Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

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Biology

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Summary

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

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Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

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Abstract

Leucina chinasi ricco ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi che condividono un dominio simile organizzazione, compreso un dominio chinasi serina-treonina, un complesso di Ras dominio proteine ​​(ROC), un C-terminale del dominio ROC (COR), e ricco di leucina e ripetizioni ankyrin simile al N-terminale. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione 1,2, mentre LRRK2 è implicato nella patogenesi della malattia di Parkinson 3,4. In questa relazione, vi presentiamo un protocollo per etichettare le proteine ​​LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i livelli di fosforilazione complessivi di queste due proteine ​​nelle cellule. In breve, l'affinità etichettato LRRK proteine ​​sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo pochiore di incubazione e tutte le molecole nella cella contenente fosfati sono così marcato radioattivamente. Via il tag di affinità (3xflag) le proteine ​​LRRK sono isolati dagli altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia (32 segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine ​​sulle macchie. Il protocollo può essere facilmente adattato per monitorare la fosforilazione di qualsiasi altra proteina che può essere espresso in cellule e isolato mediante immunoprecipitazione.

Introduction

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi multidominio che condividono un'organizzazione dominio simile. Entrambe le proteine ​​codificano una sequenza GTPasi simile alla famiglia di GTPasi Ras (Ras di proteine ​​complesse, o ROC), nonché un terminale C della ROC dominio (COR), classificando efficacemente entrambe le proteine ​​della famiglia di proteine ​​ROCO 5,6. N-terminale del dominio tandem ROC-COR, entrambe le proteine ​​codificare un dominio ripetizione ricca di leucina e un dominio ankyrin simile, mentre solo LRRK2 codifica un armadillo supplementare domein 6-8. C-terminale della ROC-COR, entrambe le proteine ​​condividono un dominio chinasi serina-treonina mentre solo LRRK2 codifica un dominio WD40 nella regione C-terminale 8. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione 1,2, mentre evidenze genetica ad un ruolo per LRRK2 nella patogenesi della malattia di Parkinson 3,4.

9-11. Anche se LRRK1 siti di fosforilazione cellulare devono ancora essere mappato, evidenze da studi che utilizzano phosphoprotein colorazione delle macchie di proteine ​​LRRK1 immunoprecipitata da cellule COS7 suggerisce che la proteina LRRK1 è fosforilata nelle cellule 12.

Questo documento fornisce un protocollo di base per saggiare il livello di fosforilazione generale di LRRK1 e LRRK2 in linee cellulari mediante marcatura metabolica con 32 P-ortofosfato. La strategia generale è semplice. Affinity tagged LRRK prins sono espressi in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo poche ore di incubazione e di tutte le molecole nella cellula contiene fosfati sono così marcato radioattivamente. Il tag di affinità (3xflag) viene quindi utilizzata per isolare le proteine ​​LRRK da altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia (32 segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine ​​sulle macchie.

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Protocol

Il presente protocollo utilizza radioattivo 32 P-marcato ortofosfato di seguire la fosforilazione cellulare di LRRK2. E 'importante tenere a mente che tutte le operazioni con i reagenti radioattive devono essere effettuate utilizzando adeguate misure di protezione per ridurre al minimo l'esposizione delle radiazioni radioattive per l'operatore e per l'ambiente. Composti contenenti isotopi che emettono radiazioni ionizzanti possono essere dannosi per la salute umana e licenze rigorosa e regolamenti a un controllo istituzionale e nazionale il loro uso. Gli esperimenti in questo protocollo sono stati effettuati seguendo una formazione sull'uso di radiazione open source presso Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) e seguendo le linee guida di buona pratica di laboratorio previsti dal dipartimento di salute, sicurezza e ambiente presso l'università. Diversi passaggi nel nostro protocollo sono ampiamente utilizzate come coltura cellulare, SDS-PAGE, western blotting e dato ecco i dettagli del protocollo applicato nel nostro laboratorio. E 'should segnala che precise condizioni sperimentali variano da laboratorio a laboratorio; pertanto misure specifiche per garantire la corretta manipolazione di materiale radioattivo devono essere adattate ad ogni nuovo ambiente di laboratorio.

L'uso di radiazioni open source è soggetta ad approvazione normativa preventiva e l'organismo di regolamentazione competente per le radiazioni open source nel laboratorio di ricerca varia da paese a paese. Gli utenti dovrebbero consultare il proprio responsabile della sicurezza di radiazione istituzionale al fine di garantire che le procedure conformi a norme e regolamenti locali. Informazioni su organismi di regolamentazione può essere trovato: in Belgio, l'Agenzia federale per il controllo nucleare ( http://www.fanc.fgov.be , sito in francese o olandese), nel Regno Unito, la Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / radiazioni / ionizzanti / index.htm ), negli Stati Uniti il Nuclear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), in Canada Canadian Commissione per la sicurezza nucleare ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), e in Germania Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Precauzioni di sicurezza relative a questo protocollo sono stati notati nel testo, evidenziate con il simbolo del trifoglio radioattivo ( Rad Symbol ).

1. Etichettatura metabolica delle cellule

  1. Preparazione delle cellule per l'etichettatura.
    1. Linee cellulari Culture HEK293T base alle condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2) in DMEM con siero fetale di vitello 8% e gentamicina.
    2. Espandere cellule sufficiente perottenere almeno 1 x 10 6 cellule per campione da testare.
    3. Trypsinize cellule e piastra out in 6 pozzetti (diametro 35 mm) a 10 6 cellule / pozzetto.
    4. 24 ore dopo la placcatura le cellule, esprimono la proteina 3xflag-LRRK2 tramite trasfezione o trasduzione mediata da vettori lentivirali.
      1. Per la trasfezione, mescolare per campione 4 microgrammi di DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmide 13-15 o pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmide 15) e 8 ml di polietilenimmina lineare (PEI lineare, 1 mg / ml) in 80 microlitri DMEM (senza aggiunte ). Lasciare complessa per 15-30 minuti quindi aggiungere complesso di cellule mescolando bene nel medio attuale.
      2. Per i vettori lentivirali mediata trasduzione, diluire vettori lentivirali codifica 3xflag-LRRK1 o -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, come regola generale, trasducono con il doppio di molte unità di trasduzione, cioè il numero di particelle di vettore funzionali, di lentivector quanto vi sono celle) nel terreno di coltura. Una descrizione del prodotto ione di LV-3xflag-LRRK1 / 2 è stato descritto in precedenza 15.
    5. Quando le cellule sono 80-100% confluenti (circa 48 ore dopo la trasfezione o trasduzione), lavare le cellule con preriscaldata (37 ° C) DMEM senza fosfati.
  2. Cellule Label con 32 P-orto-fosfato.
    1. Tenete a mente i principi generali di sicurezza quando si lavora con le radiazioni.
      1. Rad Symbol Eseguire tutte le operazioni con 32 P in un'area designata radiazioni.
      2. Rad Symbol Equipaggiamento personale di protezione adatto deve essere indossato - nell'ambito della procedura operativa standard nel nostro laboratorio questi includono camice da laboratorio, due paia di guanti e occhiali protettivi.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Tutti i lavori con 32 P dovrebbe essere schermato dagli utenti di 6 schermi mm perspex per minimizzare l'esposizione.
      4. Rad Symbol Dispositivi di monitoraggio personale devono essere sempre utilizzati - entro KUL tutti gli utenti radiazioni open source certificata indossa un badge pellicola attaccato al taschino del camice da laboratorio per monitorare l'esposizione alle radiazioni durante gli esperimenti.
      5. Rad Symbol Tutte le superfici sperimentali dovrebbero essere valutati per la radioattività prima e dopo l'uso con un contatore Geiger.
      6. Rad Symbol Tutti i materiali di consumo potenzialmente contaminati devono essere smaltiti in stretta aderenza alle linee guida istituzionali per rasmaltimento dei rifiuti dioactive.
    2. Sotto un flusso laminare, preparare un tubo Falcon con 2,1 ml di DMEM senza fosfati (preriscaldata a 37 ° C) per 6 pozzetti di cellule di etichetta.
      1. Per esempio, le cellule di etichette in tutti i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti, preparare 12,6 ml di mezzo (= 6 x 2.1). Questo è prevedere 2 medie ml da utilizzare per piastra da 6 pozzetti e di cellule con un eccesso del 5% in volume.
    3. Rad Symbol Preparare la panchina a cui verranno eseguiti gli esperimenti con radiazioni ionizzanti. Lo spazio di lavoro è coperto da una stuoia fuoriuscita su cui uno strato protettivo di materiale assorbente viene collocato. Nel caso in cui si utilizza un rivestimento con una superficie impermeabile, posizionare con il lato assorbente alto.
    4. Rad Symbol Anche fornire perun vaso Perspex sullo spazio di lavoro e posizionare il tubo di mezzo privo di fosfato in esso.
    5. Rad Symbol Prendete il contenitore rivestito di piombo con il flaconcino di 32 ortofosfato P etichettato fuori dal frigorifero e portarla al banco di radioattività. Monitorare il contenitore per contaminazione radioattiva esterna utilizzando un contatore Geiger.
    6. Rad Symbol Diluire 32 P etichettato ortofosfato nel tubo di DMEM senza fosfati ad una concentrazione di 24 uCi / ml.
      1. Nota: a 2 ml per piastra da 6 pozzetti e di cellule, questo corrisponde a 5 uCi 32 P etichettato ortofosfato / cm 2 di cellule in coltura.
      2. Rad Symbol Mantenereil tubo nel vaso perspex.
    7. Rad Symbol Chiudere il contenitore con il resto del 32 P etichettato ortofosfato e sostituire in frigo.
    8. Rad Symbol Rimuovere le 6 pozzetti con cellule da marcate dal termostato e posto in panchina radioattività.
    9. Rad Symbol Rimuovere medio surnatante e gettarlo. Aggiungere 2 ml del mezzo senza fosfati contenenti 32 P etichettato ortofosfato / bene.
    10. Rad Symbol Posizionare le piastre di coltura in una scatola di Perspex quindi monitorare il contenitore for contaminazione radioattiva esterna utilizzando un contatore Geiger.
    11. Rad Symbol Trasferire la scatola in perspex con celle di un incubatore cellula eucariotica dedicato alla marcatura metabolica isotopica.
    12. Rad Symbol Incubare per 1-20 ore a 37 ° C in 5% CO 2.
      1. In generale, è consigliato un tempo incorporazione di 3 ore o più. Il tempo ottimale di incubazione può essere valutata mediante esperimenti di corso di tempo per ogni proteina specifica, se lo desideri.
    13. Rad Symbol Optional: trattamento di cellule con il composto.
      1. In esperimenti con trattamento composto (ad esempio un inibitore della chinasi), una fase di trattamento composto è incluso dopo un initial tempo di incubazione, senza compound per permettere l'etichettatura. Dopo il tempo di incubazione desiderato, la casella Perspex contenente le piastre di coltura vengono rimossi dal termostato e portato al banco radioattività.
      2. Rad Symbol Medio etichettatura viene rimosso e sostituito con terreno privo di fosfato preriscaldata in cui il composto è diluito alla concentrazione desiderata. Scartare medio in un tubo da 50 ml per la raccolta dei rifiuti, che viene inserito nel vaso Perspex.
      3. Rad Symbol Le cellule sono sostituiti nella casella Perspex e poste in incubatrice cella per il tempo di contatto desiderato.
  3. Rad Symbol Raccogliere lisati di labecellule led.
    1. Rad Symbol Rimuovere medio da cellule e gettare nel tubo di raccolta dei rifiuti che si trova nel vaso perspex.
    2. Rad Symbol Sciacquare le cellule 2x con ghiaccio TBS freddo (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4, 2 ml / risciacquo), scartando la soluzione di risciacquo in un tubo di raccolta dei rifiuti messi in vaso perspex.
    3. Rad Symbol Aggiungere 0,5 ml di ghiaccio freddo immunoprecipitazione (IP) tampone di lisi a ciascun pozzetto e raccogliere lisato pipettando lisato su e giù per allentare tutte le cellule lisate.
      1. Preparare il volume richiesto di IP tampone di lisi (0,5 ml / campione più 5% in eccesso) prima del tempo, aggiungendo il cocktail di inibitori delle proteasi e fosfatasiinibitore cocktail fresco appena prima dell'uso.
      2. La composizione del tampone di lisi è Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, glicerolo 10%, inibitori della proteasi e cocktail inibitore fosfatasi cocktail.
    4. Rad Symbol Trasferire il lisato in una provetta e incubare in ghiaccio per almeno 10 min.
    5. Rad Symbol Centrifugare lisati in una microcentrifuga a> 5.000 xg per 10 min.
    6. Rad Symbol Smaltire i rifiuti radioattivi nei cestini dei rifiuti dedicati che sono memorizzate dietro gli scudi in plexiglas.

2. Analizzare etichettatura delle proteine ​​di interesse

  1. Rad Symbol Isolare proteina di interesse da immunopurificazione (IP).
    1. Rad Symbol Trasferire le provette da microcentrifuga con lisati centrifugati torna al ghiaccio e pipetta il surnatante in una provetta contenente 10 ml di volume letto di equilibrate agarosio flag-M2.
      1. Preparare le provette con equilibrate flag-M2 agarosio perline prima del tempo.
      2. Per questo, pipetta un volume di bandiera-M2 liquami agarosio corrispondente a 10 microlitri volume del letto per campione più un eccesso del 5%.
        1. Generalmente, a 10 microlitri volume del letto di perline corrisponde a 20 microlitri slurry. Consultare la scheda prodotto per maggiori dettagli.
      3. Equilibrare i beads di risciacquo 3x in 10 volumi (rispetto al volume del letto) di tampone di lisi IP.
      4. Distribuire perline equilibrate in modo uniforme a 10 microlitri di volume letto / tubo in tante provette come ci sono campioni. Etichettare le provette con un identificatore per ciascun campione.
    2. Rad Symbol Trasferire le provette da microcentrifuga a 50 ml provette (circa 6 microcentrifuga tubes/50 tubo ml) contrassegnati con un simbolo del trifoglio radioattivo e tenere in ghiaccio.
    3. Rad Symbol Campioni di trasferirli su un dispositivo rotante dietro uno scudo Perspex nell'area designata di una cella frigorifera per la fine rispetto a fine miscelazione a 4 ° C per 1-20 ore.
    4. Rad Symbol Trasferire i campioni di uno spazio di lavoro designato su ghiaccio.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spin giù la proteina legata flag-M2 agarosio in una microcentrifuga (1.000 xg, 1 min) e scartare il surnatante in un tubo di raccolta dei rifiuti.
    6. Rad Symbol Lavare le proteine ​​legato flag-M2 agarosio risospendendo in 1 ml IP tampone di lavaggio.
      1. Composizione del tampone di lavaggio IP: Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Si raccomanda di includere anche gli inibitori della proteasi e fosfatasi nel tampone di lavaggio per le proteine ​​sensibili alla degradazione da proteasi co-purificazione o di defosforilazione da fosfatasi co-purificazione.
      2. Rad Symbol Spin giù le proteine ​​legato flag-M2 agarosio in una microcentrifuga (1.000 xg, 1 min) e scartare il surnatante in una raccolta di rifiutitubo zione.
      3. Rad Symbol Ripetere il 3x fase di lavaggio.
    7. Rad Symbol Dopo i lavaggi, risospendere le sfere in 1 ml IP tampone di lavaggio (Tris 25 mM pH 7.5, MgCl2 10 mM, ditiotreitolo (DTT) 2 mM, Triton 0,02%, beta-glicerofosfato 5 mm, Na 3 VO 4 0,1 mm).
    8. Rad Symbol Spin giù le proteine ​​legate flag-M2 agarosio in una microcentrifuga (1.000 xg, 1 min) e scartare il surnatante in un tubo di raccolta dei rifiuti. Rimuovere tutti tampone in eccesso.
    9. Rad Symbol Risospendere le sfere in 40 & m(Tris-HCl 160 mM pH 6,8, SDS 2%, DTT 0,2 M, glicerolo 40%, blu di bromofenolo 2 mg / ml) l di tampone campione SDS loading IP; u.
      1. I campioni possono essere analizzati immediatamente o conservate in un congelatore a -20 ° C per ulteriore analisi.
        1. Rad Symbol Per la conservazione dei campioni a -20 ° C, posto i campioni in contenitori di tubo o le scatole in una scatola di Perspex in una radioattivo simbolo del trifoglio freezer etichetta dedicata per lo stoccaggio di campioni radioattivi.
    10. Rad Symbol Smaltire i rifiuti radioattivi nei cestini dei rifiuti dedicati che sono memorizzate dietro gli scudi in plexiglas.
  2. Rad Symbol Risolvere i campioni IP tramite SDS-PAGE e blot a membrana PVDF.
    1. Rad Symbol Campioni di calore in tampone di caricamento a 95 ° C per 2 minuti e centrifugare per 1 min a> 1.000 xg per agglomerare le perline.
    2. Rad Symbol Preparare il modulo gel elettroforesi proteine ​​in panchina radioattività dietro uno schermo Perspex.
    3. Rad Symbol Caricare i campioni su un 3-8% Tris-acetato SDS-PAGE gel.
      1. Questo tipo di gel è adatto per risolvere alto peso molecolare (HMW) proteine. Altri tipi di gel possono inoltre essere idonei, ad esempio un 4-20% Bis-Tricina gel o Tris-glicina 4-20% gel.
      2. Includere un marcatore di peso molecolare che è adatto per discernere le dimensioni delle proteine ​​HMW.
    4. <li> Rad Symbol Eseguire elettroforesi a 150 V per 1 ora.
    5. Rad Symbol Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel dal suo involucro di plastica e trasferire il gel in un contenitore con Western blotting buffer di trasferimento.
      1. Composizione del Western blotting buffer di trasferimento: Tris 50 mM, glicina 40 mM, SDS 0,04%, metanolo 20%.
      2. Rad Symbol Tagliare le parti del gel che sporgono come i separatori e così porzione inferiore del gel che sporge.
    6. Preparare un fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana per gel mediante immersione in metanolo per 1 minuto, poi posto in tampone di trasferimento.
      1. Le membrane sono tagliati ai s dimensioni ame come il gel più un margine di 3 mm.
    7. Posizionare un modulo blotting semi-dry in panchina radioattività e rimuovere il coperchio e la piastra di elettrodo superiore.
    8. Rad Symbol Preparare il panino assorbente sulla superficie del modulo blotting semi-dry.
      1. Bagnare un forte spessore (2,5 millimetri di spessore, 7,5 x 10 cm di larghezza) assorbente filtro buffer di trasferimento e posto sulla piastra inferiore del modulo blotting.
      2. Rad Symbol Posizionare la membrana PVDF pre-bagnato sul filtro assorbente.
      3. Rad Symbol Posizionare con cura il gel sulla membrana PVDF ed eliminare eventuali bolle d'aria.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Completa il panino macchia bagnando un filtro assorbente di spessore in più nel buffer di trasferimento e posto sulla piastra inferiore del modulo assorbente. Rimuovere tutta l'aria bolle eventualmente presenti nel panino assorbente.
        Si prega di notare che la descrizione qui proposta è compatibile con il sistema SD BioRad trans-blot cui elettrodi sono tali che le proteine ​​migrano verso il basso sulla membrana. Altri sistemi blotting sono compatibili anche con questi passaggi con adattamenti minori, come quelli eventualmente necessarie per tener conto un'altra direzione blotting o, nel caso di blotting serbatoio supplementare rifiuti liquidi da smaltire nello stesso modo come buffer per elettroforesi sopra.
    9. Rad Symbol Rimuovere tutto il tampone in eccesso con carta assorbente e posizionare la piastra superiore e la copertura della semi-d ry modulo assorbente.
    10. Rad Symbol Trasferire le proteine ​​a 15 V per 1-2 ore.
    11. Rad Symbol Durante questo tempo, ripulire il modulo elettroforesi.
      1. Rad Symbol Smaltire i rifiuti radioattivi nei cestini dei rifiuti dedicati che sono memorizzate dietro gli scudi in plexiglas.
      2. Rad Symbol Sciacquare il modulo elettroforesi con acqua distillata (AD) ed eliminare l'acqua di lavaggio nel contenitore di rifiuti liquidi radioattivi.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> Dopo il trasferimento, rimuovere la membrana PVDF con proteine ​​macchiati dal modulo blotting.
    13. Rad Symbol Facoltativo: eseguire una colorazione Ponceau S delle proteine ​​macchiati di visualizzare le proteine.
      1. Rad Symbol Trasferire il blot di una nave incubazione superficiale blot contenente soluzione Ponceau S e incubare per 5 min.
      2. Rad Symbol Sciacquare 2x rapidamente in AD.
    14. Rad Symbol Essiccare la membrana.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Esegui autoradiografia.
    1. Rad Symbol Esporre la membrana ad una piastra fosforescenza per 1-5 giorni.
    2. Rad Symbol Leggi la 32P al largo della piastra fosforescenza esposto utilizzando uno scanner tempesta 840 fosforescenza o equivalente e salvare l'immagine come tiff alta risoluzione.
  4. Rad Symbol Rileva i livelli di proteina tramite immunorivelazione.
    1. Rad Symbol Reidratare le membrane per immersione brevemente in metanolo, poi il trasferimento a una macchia nave incubazione superficiale con PBS. Rad Symbol Bloccare le membrane in PBS-T (PBS con 0,1% Triton) contenente 5% di latte.
    2. Rad Symbol Incubare le macchie con anti-LRRK2 anticorpo 13,16 o anti bandiera di anticorpi e di processo ulteriormente con adeguate operazioni di lavaggio e incubazione anticorpo secondario.
    3. Rad Symbol Eseguire il rilevamento chemiluminescenza di confermare i livelli di proteina relativi di LRRK2.
  5. Quantificare incorporazione di 32 P in LRRK2.
    1. Eseguire l'analisi densitometrica delle bande sulle autoradiogrammi macchia e immunoreactivity utilizzando software appropriato, come il software ImageJ, un programma freeware disponibile sul Istit Nazionalesce del sito web Salute ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Calcolare i livelli costitutivi fosfato come il rapporto tra il segnale autoradiografia sopra il livello immunoreattività.

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Representative Results

Al fine di confrontare i livelli di fosforilazione complessivi di LRRK1 e LRRK2 nelle cellule, 3xflag etichettato LRRK1 e LRRK2 sono stati espressi nelle cellule HEK293T 15. Le cellule sono state coltivate in piastre da 6 pozzetti e marcate con 32P ed analizzati come descritto sopra nel testo protocollo. Figura 1 mostra risultati rappresentativi per marcatura metabolica di LRRK1 e LRRK2 in cellule HEK293T. Incorporazione di fosfato radioattivo viene osservata sia per LRRK1 e LRRK2. Su quantificazione dei 32 livelli P normalizzati ai livelli proteici come misurato mediante analisi densitometrica del immunodetezione con anticorpo anti-bandiera, si è trovato che LRRK1 aveva un livello medio di fosforilazione che è inferiore LRRK2 nelle condizioni testate, sebbene la significatività statistica è non raggiunto (P> 0.05).

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Figura 1. Marcatura metabolica di LRRK1 e LRRK2. A. LRRK1 e LRRK2 espresse nelle cellule metabolicamente HEK293T sono stati etichettati con 32 P come descritto nel protocollo e risultati sezioni. Rappresentati qui sono autoradiogrammi rappresentativi (pannello superiore) del 32 P incorporazione così come Western blot rappresentativi (pannello inferiore) di LRRK1 e rilevazione LRRK2 attraverso i loro tag 3xflag. B. Quantificazione della marcatura metabolica comparativa dei LRRK1 e LRRK2 (N = 4).

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Discussion

Questo documento fornisce un protocollo di base per saggiare il livello di fosforilazione generale di LRRK1 e LRRK2 in linee cellulari mediante marcatura metabolica con 32 P-ortofosfato. La strategia generale è semplice. Affinity etichettato LRRK proteine ​​sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo poche ore di incubazione e di tutte le molecole nella cellula contiene fosfati sono così marcato radioattivamente. Il tag di affinità (3xflag) viene quindi utilizzata per isolare le proteine ​​LRRK da altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia (32 segnale P) e rivelazione Western (segnale proteina) delle proteine ​​sulle macchie. Questo protocollo deve essere distinto dal protocollo per misurare au LRRK2tophosphorylation 17 dal fatto che l'etichettatura di LRRK1 o LRRK2 viene eseguita in coltura cellulare piuttosto che in una reazione di fosforilazione in vitro con proteine ​​purificate.

Va osservato che il protocollo dettagliato qui presentata può essere regolata per accogliere per diverse variazioni a seconda delle esigenze sperimentali. Per esempio, come etichettatura è efficace nella maggior parte comuni linee cellulari di laboratorio, questo protocollo non è limitato all'uso della linea cellulare HEK293T. Inoltre, altri tag di affinità possono essere utilizzati come alternativa alla 3xflag, come HA, myc, V5, GFP o altri tag 18 come tag multipli possono essere usati per LRRK1 efficiente immunoprecipitato o LRRK2. Nel caso un anticorpo specifico per la proteina è disponibile per la proteina che è adatto per immunoprecipitazione, come è il caso per LRRK2 11, questo può essere implementato come bene. Con un anticorpo specifico per la proteina di grado immunoprecipitazione, è anche fattibile effettuare marcatura metabolica di LRRKendogenamente proteine ​​espresse in linee cellulari. Nel caso di LRRK2, numerosi anticorpi monoclonali sono stati descritti che possono immunoprecipitazione di LRRK2 endogeno 19. Infine, il protocollo di marcatura metabolica, descritta qui per LRRK1 e LRRK2 può anche essere adattato a qualsiasi altra proteina che può essere immunoprecipitata da linee cellulari utilizzando la strategia generale sopra descritto.

Una considerazione chiave prima di eseguire marcatura metabolica delle proteine ​​nelle cellule in coltura è come questa tecnica paragona ad altri metodi disponibili per determinare cellulare fosforilazione proteica. Per esempio, la fosforilazione in siti specifici può essere monitorato mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo specifico-fosfo. Questo metodo segue i passi simili a quelli qui descritti, escluse le fasi di etichettatura isotopici, e per questo motivo, questa tecnica è spesso favorita rispetto marcatura metabolica con 32 P-ortofosfato quando è disponibile. Marcatura metabolica con 32 P-ortofosfato fornisce un segnale rappresentativo dello stato generale fosforilazione della proteina, quindi non può fornire informazioni sulla fosforilazione di siti specifici. Per le proteine ​​con diversi siti di fosforilazione, come è il caso per LRRK2 10,11, la tecnica di marcatura metabolica fornisce una valutazione di un passo del livello di fosforilazione complessivo che può accertata con anticorpi specifici per fosfo soltanto in attesa di più passaggi immunorivelazione. Per esempio, LRRK2 è altamente fosforilata nella sua regione interdomain ANK-LRR, ovvero i siti S910/S935/S955/S973 11,20 così come in altre regioni 10 incluso il sito S1292 recentemente caratterizzato 21. Per analizzare i ruoli dei singoli phosphosites, si raccomanda di preferire esperimenti con anticorpi specifici phosphosite. Per esempio phosphosite anticorpi specifici hanno permesso di discernere che i phosphosites S910/S935/S955/S973 sono defosforilared in diversi mutanti patogeni quali R1441C / G, Y1699C, I2020T, ma non nelle G2019S 11,22, mentre la malattia LRRK2 forme mutanti mostrano generalmente più alti livelli di fosfo-S1292 21. Tuttavia, marcatura metabolica sono utili per una serie di altri studi di fosforilazione cellulare. Marcatura metabolica è sempre una tecnica applicabile ad esempio nei casi di siti di fosforilazione sconosciuti, o quando fosfo-anticorpi non sono disponibili o di bassa sensibilità. Infine, marcatura metabolica permette di confrontare i livelli di fosforilazione complessivi di proteine ​​diverse (come qui mostrato confrontando i livelli di fosforilazione cellulari di LRRK1 e LRRK2, figura 1), un confronto che è difficile da fare con anticorpi specifici phosphosite proposta differenze nella sensibilità di un anticorpo ad un altro .

In conclusione, la presente protocollo consente la valutazione efficiente dei livelli di fosforilazione di proteine ​​totali LRRK nelle cellule. Il protocollo può essere facilmente adattato per monitorarefosforilazione di qualsiasi altra proteina che può essere espresso in cellule e isolato mediante immunoprecipitazione. L'uso di questo protocollo è consigliato quando gli anticorpi specifici per phosphosite non sono disponibili per la proteina in studio o come un passo nella loro validazione. Questo protocollo è particolarmente utile quando l'obiettivo sperimentale è confrontare il grado di fosforilazione di 2 o più proteine ​​diverse come tali confronti mediante marcatura metabolica non sono influenzati da differenze nella sensibilità di rilevazione di fosforilazione di una proteina all'altra. Specificamente per LRRK1 e LRRK2, questa tecnica può essere utilizzata per monitorare relativamente cambi di attività dipendenti nella fosforilazione di LRRK1 e LRRK2, dato che tali cambiamenti hanno cominciato a essere descritto per LRRK2 11,13,23, mentre LRRK1 regolamento fosforilazione è poco conosciuta.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Siamo anche grati alla Michael J. Fox Foundation a sostegno di questo studio. Ringraziamo la Fondazione di Ricerca - Fiandre FWO (progetto FWO G.0666.09, ricercatore senior fellowship a JMT), l'IWT SBO/80020 progetto Neuro-TARGET, la KU Leuven (OT/08/052A e IOF-KP/07 / 001) per il loro sostegno. Questa ricerca è stata sostenuta anche in parte dal Fondo Druwé-Eerdekens gestiti dalla Fondazione Re Baldovino a JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

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