Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine
Neuroscience

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Summary

Cellule neuroprogenitor umane (NPC) sono stati ampliati in condizioni proliferanti. NPC sono stati differenziati in colture ricche di neuroni in presenza di una combinazione di neurotrofine. Marcatori neuronali sono state rilevate mediante immunofluorescenza. Per isolare una popolazione pura di neuroni, NPC sono stati differenziati sulla penna scivoli di membrana e cattura microdissezione laser è stata eseguita.

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Bouchard, R., Chong, T., Pugazhenthi, S. Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture. J. Vis. Exp. (79), e50487, doi:10.3791/50487 (2013).

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Abstract

Cellule Neuroprogenitor (NPC) isolati dal cervello fetale umano sono stati espansi in condizioni proliferative in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) per fornire un rifornimento abbondante di cellule. NPC sono state differenziate in presenza di una nuova combinazione di fattore di crescita nervosa (NGF), cervello-derivato fattore neurotrofico (BDNF), dibutirril cAMP (DBC) e acido retinoico su piatti rivestito con poli-L-lisina e mouse laminina per ottenere neurone -ricche culture. NPC sono stati differenziati anche in assenza di neurotrofine, DBC e acido retinoico e in presenza di fattore neurotrofico ciliare (CNTF) per produrre colture ricche di astrociti. NPC dissociati sono stati caratterizzati da immunofluorescenza per un pannello di marcatori neuronali tra cui NeuN, synapsin, acetilcolinesterasi, synaptophysin e GAP43. Proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) e STAT3, marcatori astrociti, sono stati rilevati nel 10-15% dei NPC differenziati. Per facilitaretipo cellulare caratterizzazione molecolare specifico, cattura microdissezione laser è stata eseguita per isolare neuroni coltivati ​​su polietilennaftalato (PEN) scorre membrana. I metodi descritti in questo studio forniscono strumenti preziosi per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari della neurodegenerazione.

Introduction

Vita lunga neurogenesi si verifica nella zona subventricular dei ventricoli laterali e nello strato subgranulare del giro dentato dell'adulto cervello dei mammiferi 1. Cellule Neuroprogenitor (NPC) che provengono da queste regioni sono cellule multipotenti che possono differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti 2. NPC hanno generato interesse a causa del loro potenziale per essere trapiantate nei pazienti affetti da varie patologie neurodegenerative tra cui il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, ictus e malattie (AD) 3 di Alzheimer. Studi con NPC sono generalmente concentrati su questo angolo trapianto ma il potenziale di neuroni NPC-derivati ​​come modello di coltura cellulare per determinare il meccanismo di neurodegenerazione non è stato sfruttato appieno. Studi precedenti hanno generalmente utilizzato neuroni post-mitotici isolate da tessuti cerebrali roditore che devono essere isolati per ogni esperimento in quanto non sonoauto-rigenerante. Anche se le linee di cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y compreso e le cellule SK-N-MC può essere ampliato, non hanno le caratteristiche di neuroni primari. NPC umani, invece, offrono vantaggi sia perché possono essere espansi per passaggi multipli e possono essere differenziate per generare una popolazione di cellule con le caratteristiche di neuroni primari 4,5. In questo studio, descriviamo un nuovo protocollo di differenziazione per ottenere una popolazione ricca di neuroni coerente da NPC disponibili in commercio isolati da cervello fetale umano. Poiché queste culture contengono una piccola percentuale di cellule gliali, dobbiamo metodi aggiuntivi per isolare una popolazione pura di neuroni per la caratterizzazione molecolare. Microdissezione laser (LCM) è un romanzo tecnica mediante la quale una popolazione omogenea di cellule da una sezione di tessuto può essere selettivamente catturato per analisi di espressione genica 6. Il cervello è un tessuto eterogeneo costituito da neuroni, glia e altri ty cellapes. LCM è stato usato per determinare l'espressione genica specifica del neurone analisi 7-10. Abbiamo già effettuato LCM di neuroni dell'ippocampo da AD (Tg2576) sezioni di cervello del mouse per visualizzare diminuita espressione di ciclico elemento di risposta AMP binding protein (CREB) e BDNF specificamente in neuroni dell'ippocampo 11. Nel presente studio, si descrivono le procedure per l'espansione della NPC umani, la differenziazione neuronale, immunofluorescenza per i marcatori neuronali e LCM per l'isolamento dei neuroni coltivati ​​su PENNA diapositive membrana.

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Protocol

1. Ampliamento della NPC umani (Figura 1)

  1. Revive lo stock congelati di NPC umani da cervello fetale (Lonza, Walkersville, MD, USA) e la cultura in sospensione in T-75 palloni come neurosfere (Figura 1A) in mezzo Neurobasal contenenti integratori proliferazione, EGF (10 ng / ml) e FGF (10 ng / ml).
  2. Dopo 3 giorni di coltura, trasferire le neurosfere una provetta da 15 ml e centrifugare a 500 rpm per 5 min.
  3. Eliminare il supernatante lasciando dietro ~ 100 microlitri di media sopra il pellet cellulare e trasferire in una provetta Eppendorf. Un pellet 100 microlitri di cellule è sufficiente per dividere in 2 T-75 palloni. Se meno, ridurre il numero di flaconi come cellule neuroprogenitor non riescono a proliferare se dividere sottile.
  4. Triturare il pellet con un microlitri punta 50x 200 mantenendo la punta 200 microlitri contro il fondo della provetta. Dividere la sospensione cellulare equamente in due parti e aggiungerli a 2 T-75 palloni (1-2 split), uno per continuareespansione e un altro per la differenziazione.
  5. Continuare la coltura delle cellule neuroprogenitor per l'espansione (primo pallone) cambiando il mezzo ogni 4-5 giorni fino a quando le neurosfere raggiungono la loro dimensione originale di 300-500 micron. Cambiare mezzo mediante centrifugazione (500 rpm; 5 min), scartare il vecchio medio e aggiungere nuovo mezzo.

2. Differenziazione dei NPC umano in un Neuron ricco Cultura (Figura 2)

  1. Per differenziazione delle cellule neuroprogenitor in una ricca cultura neurone, posizionare un singolo coprioggetto in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e cappotto con 100 ug / ml di poli-L-lisina aggiungendo 500 microlitri in ciascun pozzetto. Incubare i piatti per 30 minuti a RT.
  2. Aspirare la soluzione di poli-L-lisina e lavare la piastra con acqua sterile.
  3. Successivamente, cappotto pozzetti della piastra con 500 ml di 5 mcg / ml del mouse la laminina e incubare per 30 min. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti con PBS.
  4. 4 giorni dopo splitting le cellule (fase 1.4), trasferire i piccoli neurosfere nel pallone dicitura «differenziazione 'nei piatti rivestiti con una densità di ~ 500 neurosfere per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
  5. Dopo 6 ore, quando le neurosfere attribuiscono al piatto, rimuovere il terreno proliferazione e differenziazione aggiungere mezzo costituito da mezzo Neurobasal, B27 supplemento, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), e acido retinoico (2 mM).

3. Immunofluorescenza di dissociati NPC (Figura 3)

  1. Seguendo coltura di cellule neuroprogenitor in terreno di differenziamento neuronale per due settimane, si ottiene una ricca cultura-neurone. Risciacquare i neuroni una volta in PBS e poi fissare in paraformaldeide al 4% per 30 min. Una volta fissato, lavare le cellule tre volte con PBS.
  2. Incubare le cellule con tampone permeabilizzazione (5% BSA e 0,2% Triton X-100 in PBS) a temperatura ambiente per 60 min.
  3. Incubare le stoviglie O / N a 4 ° C ina shaker con la seguente combinazione di anticorpi policlonali e monoclonali nel 3% BSA in PBS: NeuN (1:250) e synapsin (1:250); acetil colinesterasi (1:500) e synaptophysin (1:250); BDNF (1 : 500) e GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) e GFAP (1:1.000).
  4. Lavare i coprioggetti tre volte con PBS e poi incubare con anti-coniglio-Cy3 e anticorpi secondari anti-topo-FITC a RT al buio per 90 min. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini tre volte con PBS.
  5. Mettere 10 ml di mezzo di montaggio su un vetrino, estrarre il vetrino dalla piastra di coltura con una pinza, e metterlo a testa in giù sul supporto di montaggio. Delicatamente, spazzare via qualsiasi mezzo di montaggio in eccesso e sigillare i bordi con smalto.
  6. Esaminare i neuroni immunostained in un microscopio a fluorescenza.

4. Microdissezione laser di neuroni (Figura 4)

  1. Differenziare NPC in una cultura ricca di neuroni su PEN membrana diapositivas rivestite con poli-L-lisina e mouse laminina seguendo le procedure descritte per la Figura 2.
  2. Eseguire tutti i passaggi successivi in ​​condizioni di RNasi-free.
  3. Macchiare le culture usando HistoGene Stain (Arcturus) per visualizzare le cellule.
  4. Trova le aree di popolazioni neuronali pure privi di astrociti utilizzando la mappa stradale immagine di tutto il vetrino con il sistema Veritas LCM. Marcare i neuroni utilizzando gli strumenti di disegno.
  5. Eseguire cattura laser di queste zone con precisione controllato da computer e automazione in un processo a due fasi. In primo luogo, IR (a raggi infrarossi) è sparato in più punti con un livello di potenza del laser di 70 mW e un impulso di 2.500 psec per ottenere la membrana allegare al tappo. Successivamente, la zona evidenziata viene asportato con un utensile da taglio UV a un livello basso livello di 10 mV.
  6. La combinazione di questi processi cattura selettivamente le aree contrassegnate dalla membrana PEN su CapSure LCM caps macro. Quando il tappo viene sollevato, la membrana con il neurons aderisce al cap.
  7. Isolare RNA totale da campioni LCM utilizzando un kit di isolamento PicoPure RNA (Arturo) e trattare con DNasi.
  8. Amplificare l'RNA isolato usando il kit di amplificazione RiboAMP RNA seguendo le istruzioni del kit.
  9. Eseguire in tempo reale RT-PCR usando sonde TaqMan per rilevare neurofilament umana catena pesante (hNFHc).

Abbreviazioni:

DC, il morbo di Alzheimer; BDNF, fattore neurotrofico cervello-derivato, CREB, ciclico elemento di risposta AMP proteina legante, DBC, dibutirril AMP ciclico, EGF, fattore di crescita epidermico, FGF, fattore di crescita dei fibroblasti, GFAP, proteina acidica fibrillare gliale, LCM, laser cattura microdissezione, NGF, fattore di crescita nervosa, NPC, neuroprogenitor cellulare, PEN, polietilennaftalato.

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Representative Results

Ampliamento della NPC (Figura 1)

Quando neurosfere sono ripartiti per una singola sospensione cellulare da triturazione, la punta della pipetta deve toccare il fondo della provetta in modo che vi sia una certa resistenza quando la sospensione è pipettati su e giù. Il numero di volte di triturazione può variare tra individui e deve essere decisa per tentativi ed errori esaminando la sospensione cellulare risultante sotto un microscopio. È importante fornire sufficiente densità di sospensione cellulare in quanto la proliferazione sarà ad un tasso più veloce quando gli NPC venire a stretto contatto. Se NPC non crescono, la densità cellulare dovrebbe essere aumentato riducendo il numero di flaconi. Siamo stati in grado di espandere le neurosfere per un massimo di 10-15 passaggi. Così abbondante offerta di NPC umani può essere generato, riducendo l'uso di tessuti fetali umani. Per la continuità della fornitura di NPC e neuroni, è auspicabile estendere loro inizialmente per 3-4 passaggi e successivamente, La metà dei NPC può essere espansa come neurosfere e l'altra metà può essere differenziato per esperimenti in corso. In alternativa, NPC possono essere ampliati anche per più passaggi, congelati in azoto liquido come nel caso di linee cellulari per generare maggiore offerta di scorte e rivivere quando necessario. È inoltre auspicabile per effettuare esperimenti con i neuroni derivati ​​da diversi lotti di NPC.

Neuronale differenziazione di NPC (figura 2)

NPC sono cellule multipotenti e possono essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti a seconda delle condizioni di coltura. Il nostro protocollo di differenziazione coinvolto semina di 4 giorni vecchi neurosfere in piatti rivestiti (Figura 2A). Abbiamo osservato che è essenziale per seminare sufficiente densità di neurosfere in modo che i neuroni che differenziano sparsi e formano una fitta rete di processi neuronali. Immagini dopo 1 (Figura 2B) e 4 giorni (Figure 2C), della semina sono mostrati. Culture ricchi di neuroni rendimento 80-90% neuroni e astrociti 10-15%, sono stati ottenuti dopo la differenziazione di NPC in presenza di una combinazione di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico per due settimane (Figura 2D). Per quanto a nostra conoscenza, il protocollo descritto in questo studio per la differenziazione neuronale non è stato riportato in precedenza da altri. Nelle aree a bassa densità, PNG differenziate in astrociti (Figura 2E). Per ottenere una cultura ricca di astrociti, NPC possono essere coltivate in presenza di CNTF (10 ng / ml) e in assenza di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico. Così la composizione neurone-astrociti può essere manipolato durante la differenziazione a seconda dell'obiettivo dell'esperimento.

Caratterizzazione di differenziata neuroni (Figura 3)

Per caratterizzare ulteriormente questi NPC differenziati, abbiamo effettuato doppia immunoistochimica di marcatori neuronali with anticorpi policlonali e monoclonali, seguiti da esposizione ad anticorpi secondari coniglio e di topo legati alla Cy3 (rosso) e FITC (verde), rispettivamente. Sono stati rilevati i seguenti marcatori neuronali: Figura 3A:. NeuN e synapsin figura 3B:. Acetil colinesterasi (Ache) e synaptophysin Figura 3C: BDNF e GAP43. Così, gli NPC differenziate hanno le caratteristiche di neuroni primari. Inoltre, marcatori astrociti STAT3 e GFAP sono stati rilevati in una piccola frazione di cellule (Figura 3A). Pertanto metodi aggiuntivi sono necessari per l'analisi di espressione genica specifica del neurone.

Microdissection Capture laser (LCM) di neuroni (Figura 4)

Anche se LCM può essere utilizzato per l'isolamento di cellule da un piatto di coltura, i nostri tentativi iniziali di LCM con i neuroni falliti perché sono saldamente attaccati ai piatti rivestiti. Per superare questo problema, abbiamo differenziato NPC on diapositive con inserti di membrana PEN rivestiti con poli-L-lisina e mouse laminina. Il vetrino è stato posto in un piatto di coltura cellulare 100 mm (Figura 4A). Le disposizioni della membrana vetrino PEN e le protezioni di LCM sono mostrati in figura 4B. Le colture sono state colorate con HistoGen macchia (Arcturus) per visualizzare le cellule (Figura 4C). Il vetrino è stato posto al microscopio nello strumento Arcturus Veritas. I neuroni di essere catturati sono stati marcati con strumenti di disegno (Figura 4D). Caps CapSure HS sono stati collocati sulla membrana PEN. Utilizzando una combinazione di taglio laser UV e IR laser capture, aree delimitate stati raccolti sul cappuccio. I neuroni catturati vengono visualizzati sul tappo a basso (Figura 4F) e alta (Figura 4F) ingrandimento.

Figura 1
Figura 1.Ampliamento della NPC umani. A. NPC sono state coltivate in sospensione in fiasche T75 come neurosfere. B. Quando le neurosfere raggiunto le dimensioni di 300-500 micron, sono stati trasferiti a provette da 15 ml e centrifugato a 1000 rpm per 5 min. C. Il supernatante è stato scartato e il pellet cellulare in 200 microlitri di media è stato trasferito in provette Eppendorf e triturato. D. Neurosfere pronta per essere divisa sono mostrate. E. neurosfere rotti seguenti triturazione vengono visualizzati.

Figura 2
Figura 2. Differenziazione delle NPC umani. A. Neurosfere erano rotti da triturazione e coltivate per quattro giorni per generare nuovi neurosfere. B. Quattro neurosfere di un giorno sono state seminate in piatti rivestiti con poli-L-lisina e mouse laminina. C. Differentiazione della NPC è stato osservato in presenza di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico in tre giorni dopo la semina. D. Neuron-ricca cultura è stata ottenuta dopo due settimane. E. NPC differenziato in astrociti in aree a bassa densità. F. NPC differenziato in una cultura ricca di astrociti in presenza di CNTF (10 ng / ml) e in assenza di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico.

Figura 3
Figura 3. Neuronale e marcatori astrociti in PNG umani differenziati. NPC differenziato per due settimane sono stati fissati e doppia immunostained per gli obiettivi indicati con anticorpi policlonali e monoclonali, seguiti da esposizione ad anticorpi secondari coniglio e di topo legati alla Cy3 (rosso) e FITC (verde), rispettivamente. Sono stati rilevati i seguenti marcatori neuronali: A. NeuN e sinapsina.B. acetil colinesterasi (AChE) e synaptophysin. C. BDNF e GAP43. Inoltre, sono stati rilevati i seguenti marcatori astrociti: D. STAT3 e GFAP.

Figura 4
Figura 4. Microdissezione laser dei neuroni. A. NPC sono stati differenziati in una diapositiva membrana PEN rivestito con poli L lisina e mouse laminina. Lo scivolo è stato inserito all'interno di un piatto di coltura cellulare 100 millimetri. B. Le modalità del PEN membrana scorrevole e cappuccio LCM nello strumento Arcturus Veritas sono presenti. C. Le colture sono state colorate con HistoGen macchia (Arcturus) per visualizzare le cellule. D. neuroni ad essere catturati sono stati marcati con strumenti di disegno. I neuroni catturati vengono visualizzati sul tappo a bassa (E) e alta (F) Magnizione. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Descriviamo in questo studio un ricco di neurone modello di coltura cellulare per la differenziazione delle cellule autorinnovanti neuroprogenitor umani e un metodo per isolare una popolazione pura di neuroni cattura microdissezione laser. Abbiamo utilizzato una combinazione di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico per la differenziazione neuronale di NPC. DBC viene utilizzato per attivare CREB, un fattore di trascrizione che migliora neurogenesi 12. L'acido retinoico induce uscita dal ciclo cellulare e riduce la popolazione gliale 13. Il metodo descritto in questo studio comprende modifiche oltre il nostro precedente rapporto 14. Avevamo in precedenza usato la fase di triturazione delle neurosfere ad una sospensione singola cella e poi semina in piatti rivestiti. Questo può portare a inefficiente differenziazione neuronale in aree a bassa densità (Figura 2E). Abbiamo introdotto la procedura di semina quattro giorni vecchi piccoli neurosfere (Figura 1B) per garantire i contatti tra differenziazioneneuroni Ting (Figura 1C). Inoltre, il supplemento differenziazione (Stem Cell Technologies) è sostituito con supplemento B27 (Invitrogen), 4-5 giorni dopo la semina. Il metodo attuale produce 80-90% dei neuroni in modo coerente. Questi neuroni attraverso una fitta rete di processi possono essere mantenute in coltura per 2-3 mesi, un netto vantaggio rispetto al modello neuronale risultante dalla differenziazione delle linee cellulari di neuroblastoma umano. Immunostaining per diversi marcatori neuronali tra cui NeuN, synapsin, acetilcolinesterasi, synaptophysin e GAP43 sono stati osservati con gli NPC differenziate (Figura 3). STAT3 e GFAP, marker di astrociti sono state rilevate anche in una piccola popolazione di cellule. Aumentando la concentrazione di acido retinoico per 2-5 mM, la popolazione astrociti può essere ulteriormente ridotto. Tuttavia, tali colture non possono essere mantenute per un periodo lungo perché le cellule gliali supportano sopravvivenza neuronale attraverso la secrezione di fattori di crescita. Abbiamo osservato cheè desiderabile aumentare concentrazione retinoico 3-5 giorni prima di eseguire gli esperimenti.

La natura eterogenea dei neuroni differenziati presenta sfide in termini di determinazione cella-tipo specifico profilo di espressione genica. Pertanto, abbiamo ottimizzato le condizioni per LCM di neuroni in coltura (Figura 4). In questo studio, abbiamo differenziato NPC sui vetrini con inserti di membrana penna e LCM eseguito perché questa tecnica presenta difficoltà con i neuroni in coltura su normali piatti di coltura di cellule in quanto sono saldamente. Sebbene gli obiettivi del LCM possono essere soddisfatte mediante analisi immunoistochimica, LCM offre diversi vantaggi tra cui la capacità di amplificare il segnale a livello di RNA, effettuare analisi multiplex, e quantificazione accurata. Quando combinato con microarray, LCM permette l'analisi di espressione di migliaia di geni in tipi cellulari selezionati 15.

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Disclosures

Nessun conflitto di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione Merit Review (NEUD-004-07F) dal Veterans Administration (SP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neuroprogenitor cells (NPCs) Lonza PT-2599
Neurocult NS-A human basal medium Stem cell technology 5750
Neurocult NS-A Proliferation supplement Stem cell technology 5753
Neurocult NS-A Differentiation supplement Stem cell technology 5754
B-27 Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Human epidermal growth factor Stem cell technology 2633
Fibroblast growth factor Sigma F0291
Brain Derived Neurotrophic Factor Cell signaling 3897S
Nerve Growth Factor Invitrogen 13257-019
Dibutyryl cyclic AMP Sigma D-0627
poly-L-lysine Sigma P-5899
Mouse laminin Sigma L-2020
Retinoic acid Sigma R-2625
STAT3 antibody Cell signaling 9132
GFAP antibody Cell signaling 3670
GAP43 antibody Transduction laboratories 612262
BDNF antibody Millipore AB1534SP
Acetyl cholinesterase antibody Santz cruz Sc-11409
Synaptophysin antibody Abcam ab18008-50
NeuN antibody Chemicon MAB377
Synapsin antibody Novus NB300-104
Anti mouse FITC Jackson Immuno 115-095-146
Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3 Jackson Immuno 711-165-152
Research Laboratories
BSA Sigma A1653
Triton-X 100 Acros 21568-2500
Paraformaldehye Fisher 4042
Coverslip (Big circle cover slip) Fisherbrand 12-545-102
Mounting medium (Prolong Gold) Invitrogen P36930
Pen membrane Applied biosystems LCM0521
Histogene LCM frozen section staining kit Applied biosystems KIT0401
RiboAmp RNA Amplification kit Applied biosystems KIT0201
Picopure RNA Isolation kit Applied biosystems KIT0202
CapsureMacro LCM caps Applied biosystems LCM0211

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References

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