsi, les PNJ différenciées présentent les caractéristiques de neurones primaires. En outre, les marqueurs d'astrocytes GFAP et STAT3 ont été détectés dans une petite population de cellules (Figure 3A). Par conséquent, des méthodes supplémentaires sont nécessaires pour l'analyse de l'expression génique spécifique des neurones.

Microdissection laser (LCM) de neurones (Figure 4)

Bien LCM peut être utilisé pour l'isolement de cellules à partir d'une boîte de culture, nos premières tentatives de LCM avec les neurones défaillants parce qu'ils sont fermement attachés aux plats revêtus. Pour surmonter ce problème, nous avons différencié les PNJ on diapositives avec des inserts de membrane PEN recouvertes de poly-L-lysine et de laminine de souris. La lame a été placée dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm (Figure 4A). Les dispositions de la glissière de membrane PEN et bouchons de LCM sont présentés dans la figure 4B. Les cultures ont été colorées avec HistoGen tache (Arcturus) pour visualiser les cellules (figure 4C). La lame a été placée dans le microscope dans l'instrument Arcturus Veritas. Les neurones à être capturés ont été marqués avec des outils de dessin (figure 4D). CapSure SH Caps ont été placés sur la membrane PEN. En utilisant une combinaison de la découpe au laser UV et IR capture laser, les zones marquées ont été recueillies sur le capuchon. Les neurones prises sont affichées sur le bouchon au bas (figure 4F) et élevé (figure 4F) grossissement.

Figure 1
Figure 1.Expansion des PNJ humains. A. NPC ont été cultivées en suspension dans des flacons T75 dans des neurosphères. B. Lorsque les neurosphères ont atteint la taille de 300 à 500 pm, ils ont été transférés à des tubes 15 ml et centrifugé à 1000 RPM pendant 5 min. C. Le surnageant est écarté et le culot cellulaire dans 200 pi de milieu a été transféré dans des tubes Eppendorf et trituré. D. Neurosphères prêt à être scindé sont présentées. E. neurosphères brisée, après trituration sont présentés.

Figure 2
Figure 2. Différenciation des PNJ humains. A. Neurosphères ont été brisées par la trituration et la culture pendant quatre jours pour générer de nouvelles neurosphères. B. Quatre neurosphères d'un jour ont été ensemencées dans des boîtes recouvertes de poly-L-lysine et la laminine de la souris. C. Differentiation des PNJ a été observée en présence de NGF, BDNF, DBC et l'acide rétinoïque en trois jours après le semis. culture D. Neuron riche a été obtenu après deux semaines. E. PNJ différenciée en astrocytes dans les zones de faible densité. F. PNJ dissociés dans une culture d'astrocytes riches en présence de CNTF (10 ng / ml) et en l'absence de NGF, BDNF, DBC et l'acide rétinoïque.

Figure 3
Figure 3. Neuronale et des marqueurs d'astrocytes dans PNJ humains différenciés. PNJ différenciée pour deux semaines ont été fixées et double immunocolorées pour objectifs indiqués avec anticorps monoclonaux et polyclonaux, suivi par l'exposition à lapin et de souris des anticorps secondaires liés à Cy3 (rouge) et FITC (vert) respectivement. Les marqueurs neuronaux suivantes ont été détectées: A. NeuN et synapsine.B. acétyl cholinestérase (AChE) et la synaptophysine. C. BDNF et GAP43. En outre, les marqueurs d'astrocytes suivants ont été détectés: D. STAT3 et GFAP.

Figure 4
Figure 4. microdissection par capture laser de neurones. A. NPC ont été différenciées sur une lame de membrane PEN recouvertes de poly L lysine et de laminine de souris. La lame a été placée dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm. B. Les modalités de PEN coulisseau de membrane et le capuchon de LCM dans l'instrument Arcturus Veritas sont présentés. C. Les cultures ont été colorées avec HistoGen tache (Arcturus) pour visualiser les cellules. D. L' neurones à être capturés ont été marqués avec des outils de dessin. Les neurones prises sont affichées sur le bouchon au bas (E) et haute (F) magnition. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Nous décrivons dans la présente étude, un modèle de culture cellulaire neurone-riche par différenciation de cellules humaines neuroprogenitor auto-renouvellement et une méthode pour isoler une population pure de neurones par microdissection par capture laser. Nous avons utilisé une combinaison de NGF, BDNF, DBC et l'acide rétinoïque pour la différenciation neuronale des PNJ. DBC est utilisé pour activer CREB, un facteur de transcription qui augmente la neurogénèse 12. L'acide rétinoïque induit la sortie du cycle cellulaire et la réduction de la population gliale 13. La méthode décrite dans cette étude intègre les modifications sur notre précédent rapport 14. Nous avions précédemment utilisé l'étape de trituration des neurosphères à une suspension cellulaire unique et l'ensemencement dans des boîtes recouvertes ensuite. Cela peut conduire à la différenciation neuronale inefficace dans les zones de faible densité (Figure 2E). Nous avons maintenant mis en place la procédure de semis de quatre jours anciens petits neurosphères (figure 1B) assure le contact entre la différenciationneurones Ting (figure 1C). En outre, le supplément de différenciation (Stem Cell Technologies) est remplacé avec supplément de B27 (Invitrogen), 4-5 jours après le semis. La méthode actuelle donne 80-90% neurones constamment. Ces neurones avec un réseau étendu de processus peuvent être maintenues en culture pendant 2 à 3 mois, un avantage distinct par rapport au modèle neuronal résultant de la différenciation de lignées cellulaires de neuroblastome humain. Immunocoloration pour plusieurs marqueurs neuronaux dont NeuN, synapsine, l'acétylcholinestérase, synaptophysine et GAP43 ont été observés avec les PNJ différenciées (figure 3). STAT3 et GFAP, marqueurs d'astrocytes ont également été détectés dans une petite population de cellules. En augmentant la concentration de l'acide rétinoïque à 5.2 uM, la population d'astrocytes peut encore être réduite. Cependant, de telles cultures ne peuvent pas être maintenues pendant une longue durée, car les cellules gliales soutiennent la survie neuronale par la sécrétion de facteurs de croissance. Nous avons observé qu'il étaitest souhaitable d'augmenter la concentration rétinoïque 3-5 jours avant d'effectuer les expériences.

La nature hétérogène des neurones différenciés présente des défis en termes de détermination type de cellule spécifique profils d'expression génique. Par conséquent, nous avons optimisé les conditions de LCM de neurones en culture (figure 4). Dans la présente étude, nous avons différencié les PNJ sur des lames avec des inserts de la membrane PEN et LCM effectuée car cette technique présentait des difficultés avec des neurones en culture sur des plats réguliers de culture cellulaire comme ils sont fermement attachés. Bien que les objectifs de LCM peuvent être satisfaits par l'analyse immunohistochimique, LCM offre plusieurs avantages, notamment la capacité d'amplifier le signal au niveau de l'ARN, effectuer une analyse multiplex, et une quantification précise. Lorsqu'il est combiné avec puces à ADN, LCM permet l'analyse de l'expression de milliers de gènes dans des types de cellules sélectionnées 15.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l'examen du mérite subvention (NEUD-004-07F) de l'Administration des anciens combattants (SP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neuroprogenitor cells (NPCs) Lonza PT-2599
Neurocult NS-A human basal medium Stem cell technology 5750
Neurocult NS-A Proliferation supplement Stem cell technology 5753
Neurocult NS-A Differentiation supplement Stem cell technology 5754
B-27 Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Human epidermal growth factor Stem cell technology 2633
Fibroblast growth factor Sigma F0291
Brain Derived Neurotrophic Factor Cell signaling 3897S
Nerve Growth Factor Invitrogen 13257-019
Dibutyryl cyclic AMP Sigma D-0627
poly-L-lysine Sigma P-5899
Mouse laminin Sigma L-2020
Retinoic acid Sigma R-2625
STAT3 antibody Cell signaling 9132
GFAP antibody Cell signaling 3670
GAP43 antibody Transduction laboratories 612262
BDNF antibody Millipore AB1534SP
Acetyl cholinesterase antibody Santz cruz Sc-11409
Synaptophysin antibody Abcam ab18008-50
NeuN antibody Chemicon MAB377
Synapsin antibody Novus NB300-104
Anti mouse FITC Jackson Immuno 115-095-146
Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3 Jackson Immuno 711-165-152
Research Laboratories
BSA Sigma A1653
Triton-X 100 Acros 21568-2500
Paraformaldehye Fisher 4042
Coverslip (Big circle cover slip) Fisherbrand 12-545-102
Mounting medium (Prolong Gold) Invitrogen P36930
Pen membrane Applied biosystems LCM0521
Histogene LCM frozen section staining kit Applied biosystems KIT0401
RiboAmp RNA Amplification kit Applied biosystems KIT0201
Picopure RNA Isolation kit Applied biosystems KIT0202
CapsureMacro LCM caps Applied biosystems LCM0211

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References

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