류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

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Biology

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Summary

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

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Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

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Abstract

류신 풍부 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2)는, 세린 - 트레오닌 키나아제 복잡한 단백질 도메인의 라스 (ROC), ROC 도메인 (COR)의 C-말단을 포함하여, 유사 도메인 조직을 나누어 paralogs 아르 류신이 풍부한 및 N-말단에 ankyrin 같이 반복. LRRK1 및 LRRK2의 정확한 세포의 역할은 LRRK2는 파킨슨 병 3,4의 병인에 관여하는 동안 그러나 LRRK1가, 1,2 신호 티로신 키나제 수용체에 연루되어, 설명 될 못하고있다. 이 보고서에서, 우리는 따라서 세포에있는이 두 단백질의 전체 인산화 수준을 측정 할 수있는 방법을 제공하고, 32 P 오르토와 셀의 LRRK1 및 LRRK2 단백질 레이블을하는 프로토콜을 제시한다. 요컨데, 궁합 LRRK 단백질이 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현되는 태그. 32 P-인산염은 후 세포에 의해 흡수되어 단 몇배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그를 통해 (3xflag) LRRK 단백질은 면역에 의해 다른 세포 구성 요소에서 격리됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 서부 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다. 프로토콜은 쉽게 세포에서 발현 및 면역 침전에 의해 단리 될 수있는 임의의 다른 단백질의 인산화를 모니터링하도록 구성 될 수있다.

Introduction

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2)는 유사한 도메인 조직을 공유하는 멀티 도메인 paralogs 있습니다. 이 두 단백질은 효과적으로 ROCO 단백질 가족 5,6에 두 단백질을 분류, GTPases (복합 단백질의 라스, 또는 ROC)의 라스의 가족뿐만 아니라 ROC 도메인 (COR)의 C-말단에 가까운 GTPase의 시퀀스를 인코딩합니다. 만 LRRK2 여분 딜 domein 6-8을 인코딩하는 동안 ROC-COR 도메인 직렬의 N-말단이 두 단백질은 류신이 풍부한 반복 도메인뿐만 아니라 ankyrin 같은 도메인을 인코딩합니다. 만 LRRK2는 C-말단 부위 8 WD40 도메인을 인코딩하는 동안 ROC-COR의 C-말단, 두 단백질은 세린 트레오닌 키나제 도메인을 공유 할 수 있습니다. LRRK1 및 LRRK2의 정확한 세포의 역할은, 그러나 LRRK1 1,2 신호 티로신 키나제 수용체에 연루되어, 설명 될 아직 동안 파킨슨 병 3,4의 병인에 LRRK2의 역할에 대한 유전 적 증거를 가리 킵니다.

9-11 사이의 클러스터에서 발생하는 세포의 인산화 사이트의 대부분을 보여 주었다. LRRK1 세포 인산화 사이트를 매핑 할 수 아직 가지고 있지만, COS7 세포에서 면역 침전 LRRK1 단백질의 말의 인 단백질 염색법을 사용하여 연구의 증거가 LRRK1 단백질은 셀 (12)의 인산화 것을 제안합니다.

이 논문은 32 P-인산염과 신진 대사 라벨을 사용하여 세포 라인에 LRRK1 및 LRRK2의 일반 인산화 수준을 시금위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 전반적인 전략은 간단합니다. 궁합 LRRK의 PROTE 태그인은 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현된다. 32 P-인산염이 단 몇 배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자 후 세포에 의해 동화함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그 (3xflag는) 다음 면역에 의해 다른 세포 구성 요소의 LRRK 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 서부 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다.

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Protocol

이 의정서는 LRRK2의 세포 인산화를 따라 방사성 32 P 표지 인산염을 사용합니다. 그것은 방사성 시약 모든 작업은 작업자와 환경에 방사성 방사선의 노출을 최소화하기 위해 적절한 보호 조치를 사용하여 수행되어야한다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 이온화 방사선을 방출하는 동위 원소를 포함하는 화합물은 기관 및 국가 수준의 컨트롤의 사용에서 인간의 건강과 엄격한 라이선스 규정에 유해 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 실험은 Katholieke 제 대학 루벤 (KU 루뱅)에서 오픈 소스 방사선 사용 훈련을 다음과 대학의 건강, 안전 및 환경 부서에서 제공하는 좋은 실험실 연습 지침에 따라 수행 하였다. 우리의 프로토콜의 몇 가지 단계가 널리 세포 배양, SDS-PAGE, 웨스턴 블로 팅으로 배포하고 우리의 실험실에서 적용 여기에 프로토콜의 세부 사항은 제공됩니다. 그것은들해야할 것은 정확한 실험 조건은 실험실에서 실험에 따라 달라진다는 점에 유의해야 방사성 물질의 적절한 처리를 보장하기 때문에 특정 조치는 각각의 새로운 실험실 환경에 적응해야한다.

오픈 소스 방사선의 사용은 사전 규제 승인을 받아야 및 실험실 연구에서 오픈 소스 방사선을 담당하는 규제 기관은 국가에 따라 다릅니다. 사용자는 해당 절차는 현지 법률과 규정을 준수 보장하기 위해 자신의 기관 방사선 안전 책임자와상의해야합니다. 규제 기관에 대한 정보를 찾을 수 : 벨기에, 원자력 제어를위한 연방 기관에 ( http://www.fanc.fgov.be 에서 웹 사이트 프랑스어 또는 네덜란드어), 영국, 보건 및 안전 이그 제 큐 티브 ( HTTP : / / www.hse.gov.uk / 방사선 / 이온화 / index.htm으로 ), 미국 NUC에리어 규제위원회 ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html 캐나다), 캐나다 원자력 안전위원회 ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), 및 독일 다스 Bundesamt FÜR Strahlenschutz에서 ( http://www.bfs.de/de/bfs ). 이 프로토콜과 관련된 안전을위한주의 사항은 본문에서 언급 된 방사성 클로버 기호 (강조 방사선 기호 ).

1. 세포의 신진 대사 라벨링

  1. 라벨에 대한 세포를 준비합니다.
    1. 문화 HEK293T 세포 라인의 표준 배양 조건에 따라 (37 ° C, 5 % CO 2) 8 % 소 태아 혈청 및 겐타 마이신과 DMEM에.
    2. 충분히 세포를 확장테스트 할 샘플 당 최소 1 X 10 6 세포를 얻을 수 있습니다.
    3. 세포를 Trypsinize 잘 10 6 세포 /에서 6 웰 플레이트 (35 mm 직경)로 판을 밖으로.
    4. 24 시간 세포를 도금 후, 형질 전환 또는 렌티 바이러스 벡터 매개 전달을 통해 3xflag-LRRK2 단백질을 표현한다.
      1. 형질의 경우, 추가없이 (샘플 4 μg의 DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 플라스미드 13-15 또는 pCHMWS-3xflag-LRRK1 플라스미드 15)와 80 μL의 DMEM에 선형 폴리에틸렌 이민 (PEI 선형, 1 ㎎ / ㎖)의 8 μL 당 혼합 ). 15 ~ 30 분 동안 복잡한 작업을 수행 할 수있는 다음 존재하는 매체로 잘 혼합 세포 복합체를 추가합니다.
      2. 렌티 바이러스 벡터를 매개로 전달의 경우, 렌티 바이러스 벡터 인코딩 3xflag-LRRK1을 희석 또는 -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2는, 엄지 손가락의 규칙으로, 두 배의 열 변환 장치로 형질 도입, 기능 벡터 입자 즉, 수, 세포) 배양 배지에있다 lentivector의로. 상품의 설명 LV-3xflag-LRRK1 / 2의 이온 이전에 15을 설명하고있다.
    5. 세포 80-100 % 년 합류 (약 48 시간 형질 전환 또는 형질 도입 후) 경우, 인산염없이 예비 가온 (37 ° C) DMEM으로 세포를 씻어.
  2. 32 P-오르토 인산 라벨 세포.
    1. 방사선 작업시 안전의 마음 일반 원칙에 유의하십시오.
      1. 방사선 기호 지정된 방사선 지역에 32 P와 함께 모든 작업을 수행합니다.
      2. 방사선 기호 적절한 개인 보호 장비를 착용해야한다 - 우리의 실험실에서 표준 운영 절차에 따라 이러한 실험실 외투, 두 배 장갑, 보호 안경 (가) 있습니다.
      3. G "SRC는 ="/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> 32 P와 함께 모든 작업은 노출을 최소화하기 위해 6 개 mm 방풍 스크린에 의해 사용자로부터 보호해야한다.
      4. 방사선 기호 개인 감시 장치는 항상 사용되어야한다 - KUL 내의 모든 인증 오픈 소스 방사선 사용자가 실험을하는 동안 방사선 노출을 모니터링 할 수있는 실험실 코트의 가슴 주머니에 부착 된 필름 배지를 착용하고 있습니다.
      5. 방사선 기호 모든 실험 표면은 가이거 카운터와 함께 사용하기 이전과 이후 방사능에 대해 평가해야한다.
      6. 방사선 기호 모든 잠재적으로 오염 된 소모품은 RA에 대한 제도적 지침을 엄격히 준수해서 처리해야합니다dioactive 폐기물 처리.
    2. 층류에서 레이블로 세포의 6 - 웰 플레이트 당 (37 ° C에 데워진) 인산염없이 DMEM의 2.1 ㎖로 팔콘 튜브를 준비합니다.
      1. 예를 들어, 6 - 웰 플레이트의 모든 우물에 라벨 세포에, 12.6 ㎖의 배지 (= X 2.1 6)를 준비하고 있습니다. 이것은 2 ㎖ 매체 부피 5 % 과량 세포의 10 - 웰 플레이트 웰 당 사용될 위해 제공하는 것이다.
    3. 방사선 기호 이온화 방사선 실험이 수행 될 때의 벤치를 준비합니다. 작업 공간은 흡착 물질의 보호 라이너가 배치되는에 유출 매트에 의해 덮여있다. 하나 방수 표면 라이너를 사용하는 경우, 흡수 쪽이 위로 놓습니다.
    4. 방사선 기호 또한 제공방풍의 작업 공간에 항아리와는 인산염 배지의 튜브를 놓습니다.
    5. 방사선 기호 냉장고의 32 중 P라는 인산염의 유리 병으로 리드 줄 지어 컨테이너를 타고 방사능 벤치에 가져다. 가이거 카운터를 사용하여 외부의 방사능 오염에 대한 컨테이​​너를 모니터링합니다.
    6. 방사선 기호 24 μCi / ㎖의 농도로 포스페이트없이 DMEM의 튜브로 (32) P 표지 인산염을 희석.
      1. 참고 : 잘 세포의 6 - 웰 플레이트 당 2 ㎖에,이 5 μCi (32)에 배양 된 세포의 P라는 인산염 / ㎠에 해당합니다.
      2. 방사선 기호 유지방풍 유리 항아리에 관.
    7. 방사선 기호 32 P라는 인산염의 나머지 컨테이너를 닫고 냉장고에 교체합니다.
    8. 방사선 기호 방사능 벤치에 보육과 장소에서 표시 할 수있는 세포를 6 - 웰 플레이트를 제거합니다.
    9. 방사선 기호 매체 상층 액을 제거하고 폐기. 포함 된 인산염 배지 2 ㎖를 추가 32 P는 오르토 / 잘 표시.
    10. 방사선 기호 방풍 유리 상자에 배양 플레이트를 배치 한 다음 컨테이너 FO를 모니터링가이거 카운터를 사용하여 R 외부 방사능 오염.
    11. 방사선 기호 동위 원소 대사 라벨 전용 진핵 세포 배양기에 세포와 방풍 상자를 전송합니다.
    12. 방사선 기호 5 % CO 2에서 37 ° C에서 1-20 시간 동안 배양한다.
      1. 일반적으로 3 시간 이상 결합 시간을 권장합니다. 원하는 최적의 배양 시간은 각각의 특정 단백질에 대한 시간 코스 실험을 통해 평가 될 수있다.
    13. 방사선 기호 선택 사항 : 화합물과 세포를 치료.
      1. (예 키나아제 억제제와 같은) 복합 치료 실험에서, 화합물 처리 공정은 이후에 포함라벨링을 허용하도록 화합물없이 배양 시간을 itial. 원하는 배양 시간 후에, 배양 플레이트를 포함 스펙스 상자 인큐베이터에서 제거되고 방사능 벤치로 가져왔다.
      2. 방사선 기호 레이블 매체는 화합물을 원하는 농도로 희석 된에 데워진 인산 배지 제거 및 대체됩니다. 방풍 유리 항아리에 배치 폐기물 수집을위한 50 ㎖ 튜브에 매체를 폐기하십시오.
      3. 방사선 기호 세포는 방풍 유리 상자에 교체 원하는 접촉 시간 동안 세포 배양기에 배치됩니다.
  3. 방사선 기호 LABE의 해물 수집주도 세포.
    1. 방사선 기호 세포에서 매체를 제거하고 방풍 유리 항아리에 배치되는 폐기물 수집 튜브에 버린다.
    2. 방사선 기호 세포는 방풍 유리 항아리에 배치 된 폐기물 수집 관에 세척 용액을 버리고, 차가운 얼음 TBS (트리스 50 mM의 NaCl을 150 밀리미터, 산도 7.4, 2 ㎖ / 린스)와 2 배 린스.
    3. 방사선 기호 또한 각 얼음 냉 면역 (IP) 용해 버퍼의 0.5 ML을 추가하고 모든 용해 세포를 느슨하게하기 위해 위아래로 해물을 피펫으로 해물를 수집합니다.
      1. 프로테아제 저해제 칵테일 및 포스파타제를 추가 IP 용해 완충액 일전 (0.5 ㎖ / 시료 플러스 5 % 초과)의 필요한 양을 준비사용 직전에 신선한 억제제 칵테일.
      2. 용해 버퍼의 구성은 트리스 20 mM의 pH를 7.5, 염화나트륨 150 밀리미터, EDTA 1 ㎜, 트리톤 (Triton) 1 %, 글리세롤 10 %, 단백질 분해 효소 억제제 칵테일과 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일입니다.
    4. 방사선 기호 microcentrifuge 관에 파쇄물을 전송하고 적어도 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
    5. 방사선 기호 10 분> 5,000 XG에서 마이크로 원심의 해물을 원심 분리기.
    6. 방사선 기호 방풍의 방패 뒤에 저장되는 전용 쓰레기통에 방사성 폐기물 폐기하십시오.

2. 관심의 단백질의 레이블을 분석

  1. 방사선 기호 immunopurification (IP)에 의해 관심의 단백질을 분리합니다.
    1. 방사선 기호 다시 얼음을 원심 분리 해물과 마이크로 원심 튜브를 전송하고 평형 플래그-M2 아가로 오스 비즈 10 μL 침대 볼륨을 포함하는 microcentrifuge 관에 뜨는을 피펫.
      1. 미리 평형 플래그-M2 아가로 오스 비즈 튜브를 준비합니다.
      2. 이를 위해, 10 ㎕의 샘플 당 베드 부피 플러스 5 % 초과에 대응 플래그 M2-아가 로스 슬러리의 부피 피펫.
        1. 일반적으로, 구슬의 10 μL 침대의 볼륨은 20 ㎕의 슬러리에 해당합니다. 자세한 내용은 제품 데이터 시트를 참조하십시오.
      3. IP 용해 버퍼의 10 권 (침대의 볼륨을 기준으로)의 3 배를 세척하여 구슬을 평형.
      4. 샘플 수만큼의 튜브에 10 ㎕의 침대 볼륨 / 튜브 균일 평형 구슬을 배포합니다. 각 샘플에 대한 식별자와 튜브를 라벨.
    2. 방사선 기호 방사성 클로버 표시가있는 50 ㎖ 튜브 (약 6 마이크로 원심 tubes/50의 ML 튜브)에 마이크로 원심 튜브를 전송하고 얼음에 보관.
    3. 방사선 기호 1-20 시간 동안 4 ° C에서 혼합 말에 말에 대한 차가운 실내를 지정된 영역에 방풍 방패 뒤에 회전 장치로 전송 샘플.
    4. 방사선 기호 얼음에 지정된 작업 공간에 샘플을 전송합니다.
    5. 50523rad1highres.jpg "SRC ="/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> 마이크로 원심 (1,000 XG, 1 분)에 플래그-M2 아가로 오스 비즈를 결합 단백질을 스핀 다운 및 폐기물 수집 튜브에 뜨는 폐기하십시오.
    6. 방사선 기호 1 ㎖ IP 세척 버퍼에 재현 탁하여 단백질 결합 플래그-M2 아가로 오스 비즈를 씻으십시오.
      1. IP 세척 버퍼의 구성 : 트리스 25 mM의 pH를 7.5, 염화나트륨 400 밀리미터, 트리톤 1 %. 또한 공동 정화 단백질 분해 효소에 의해 또는 공동 정화 인산 가수 분해 효소에 의해 탈 인산화에 분해에 민감한 단백질 세척 버퍼에서 단백질 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는 것이 좋습니다.
      2. 방사선 기호 마이크로 원심에있는 단백질 결합 플래그-M2 아가로 오스 비즈 (1,000 XG, 1 분) 스핀 다운 및 폐기물 컬렉터 엔진에 뜨는 폐기기 관.
      3. 방사선 기호 세척 단계의 3 배를 반복합니다.
    7. 방사선 기호 세척 한 후, 1 ㎖ IP 린스 버퍼 (트리스 25 mM의 pH를 7.5, MgCl2를 10 밀리미터, 디티 오 트레이 톨 (DTT) 2 ㎜, 트리톤 0.02 %, 베타 - 글리세로 5 mm의 나 3 VO 4 0.1 ㎜)에 구슬을 재현 탁.
    8. 방사선 기호 마이크로 원심에있는 단백질 바인딩 플래그-M2 아가로 오스 비즈 (1,000 XG, 1 분) 스핀 다운 및 폐기물 수집 튜브에 뜨는 폐기하십시오. 모든 여분의 버퍼를 제거합니다.
    9. 방사선 기호 40 & M에 재현 탁 비즈U, IP 샘플 SDS 로딩 버퍼의 L (트리스 - 염산 160 mM의 pH를 6.8, SDS 2 %, DTT 0.2 M, 글리세롤 40 %, 브로 모 페놀 블루 2 ㎎ / ㎖).
      1. 샘플은 즉시 분석하거나 불순한 분석을 위해 -20 ° C 냉동고에 저장 될 수 있습니다.
        1. 방사선 기호 방사성 시료의 저장을 위해 최선을 다하고 방사성 클로버 기호 표시 냉동고에서 방풍 유리 상자의 튜브 용기 나 상자에 -20 ° C, 장소 샘플에서 샘플을 저장하십시오.
    10. 방사선 기호 방풍의 방패 뒤에 저장되는 전용 쓰레기통에 방사성 폐기물 폐기하십시오.
  2. 방사선 기호 SDS-PAGE 및 BLO를 통해 IP 샘플을 해결PVDF 막에 t.
    1. 방사선 기호 비드 펠렛> 1,000 XG에 1 분 2 분 원심 분리기 95 ° C의 로딩 버퍼에 열 샘플.
    2. 방사선 기호 방풍 화면 뒤에 방사능 벤치에 단백질 겔 전기 영동 모듈을 준비합니다.
    3. 방사선 기호 3~8% 트리스 - 아세테이트 SDS-PAGE 젤 상에로드 샘플.
      1. 겔이 유형의 고 분자량 (HMW) 단백질 분해에 적합하다. 다른 젤 타입은 또한 4-20% 비스 - 트리 신 젤 또는 트리스 - 글리신 4~20% 젤로, 적합 할 수있다.
      2. HMW 단백질의 크기를 분별하기에 적합한 분자량 마커를 포함합니다.
    4. <리> 방사선 기호 1 시간 동안 150 V에서 전기 영동을 수행합니다.
    5. 방사선 기호 전기 영동 후에는 플라스틱 케이스에서 젤을 제거하고 웨스턴 블로 팅 전송 버퍼와 컨테이너에 젤을 전송합니다.
      1. 웨스턴 블로 팅 전송 버퍼의 구성 : 트리스 50 밀리미터, 글리신 40 ㎜, SDS 0.04 %, 메탄올 20 %.
      2. 방사선 기호 같은 잘 구분하고 튀어 젤의 바닥 부분으로 돌출 젤의 부분을 잘라.
    6. 1 분 동안 메탄올에 침지시킴으로써 젤 당 하나의 폴리 불화 비닐 리덴을 준비 (PVDF) 막, 다음 전송 버퍼에 배치.
      1. 세포막의에​​ 절단 젤 + 3 mm의 여유로 AME 크기.
    7. 방사능 벤치에 반 건조 블로 팅 모듈을 배치하고 커버와 상부 전극 판을 제거합니다.
    8. 방사선 기호 세미 드라이 블롯 모듈의 표면에 블로 팅 샌드위치를​​ 준비한다.
      1. 블로 팅 모듈의 바닥 판에 전송 버퍼와 장소에 필터를 모래 바닥 (7.5 X 10cm 대형, 두께 2.5 mm) 여분의 두께를 적 십니다.
      2. 방사선 기호 블로 팅 필터의 사전 젖은 PVDF 멤브레인을 놓습니다.
      3. 방사선 기호 조심스럽게 PVDF 막에 젤을 배치하고 공기 방울을 제거합니다.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "SRC ="/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/>는 모래 바닥 모듈의 바닥 판에 전송 버퍼와 장소에 여분의 두꺼운 블로 팅 필터를 적시에 오점 샌드위치를​​ 완료합니다. 모든 공기를 제거 모래 바닥 샌드위치 결국 현재의 거품.
        여기에 주어진 설명은 전극이 단백질 막에 아​​래로 마이그레이션하도록하는 바이오 래드 트랜스 오 SD 시스템과 호환되어 있습니다. 기타 블로 팅 시스템은 또한 그러한 결국 고려 다른 블로 팅의 방향을 취할 필요하거나, 탱크 블롯, 상기 전기 영동 완충액과 동일한 방법으로 폐기되어야하는 여분의 액체 폐기물의 경우에서와 같이 작은 적응와 이러한 단계와 호환된다.
    9. 방사선 기호 흡수성 티슈로 모든 초과 버퍼를 제거하고 상부 플레이트와 반 D의 커버를 배치 공예 모듈을 모래 바닥.
    10. 방사선 기호 1 ~ 2 시간 동안 15 V에서 단백질을 전송합니다.
    11. 방사선 기호 이 시간 동안 전기 영동 모듈을 정리.
      1. 방사선 기호 방풍의 방패 뒤에 저장되는 전용 쓰레기통에 방사성 폐기물 폐기하십시오.
      2. 방사선 기호 증류수 (AD)와 전기 모듈을 씻어 방사성 액체 폐기물 용기에 헹굼 물을 폐기하십시오.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> 전송 한 후, 블로 팅 모듈에서 제습 단백질과 PVDF 멤브레인을 제거합니다.
    13. 방사선 기호 선택 사항 : 단백질을 시각화하는 도말 단백질의 개양귀비 빛의 S 염색을 수행합니다.
      1. 방사선 기호 개양귀비 빛의 S 솔루션을 포함하는 얕은 오 배양 용기에 오점을 전송하고 5 분 동안 품어.
      2. 방사선 기호 AD에 신속하게 배를 씻어.
    14. 방사선 기호 막 건조.
  3. / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg은 "/> 오토 라디오 그래피를 수행합니다.
    1. 방사선 기호 1~5일의 인광 판에 막을 노출.
    2. 방사선 기호 동등한 스톰 840 인광 스캐너를 사용하여 노출 된 인광 판의 오프 32P를 읽고 고해상도 TIFF로 이미지를 저장합니다.
  4. 방사선 기호 면역 통해 단백질 수준을 검출한다.
    1. 방사선 기호 메탄올로 간략하게 찍기로 막을 재수, 다음 PBS와 얕은 오 배양 용기에 전송할 수 있습니다. 방사선 기호 5 %의 우유가 포함 된 (0.1 % 트리톤 (Triton)과 PBS) PBS-T의 세포막을 차단합니다.
    2. 방사선 기호 적절한 세척 단계와 차 항체 배양 안티 플래그 항체 및 프로세스 더 안티 LRRK2 항체 13, 16 이상을 말을 품다.
    3. 방사선 기호 LRRK2의 상대적 단백질 수준을 확인하기 위해 화학 발광 검출을 수행합니다.
  5. LRRK2 32 P의 결합을 정량화.
    1. 같은 ImageJ에 소프트웨어, 국립 Instit에서 사용할 수있는 프리웨어 프로그램으로 해당 소프트웨어를 사용하여 오 autoradiograms 및 면역 반응에 밴드의 농도계 분석을 수행건강 웹 사이트의 백인 군대 ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. 면역 수준에 방사 법적 신호의 비율로 인산 결합의 수준을 계산합니다.

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Representative Results

세포에서 LRRK1 및 LRRK2의 전체 인산화 수준을 비교하기 위해, 3xflag는 LRRK1 태그와 LRRK2는 HEK293T 세포 (15)로 표현했다. 세포는 6 - 웰 플레이트에서 배양 32 P로 표지 및 프로토콜 텍스트에서 설명한 바와 같이 분석했다. 그림 1은 HEK293T 세포에서 LRRK1 및 LRRK2의 신진 대사 라벨링에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 방사성 인산 결합이 LRRK1 및 LRRK2 모두 관찰된다. 통계적 의미가 있지만 반대로 플래그 항체와 면역의 농도계 분석에 의해 측정 된 단백질의 수준으로 정상화 32 P 수준의 정량화에, 그것은 LRRK1 테스트 조건에서 LRRK2보다 낮은 평균 인산화 수준을 한 것으로 나타났습니다 (P> 0.05)에 도달하지.

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그림 1. LRRK1 및 LRRK2의 대사 표시. A. LRRK1 및 LRRK2는 HEK293T 세포에서 발현은 대사 프로토콜에 설명 된대로 32 P로 표지 및 섹션을 결과했다. 32 P의 법인 대표 autoradiograms (상단 패널)뿐만 아니라 3xflag 태그를 통해 LRRK1 및 LRRK2 감지 대표 웨스턴 오 (아래 패널) 여기 묘사했다. LRRK1 및 LRRK2의 비교 신진 대사 라벨링 B. 정량화 (N = 4).

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Discussion

이 논문은 32 P-인산염과 신진 대사 라벨을 사용하여 세포 라인에 LRRK1 및 LRRK2의 일반 인산화 수준을 시금위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 전반적인 전략은 간단합니다. 궁합 LRRK 단백질이 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현되는 태그. 32 P-인산염이 단 몇 배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자 후 세포에 의해 동화함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그 (3xflag는) 다음 면역에 의해 다른 세포 구성 요소의 LRRK 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 웨스턴 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다. 이 프로토콜은 LRRK2의 AU를 측정하는 프로토콜과 구별 될그 LRRK1의 라벨 또는 LRRK2의 tophosphorylation (17)는 오히려 정제 된 단백질과 생체 인산화 반응에 비해 세포 배양에서 수행된다.

그것은 여기에 제시된 상세한 프로토콜은 실험 목적에 따라 여러 변화를 수용하도록 조절 될 수 있음을 주목해야한다. 라벨링은 가장 일반적인 실험실 세포주에서 효율적으로 예를 들어,이 프로토콜은 HEK293T 세포주의 사용에 제한되지 않는다. 또 다른 친 화성 태그는 HA와 같은 3xflag 대안으로 사용될 수 있으며, MYC, V5, GFP 또는 다른 태그 (18)와 같은 다수의 태그를 효율적으로 면역 침전 LRRK1 또는 LRRK2하는데 사용될 수있다. 경우에 단백질 - 특이 적 항체가 LRRK2 (11)의 경우와 같이, 면역 침전에 적합 단백질이 가능하고, 이것 역시 구현 될 수있다. 면역 학년 단백질 특정 항체로, LRRK의 신진 대사 라벨링을 수행하는 것도 가능하다단백질은 내생 세포 라인으로 표현. LRRK2의 경우, 몇개의 모노클로 날 항체는 내인성 LRRK2 19 중 어느 캔 면역 침전을 설명 하였다. 마지막으로, LRRK1 및 LRRK2 여기 기재된 대사 라벨링 프로토콜은 또한 상기 일반적인 전략을 사용하여 세포주로부터 면역 침전 될 수있는 임의의 다른 단백질로 구성 될 수있다.

세포 배양에있는 단백질의 대사 표시를 수행하기 전에 고려해야 할 중요한 사항이 기술은 세포 단백질의 인산화를 결정하기 위해 사용할 수있는 다른 방법을 비교하는 방법이다. 예를 들어, 특정 사이트에서의 인산화는 포스 포 - 특이 적 항체를 이용한 면역 블로 모니터링 할 수있다. 이 방법은 동위 원소 표지 단계를 제외하고는 여기에 설명하는 것과, 그것이 사용할 수있는 경우 이러한 이유로,이 기술은 종종 32 P-인산염과 신진 대사 라벨링을 통해 선호와 유사한 단계를 따릅니다. 과 신진 대사 라벨링 32 P-오르토 따라서는 특정 사이트의 인산화에 대한 정보를 제공 할 수없는, 단백질의 전체적인 인산화 상태 나타내는 신호를 제공한다. 그것은 LRRK2 10,11위한 경우와 같이 체류 인산화 사이트와 단백질, 대사 라벨링 기술은 단지 여러 면역 단계 보류 포스 특이 항체로 확정 할 전반적인 인산화 수준의 한 단계 평가를 제공한다. 예를 들어, LRRK2는 S910/S935/S955/S973 11,20 사이트, 즉뿐만 아니라 최근 특징 S1292 사이트 (21) 등 다른 지역의 10에 해당 ANK-LRR 도메인 간 지역에서 매우 인산화입니다. 개인 phosphosites의 역할을 해부하기 위해, 그것은 phosphosite 특정 항체와 실험을 선호하는 것이 좋습니다. 예를 들어 특정 항체가 S910/S935/S955/S973의 phosphosites이 dephosphorylate 것을 식별 할 수있다 phosphosite이러한 R1441C / G, Y1699C, I2020T 아니라 G2019S에 11,22, 등 여러 가지 병원성 돌연변이에있는 D LRRK2 질환 돌연변이 형태는 일반적으로 높은 포스-S1292 레벨 21를 표시하면서. 그러나 신진 대사 라벨 휴대 인산화의 다른 연구의 숫자에 유용하다. 대사 라벨은 항상 알 수없는 인산화 사이트의 경우 예를 들어 적용 기술, 또는 인산화 항체를 사용할 수없는 경우 또는 낮은 감도. (LRRK1 및 LRRK2, 그림 1의 세포 인산화 수준을 비교 다음과 같이) 마지막으로, 신진 대사 라벨은 또 다른 하나의 항체에서 감도의 차이 주어진 phosphosite 특정 항체와 함께 할 도전의 비교, 다른 단백질의 전체 인산화 수준을 비교 할 수 있습니다 .

결론적으로, 본 프로토콜은 세포 LRRK 단백질의 전체적인 인산화 수준의 효율적인 평가를 허용한다. 프로토콜은 용이하게 모니터링하도록 구성 될 수있다세포에서 발현 및 면역 침전에 의해 단리 될 수있는 임의의 다른 단백질의 인산화. phosphosite 특정 항체 연구 또는 검증의 단계로 단백질을 이용할 수없는 경우에이 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 실험의 목표는 신​​진 대사 라벨링을 통해 이러한 비교로 2 개 이상의 서로 다른 단백질의 인산화 전체를 비교하는 것입니다 때이 프로토콜은 특히 유용은 다른 하나의 단백질의 인산화의 검출 감도의 차이에 의해 바이어스되지 않습니다. 특히 LRRK1 및 LRRK2를 들어,이 기술은 비교적 LRRK1 인산화 조절을 제대로 이해하는 동안 이러한 변화는, LRRK2 11,13,23에 대해 설명하기 시작했다 주어진 LRRK1 및 LRRK2의 인산화 활동에 따라 변화를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 또한이 연구를 지원하는 마이클 J. 폭스 재단에 감사하고 있습니다. 플랑드르 FWO (FWO 프로젝트 G.0666.09, JMT에 선임 연구원의 교제), IWT SBO/80020 프로젝트 신경 TARGET, KU 루뱅 (OT/08/052A 및 IOF-KP/07 / 001) - 우리는 연구 재단 감사 자신의 지원. 이 연구는 또한 JMT은 킹 보두앵 재단에 의해 관리되는 기금 Druwé-Eerdekens에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

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