Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

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Biology

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Summary

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son proteínas multidominio que codifican tanto GTPasa y dominios quinasa y que son fosforilados en las células. Aquí, se presenta un protocolo para etiquetar LRRK1 y LRRK2 en las células con 32 P ortofosfato, proporcionando así un medio para medir sus niveles generales de fosforilación celular.

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Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

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Abstract

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son paralogs que comparten un dominio organización similar, incluyendo un dominio quinasa serina-treonina, un dominio de Ras proteínas complejas (ROC), un C-terminal de dominio de la República de China (COR), y rica en leucina y repite-anquirina como en el extremo N-terminal. Las funciones celulares precisas de LRRK1 y LRRK2 aún no se han dilucidado, sin embargo LRRK1 ha sido implicado en la señalización del receptor de tirosina quinasa de 1,2, mientras que LRRK2 está implicada en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson 3,4. En este informe, se presenta un protocolo para etiquetar las proteínas LRRK1 y LRRK2 en células con 32P-ortofosfato, proporcionando así un medio para medir los niveles generales de fosforilación de estas 2 proteínas en las células. En breve, la afinidad de las proteínas etiquetadas con LRRK se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unos pocoshoras de incubación y todas las moléculas en la celda que contiene fosfatos de ese modo se marcaron radiactivamente. A través de la etiqueta de afinidad (3xFLAG) las proteínas LRRK están aislados de otros componentes celulares por inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados se separan luego a través de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y análisis de los fosfatos incorporados se realiza por autorradiografía (32 señal P) y de detección de Western (señal de proteína) de las proteínas en las manchas. El protocolo puede ser fácilmente adaptado para controlar la fosforilación de cualquier otra proteína que se puede expresar en las células y se aisló por inmunoprecipitación.

Introduction

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son paralogs multidominio que comparten un dominio organización similar. Ambas proteínas codifican una secuencia de GTPasa similar a la familia Ras de GTPasas (RAS de Proteínas del Complejo, o ROC), así como un C-terminal de dominio ROC (CDR), la clasificación de manera efectiva ambas proteínas a la familia de proteínas ROCO 5,6. N-terminal del dominio tándem ROC-COR, ambas proteínas codifican un dominio de repetición rica en leucina, así como un dominio de ankyrin como, mientras que sólo el LRRK2 codifica un armadillo adicional domein 6-8. C-terminal de la República de China-COR, ambas proteínas comparten un dominio quinasa serina-treonina, mientras que sólo LRRK2 codifica un dominio WD40 en la región C-terminal 8. Las funciones celulares precisas de LRRK1 y LRRK2 aún no se han dilucidado, sin embargo LRRK1 ha sido implicado en la señalización del receptor de tirosina quinasa de 1,2, mientras que la evidencia genética puntos a un papel para LRRK2 en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson 3,4.

9-11. Aunque LRRK1 sitios de fosforilación celular aún no se han asignado, la evidencia de los estudios que utilizaron tinción fosfoproteína de manchas de proteína LRRK1 inmunoprecipitada a partir de células COS 7 sugiere que la proteína está fosforilada LRRK1 en las células 12.

Este documento proporciona un protocolo básico para el ensayo de nivel de fosforilación general de LRRK1 y LRRK2 en líneas celulares mediante marcaje metabólico con 32P-ortofosfato. La estrategia general es sencillo. Affinity etiquetada LRRK proteins se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unas pocas horas de incubación y todas las moléculas en la célula que contienen fosfatos, por lo tanto marcado radiactivamente. La etiqueta de afinidad (3xFLAG) se utiliza a continuación para aislar las proteínas LRRK de otros componentes celulares por inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados se separan luego a través de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y análisis de los fosfatos incorporados se realiza por autorradiografía (32 señal P) y de detección de Western (señal de proteína) de las proteínas en las manchas.

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Protocol

El presente protocolo utiliza radiactivo 32 ortofosfato P-etiquetados para seguir fosforilación celular de LRRK2. Es importante tener en cuenta que todas las operaciones con reactivos radiactivos se deben realizar a través de medidas de protección adecuadas para reducir al mínimo la exposición de la radiación radiactiva para el operador y el medio ambiente. Los compuestos que contienen los isótopos que emiten radiación ionizante puede ser perjudicial para la salud humana y estricto proceso de autorización y reglamentos en un control de nivel institucional y nacional de su uso. Los experimentos en este protocolo se llevaron a cabo después del entrenamiento en el uso de radiación de código abierto en la Universidad Católica de Lovaina (KU Leuven) y siguiendo las directrices de buenas prácticas de laboratorio proporcionados por el departamento de salud, seguridad y medio ambiente en la universidad. Varios pasos en el protocolo son utilizados ampliamente como el cultivo de células, SDS-PAGE, Western Blot y dan aquí están los detalles del protocolo que se aplica en nuestro laboratorio. Es should tenerse en cuenta que las condiciones experimentales precisas varían de un laboratorio a otro, por lo que las medidas específicas para garantizar el manejo adecuado de los materiales radiactivos deben adaptarse a cada nuevo entorno de laboratorio.

El uso de radiación de la fuente abierta está sujeta a la aprobación regulatoria antes y el organismo regulador responsable de la radiación de fuentes abiertas en la investigación de laboratorio varía de país a país. Los usuarios deben consultar con su agente de seguridad radiológica institucional con el fin de garantizar que el procedimiento se ajusta a las normas y reglamentos locales. La información sobre los organismos reguladores se puede encontrar: en Bélgica, la Agencia Federal de Control Nuclear ( http://www.fanc.fgov.be , sitio web en francés o neerlandés), en el Reino Unido, la Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / radiación / ionizante / index.htm ), en los Estados Unidos la NucComisión Reguladora lear ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), en Canadá, la Comisión Canadiense de Seguridad Nuclear ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), y en Alemania Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Las precauciones de seguridad correspondientes a este protocolo se han observado en el texto, destacadas con el símbolo del trébol radiactivo ( Rad Símbolo ).

1. El marcaje metabólico de células

  1. Preparar las células para el etiquetado.
    1. Líneas de células HEK293T de cultivo de acuerdo a las condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% de CO 2) en DMEM con 8% de suero de ternero fetal y gentamicina.
    2. Expandir las células suficientemente paraobtener al menos 1 x 10 6 células por muestra para probar.
    3. Tripsinizar células y la placa a cabo en placas de 6 pocillos (35 mm de diámetro) a 10 6 células / pocillo.
    4. 24 horas después del cultivo en placas células, expresan la proteína LRRK2 3xFLAG mediante transfección o transducción de vector lentiviral mediada.
      1. Para la transfección, por muestra de la mezcla 4 g de ADN (pCHMWS--3xFLAG LRRK2 plásmido 13-15 o pCHMWS--3xFLAG LRRK1 plásmido 15) y 8 l de polietilenimina lineal (PEI lineal, 1 mg / ml) en 80 l de DMEM (sin adiciones ). Dejar complejo durante 15-30 minutos y luego añadir complejo a las células mezclando bien en medio presente.
      2. Por vector lentiviral mediada transducción, diluir vector lentiviral que codifica 3xFLAG-LRRK1 o -2 (LV-3xFLAG-LRRK1, LV-3xFLAG-LRRK2, por regla general, la transducción con el doble de unidades de transducción, es decir, el número de partículas de vectores funcionales, de lentivirus, ya que hay células) en el medio de cultivo. Una descripción del producto iones de LV-3xFLAG-LRRK1 / 2 se ha descrito previamente 15.
    5. Cuando las células son 80-100% de confluencia (aproximadamente 48 horas después de la transfección o transducción), enjuagar las células con precalentado (37 ° C) DMEM sin fosfatos.
  2. Las células de la etiqueta con 32-P orto-fosfato.
    1. Tenga en cuenta los principios generales de seguridad cuando se trabaja con radiación.
      1. Rad Símbolo Realizar todas las operaciones con 32 P en una zona de radiación designado.
      2. Rad Símbolo Equipo de protección personal debe llevarse una mascarilla - bajo un procedimiento operativo estándar en nuestro laboratorio que incluyen bata de laboratorio, guantes dobles y gafas protectoras.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Todo el trabajo con 32 P debe ser protegido de los usuarios por 6 mm pantallas de metacrilato para minimizar la exposición.
      4. Rad Símbolo Dispositivos de monitoreo personal se deben utilizar siempre - dentro KUL todo usuario la radiación de código abierto certificada lleva una insignia película unida al bolsillo de la bata de laboratorio para monitorear la exposición a la radiación durante los experimentos.
      5. Rad Símbolo Todas las superficies experimentales deben ser evaluados para determinar la radiactividad antes y después de su uso con un contador Geiger.
      6. Rad Símbolo Todos los consumibles potencialmente contaminados deben ser eliminados de la adhesión estricta a las directrices institucionales para la ARla eliminación de residuos radiactivos.
    2. Bajo un flujo laminar, prepare un tubo Falcon con 2,1 ml de DMEM sin fosfatos (precalentado a 37 ° C) por placa de 6 pocillos de células etiquetar.
      1. Por ejemplo, a las células de la etiqueta en los pocillos de una placa de 6 pocillos, prepare 12,6 ml de medio (= 6 x 2,1). Esto es proporcionar para el medio 2 ml a ser utilizado por 6-así así placa de las células con un exceso de 5% en volumen.
    3. Rad Símbolo Prepare el banco en el que se llevarán a cabo los experimentos con radiación ionizante. El espacio de trabajo está cubierto por una estera de derrame sobre la cual se coloca un revestimiento protector de material absorbente. En caso de que usted está usando un revestimiento con una superficie impermeable, colóquelo con la cara absorbente hacia arriba.
    4. Rad Símbolo También preverun tarro de plexiglás en el espacio de trabajo y coloque el tubo de medio libre de fosfato en el mismo.
    5. Rad Símbolo Lleve consigo el recipiente forrado de plomo con el vial de 32 ortofosfato P etiquetada de la nevera y llevarlo al banco radiactividad. Supervisar el contenedor para la contaminación radiactiva externa usando un contador Geiger.
    6. Rad Símbolo Diluir 32 P marcado ortofosfato en el tubo de DMEM sin ​​fosfatos a una concentración de 24 Ci / ml.
      1. Nota: a los 2 ml por placa de 6 pocillos pocillo de las células, lo que corresponde a 5 Ci 32 ortofosfato P etiquetada / cm 2 de las células cultivadas.
      2. Rad Símbolo Mantenerel tubo en el tarro de plexiglás.
    7. Rad Símbolo Cierre el recipiente con el resto de la etiqueta 32 P ortofosfato y reemplazar en la nevera.
    8. Rad Símbolo Retire las placas de 6 pocillos con células sean etiquetados de la incubadora y el lugar en el banco de la radiactividad.
    9. Rad Símbolo Retire y deseche el sobrenadante del medio. Añadir 2 ml de medio libre de fosfato que contienen marcado con 32P-ortofosfato / pocillo.
    10. Rad Símbolo Coloque las placas de cultivo en una caja de plexiglás luego monitorear el contenedor for contaminación radiactiva externa usando un contador Geiger.
    11. Rad Símbolo Transfiera la caja de plexiglás con las células a una incubadora de células eucariotas dedicada al marcaje metabólico isotópica.
    12. Rad Símbolo Incubar durante 1 a 20 horas a 37 ° C en 5% de CO 2.
      1. En general, se recomienda un tiempo de incorporación de 3 horas o más. El tiempo óptimo de incubación puede ser evaluado a través de experimentos de tiempo para cada proteína específica si lo deseas.
    13. Rad Símbolo Opcional: el tratamiento de las células con el compuesto.
      1. En experimentos con tratamiento con el compuesto (tal como un inhibidor de la quinasa), una etapa de tratamiento compuesto se incluye después de una enitial tiempo de incubación sin el compuesto para permitir el etiquetado. Después de que el tiempo de incubación deseado, la caja de plexiglás que contiene las placas de cultivo se retiran de la incubadora y se lleva a la banco de radiactividad.
      2. Rad Símbolo Se retiró el medio de etiquetado y se sustituye por medio libre de fosfato precalentado en el que el compuesto se diluye a la concentración deseada. Desechar medio en un tubo de 50 ml para la recogida de residuos que se coloca en el frasco de Perspex.
      3. Rad Símbolo Las células son reemplazadas en la caja de plexiglás y se colocan en la incubadora celular durante el tiempo de contacto deseado.
  3. Rad Símbolo Recoger lisados ​​de labecélulas condujo.
    1. Rad Símbolo Retire medio de las células y descartar en el tubo de recogida de residuos que se coloca en el frasco de Perspex.
    2. Rad Símbolo Enjuagar las células 2 veces con TBS hielo frío (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, 2 ml / enjuague), descartando la solución de enjuague en un tubo de recogida de residuos colocado en el frasco de Perspex.
    3. Rad Símbolo Añadir 0,5 ml de hielo frío tampón de lisis inmunoprecipitación (IP) a cada pocillo y recoger lisado pipeteando lisado arriba y hacia abajo con el fin de aflojar todas las células lisadas.
      1. Preparar el volumen necesario de tampón de lisis IP (0,5 ml / muestra, más el 5% de exceso) antes de tiempo, la adición de cóctel inhibidor de la proteasa y fosfatasacóctel inhibidor fresco justo antes del uso.
      2. La composición del tampón de lisis es Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, glicerol 10%, cóctel inhibidor de proteasa y cóctel inhibidor de fosfatasa.
    4. Rad Símbolo Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga y se incuba en hielo durante al menos 10 min.
    5. Rad Símbolo Centrifugar los lisados ​​en una microcentrífuga a> 5.000 xg durante 10 min.
    6. Rad Símbolo Deshágase de los desechos radiactivos en cubos de basura dedicados que se quedarán almacenadas detrás de los escudos de plexiglás.

2. Analizar Etiquetado de proteínas de interés

  1. Rad Símbolo Aislar la proteína de interés mediante inmunopurificación (IP).
    1. Rad Símbolo Transferir los tubos de microcentrífuga con lisados ​​centrifugados de nuevo a hielo y la pipeta el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga que contiene 10 l de volumen de lecho de bolas de agarosa-FLAG M2 equilibradas.
      1. Preparar los tubos con cuentas equilibradas agarosa-FLAG M2 de anticipación.
      2. Para ello, verter un volumen de bandera-M2 suspensión de agarosa correspondiente a 10 l de volumen de lecho por muestra más un exceso de 5%.
        1. En general, un volumen de lecho de 10 l de perlas corresponde a 20 l de suspensión. Consulte la hoja de datos del producto para más detalles.
      3. Equilibrar las cuentas enjuagando 3 veces en 10 volúmenes (con respecto al volumen del lecho) de tampón de lisis IP.
      4. Distribuir cuentas equilibradas de manera uniforme en 10 l de volumen de lecho / tubo dentro de la mayor cantidad de tubos, ya que hay muestras. Marque los tubos con un identificador para cada muestra.
    2. Rad Símbolo Transferir los tubos de microcentrífuga para tubos de 50 ml (aproximadamente 6 ml tubo de microcentrífuga tubes/50) etiquetados con un símbolo del trébol radiactivo y mantener en hielo.
    3. Rad Símbolo Transferir las muestras a un dispositivo giratorio detrás de un escudo de plexiglás en el área designada de un cuarto frío para de punta a punta de mezcla a 4 º C durante 1-20 horas.
    4. Rad Símbolo Transferir las muestras a un espacio de trabajo designado en el hielo.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Haga girar hacia abajo la proteína unida bolas de agarosa-FLAG M2 en una microcentrífuga (1.000 xg, 1 min) y descartar el sobrenadante en un tubo de recogida de residuos.
    6. Rad Símbolo Lave la proteína unida perlas de agarosa-FLAG M2 mediante resuspensión en 1 ml de tampón de lavado IP.
      1. Composición del tampón de lavado IP: pH mM Tris 25 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Se recomienda incluir también inhibidores de la proteasa y de fosfatasa en el tampón de lavado para las proteínas sensibles a la degradación por proteasas co-purificación o para la desfosforilación por fosfatasas co-purificación.
      2. Rad Símbolo Centrifugar la proteína unida-FLAG M2 perlas de agarosa en una microcentrífuga (1.000 xg, 1 min) y descartar el sobrenadante en una colección de residuostubo ción.
      3. Rad Símbolo Repita el paso de lavado 3x.
    7. Rad Símbolo Después de los lavados, resuspender las perlas en 1 ml de tampón de enjuagado IP (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT) 2 mM, Tritón 0,02%, beta-glicerofosfato 5 mM, Na 3 VO 4 0,1 mM).
    8. Rad Símbolo Centrifugar la proteína unida perlas de agarosa-FLAG M2 en una microcentrífuga (1.000 xg, 1 min) y descartar el sobrenadante en un tubo de recogida de residuos. Retire el exceso de buffer.
    9. Rad Símbolo Suspender las en 40 & mU; l de tampón de muestra SDS carga IP (Tris-HCl 160 mM, pH 6,8, SDS al 2%, DTT 0,2 M, glicerol 40%, azul de bromofenol 2 mg / ml).
      1. Las muestras pueden ser analizadas inmediatamente o se almacenaron en un congelador de -20 ° C para el análisis ulterior.
        1. Rad Símbolo Para el almacenamiento de las muestras a -20 ° C, colocar las muestras en soportes de tubos o cajas en una caja de metacrilato en un símbolo del trébol congelador marcado radiactivo dedicado para el almacenamiento de muestras radiactivas.
    10. Rad Símbolo Deshágase de los desechos radiactivos en cubos de basura dedicados que se quedarán almacenadas detrás de los escudos de plexiglás.
  2. Rad Símbolo Resolver muestras IP a través de SDS-PAGE y blot a membrana de PVDF.
    1. Rad Símbolo Muestras de calor en tampón de carga a 95 ° C durante 2 min y se centrifuga durante 1 min a> 1000 x g para sedimentar las perlas.
    2. Rad Símbolo Preparar el módulo de la electroforesis en gel de proteínas en el banquillo radiactividad tras una pantalla de plexiglás.
    3. Rad Símbolo Cargue las muestras en un 3-8%-tris acetato de geles de SDS-PAGE.
      1. Este tipo de gel es adecuado para la resolución de alto peso molecular (HMW) proteínas. Otros tipos de gel también pueden ser adecuados, tal como un gel Bis-Tricina 4-20% o de Tris-glicina al 4-20% geles.
      2. Incluir un marcador de peso molecular que es adecuado para discernir tamaños de las proteínas HMW.
    4. <li> Rad Símbolo Realice la electroforesis a 150 V durante 1 hora.
    5. Rad Símbolo Después de la electroforesis, se extrae el gel de su carcasa de plástico y transferir el gel a un recipiente con tampón de transferencia Western Blot.
      1. Composición del tampón de transferencia de Western Blot: Tris 50 mM, glicina 40 mM, SDS al 0,04%, metanol al 20%.
      2. Rad Símbolo Cortar las partes del gel que sobresalen, tales como los separadores y así parte del fondo del gel que sobresale.
    6. Preparar un fluoruro de polivinilideno (PVDF) por gel por inmersión en metanol durante 1 min, a continuación, colocar en tampón de transferencia.
      1. Las membranas se cortaron a los s Tamaño ame como el gel, más un margen de 3 mm.
    7. Coloque un módulo de transferencia semiseca en el banco de la radiactividad y retirar la cubierta y la placa de electrodo superior.
    8. Rad Símbolo Preparar el sándwich de secante en la superficie del módulo de transferencia semiseca.
      1. Humedezca un extra grueso (2,5 mm de espesor, 7,5 x 10 cm de ancho) secante filtro en tampón de transferencia y el lugar en la placa inferior del módulo secante.
      2. Rad Símbolo Coloque la membrana de PVDF pre-mojado en el filtro secante.
      3. Rad Símbolo Coloque con cuidado el gel en la membrana de PVDF y eliminar cualquier burbuja de aire.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Completa el sándwich blot mojando un filtro secante grueso adicional en tampón de transferencia y el lugar en la placa inferior del módulo secante. Retire todo el aire burbujas eventualmente presentes en el sándwich de secante.
        Tenga en cuenta que la descripción dada aquí es compatible con el sistema de SD Trans-Blot de BioRad donde los electrodos son tales que las proteínas migran hacia abajo sobre la membrana. Otros sistemas secante también son compatibles con estos pasos con pequeñas adaptaciones, tales como los eventuales necesarios para tener en cuenta otra dirección secante o, en el caso de la transferencia del depósito, los residuos líquidos extra para ser eliminados de la misma forma que el tampón de electroforesis arriba.
    9. Rad Símbolo Retire el exceso de buffer con un tejido absorbente y colocar la placa superior y la cubierta de la semi-d ry secante módulo.
    10. Rad Símbolo Transferir las proteínas a 15 V durante 1-2 horas.
    11. Rad Símbolo Durante este tiempo, limpiar el módulo de electroforesis.
      1. Rad Símbolo Deshágase de los desechos radiactivos en cubos de basura dedicados que se quedarán almacenadas detrás de los escudos de plexiglás.
      2. Rad Símbolo Aclare la unidad de electroforesis con agua destilada (AD) y deseche el agua de enjuague en el depósito de residuos radiactivos líquidos.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> Después de la transferencia, retire la membrana de PVDF con las proteínas se transfirieron desde el módulo secante.
    13. Rad Símbolo Opcional: realizar una tinción de Ponceau S de proteínas borrados para visualizar las proteínas.
      1. Rad Símbolo Transfiera la mancha a un recipiente de incubación blot poco profunda que contiene la solución Ponceau S e incubar durante 5 min.
      2. Rad Símbolo Enjuague 2x rápidamente en la EA.
    14. Rad Símbolo Secar la membrana.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Realiza autorradiografía.
    1. Rad Símbolo Exponer la membrana a una placa fosforescencia durante 1-5 días.
    2. Rad Símbolo Lea el 32P fuera de la placa de la fosforescencia expuesta mediante un escáner fosforescencia Tormenta 840 o equivalente y guardar la imagen como un archivo tiff de alta resolución.
  4. Rad Símbolo Detectar los niveles de proteína a través de inmunodetección.
    1. Rad Símbolo Rehidratar las membranas sumergiéndolas brevemente en metanol, luego se transfieren a una mancha recipiente de incubación poco profunda con PBS. Rad Símbolo Bloquear las membranas en PBS-T (PBS con 0,1% de Triton) que contiene 5% de leche.
    2. Rad Símbolo Incubar los blots con anti-anticuerpo 13,16 LRRK2 o anticuerpo Anti Flag y proceso adicional con etapas de lavado apropiadas y de incubación de anticuerpo secundario.
    3. Rad Símbolo Lleve a cabo la detección de quimioluminiscencia para confirmar los niveles de proteína relativas de LRRK2.
  5. Cuantificar incorporación de 32 P en LRRK2.
    1. Realizar análisis densitométrico de las bandas en los autorradiogramas blot e inmunoreactividad utilizando el software apropiado, como el software ImageJ, un programa gratuito disponible en el Instit Nacionalutes de la web de la Salud ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Cálculo de los niveles de incorporación de fosfato como la relación de la señal autorradiográfica sobre el nivel de inmunoreactividad.

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Representative Results

Con el fin de comparar los niveles generales de fosforilación de LRRK1 y LRRK2 en las células, 3xFLAG etiquetada LRRK1 y LRRK2 se expresaron en células HEK293T 15. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos y se marcaron con 32P y se analizaron como se ha descrito anteriormente en el texto del protocolo. Figura 1 muestra los resultados representativos para el etiquetado metabólico de LRRK1 y LRRK2 en células HEK293T. Incorporación de fosfato radiactivo se observa tanto para LRRK1 y LRRK2. Tras la cuantificación de los niveles de P 32 normalizados para los niveles de proteína, medida por análisis densitométrico de la inmunodetección con el anticuerpo anti-flag, se encontró que LRRK1 tenía un nivel medio de fosforilación que es menor que LRRK2 en las condiciones ensayadas, aunque la significación estadística es no alcanzado (P> 0,05).

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Figura 1. El marcaje metabólico de LRRK1 y LRRK2. A. LRRK1 y LRRK2 expresan en células HEK293T se marcaron metabólicamente con 32 P, como se describe en el protocolo y los resultados secciones. Se muestra aquí son autorradiogramas representativos (panel superior) de la incorporación de 32 P, así como las transferencias de Western representativas (panel inferior) de LRRK1 y detección LRRK2 a través de sus etiquetas 3xFLAG. B. Cuantificación del marcaje metabólico comparativo de LRRK1 y LRRK2 (N = 4).

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Discussion

Este documento proporciona un protocolo básico para el ensayo de nivel de fosforilación general de LRRK1 y LRRK2 en líneas celulares mediante marcaje metabólico con 32P-ortofosfato. La estrategia general es sencillo. Etiquetados por afinidad proteínas LRRK se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unas pocas horas de incubación y todas las moléculas en la célula que contienen fosfatos, por lo tanto marcado radiactivamente. La etiqueta de afinidad (3xFLAG) se utiliza a continuación para aislar las proteínas LRRK de otros componentes celulares por inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados se separan luego a través de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y análisis de los fosfatos incorporados se realiza por autorradiografía (32 señal P) y de detección de Western (señal de proteína) de las proteínas en las manchas. Este protocolo debe ser distinguido del protocolo para medir au LRRK2tophosphorylation 17 en que el etiquetado de LRRK1 o LRRK2 se realiza en cultivo celular en vez de en una reacción de fosforilación in vitro con proteínas purificadas.

Cabe señalar que el protocolo detallado que se presenta aquí se puede ajustar para dar cabida a múltiples variaciones dependiendo de las necesidades experimentales. Por ejemplo, como el etiquetado es eficiente en la mayoría de líneas celulares de laboratorio comunes, este protocolo no está restringida al uso de la línea celular HEK293T. Además, otros marcadores de afinidad pueden ser utilizados como una alternativa a 3xFLAG, tales como HA, myc, V5, GFP u otras etiquetas 18 como múltiples etiquetas se pueden utilizar para LRRK1 eficiente inmunoprecipitado o LRRK2. En el caso de un anticuerpo específico de la proteína está disponible para la proteína que es adecuado para la inmunoprecipitación, como es el caso de LRRK2 11, esta se puede implementar también. Con un anticuerpo específico de la proteína de grado inmunoprecipitación, también es factible para llevar a cabo el etiquetado metabólico de LRRKLas proteínas expresadas de forma endógena en líneas celulares. En el caso de LRRK2, varios anticuerpos monoclonales se han descrito que puede inmunoprecipitación de LRRK2 endógena 19. Finalmente, el protocolo de marcaje metabólico, se describe aquí para LRRK1 y LRRK2 también puede ser adaptado a cualquier otra proteína que puede ser inmunoprecipitada a partir de líneas celulares utilizando la estrategia general descrito anteriormente.

Una consideración clave antes de realizar marcaje metabólico de proteínas en cultivo celular es cómo esta técnica se compara con otros métodos disponibles para determinar la fosforilación de proteínas celulares. Por ejemplo, la fosforilación en sitios específicos puede ser monitoreado por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo fosfo-específico. Este método sigue los pasos similares a los descritos aquí, con exclusión de los pasos de marcaje isotópico, y por esta razón, esta técnica es a menudo favorecida sobre marcaje metabólico con 32 P-ortofosfato cuando está disponible. El marcaje metabólico con 32 P-ortofosfato proporciona una señal que es representativa de la situación general de la fosforilación de la proteína, por lo tanto no puede proporcionar información sobre la fosforilación de sitios específicos. Para las proteínas con múltiples sitios de fosforilación, como es el caso para LRRK2 10,11, la técnica de marcaje metabólico proporciona una evaluación de un solo paso del nivel de fosforilación global que puede determinarse con anticuerpos fosfo-específicos sólo pendientes múltiples pasos de inmunodetección. Por ejemplo, LRRK2 es altamente fosforilado en su región interdominio ANK-LRR, es decir, los S910/S935/S955/S973 11,20 sitios, así como en otras regiones 10 incluyendo el sitio S1292 recientemente caracterizado 21. Con el fin de diseccionar a cabo las funciones de phosphosites individuales, se recomienda a preferir experimentos con anticuerpos específicos phosphosite. Por ejemplo phosphosite anticuerpos específicos han permitido discernir que los phosphosites S910/S935/S955/S973 son dephosphorylateD en varios mutantes patógenos tales como R1441C / G, Y1699C, I2020T, pero no en los G2019S 11,22, mientras que la enfermedad LRRK2 formas mutantes muestran en general niveles de fosfo-S1292 superiores 21. Sin embargo, marcaje metabólico son útiles para un número de otros estudios de fosforilación celular. El marcaje metabólico es siempre una técnica aplicable por ejemplo en los casos de los sitios de fosforilación desconocidos, o cuando fosfo-anticuerpos no están disponibles o de baja sensibilidad. Finalmente, marcaje metabólico permite la comparación de los niveles generales de fosforilación de diferentes proteínas (como se muestra aquí la comparación de los niveles de fosforilación celulares de LRRK1 y LRRK2, figura 1), una comparación que es difícil de ver con anticuerpos-phosphosite específica dadas las diferencias en la sensibilidad de un anticuerpo a otro .

En conclusión, el presente protocolo permite la evaluación eficiente de los niveles de fosforilación de las proteínas totales LRRK en las células. El protocolo puede ser fácilmente adaptado para supervisarfosforilación de cualquier otra proteína que se puede expresar en las células y se aisló por inmunoprecipitación. Se recomienda el uso de este protocolo cuando los anticuerpos-phosphosite específica no están disponibles para la proteína en estudio o como un paso en su validación. Este protocolo es especialmente útil cuando el objetivo experimental es comparar la fosforilación global de 2 o más proteínas diferentes como tales comparaciones a través de marcaje metabólico no están sesgadas por diferencias en la sensibilidad de la detección de la fosforilación de una proteína a otra. Específicamente para LRRK1 y LRRK2, esta técnica puede ser usado para monitorear comparativamente actividad dependiente de los cambios en la fosforilación de LRRK1 y LRRK2, dado que tales cambios han comenzado a ser descrito para LRRK2 11,13,23, mientras LRRK1 regulación de la fosforilación es poco conocido.

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Disclosures

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

También damos las gracias a la Fundación Michael J. Fox apoyar este estudio. Agradecemos a la Fundación de Investigación - Flandes FWO (proyecto FWO G.0666.09, senior comunión investigador a JMT), el proyecto Neuro-META TVN SBO/80020, la Universidad Católica de Lovaina (OT/08/052A y IOF-KP/07 / 001) por su apoyo. Esta investigación también fue financiada en parte por el Fondo Druwe-Eerdekens gestionados por la Fundación Rey Balduino a JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

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