Metabolisk Märkning av Leucin Rich Upprepa Kinaser 1 och 2 med radioaktivt fosfat

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är multidomänproteiner som kodar både GTPas och kinasdomäner och som är fosforylerad i celler. Här presenterar vi ett protokoll för att märka LRRK1 och LRRK2 i celler med 32p ortofosfat, vilket ger en möjlighet att mäta sina övergripande cellulära phophorylation nivåer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är paraloger som delar en liknande organisation domän, inklusive ett serin-treonin-kinasdomän, en Ras av komplexa proteiner domän (ROC), en C-terminal av ROC-domänen (COR), och leucin-rika och ankyrin-liknande upprepningar vid N-terminus. De exakta cellulära roller LRRK1 och LRRK2 har ännu inte klarlagd, men LRRK1 har varit inblandad i tyrosinkinasreceptor signalering 1,2, medan LRRK2 är inblandad i patogenesen av Parkinsons sjukdom 3,4. I denna rapport presenterar vi ett protokoll för att märka LRRK1 och LRRK2 proteiner i celler med 32p ortofosfat, vilket ger ett medel för att mäta den totala fosforyleringsnivåer av dessa två proteiner i celler. I korthet tagged affinitet LRRK proteiner uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter endast ett fåtaltimmars inkubering och alla molekyler i den cell som innehåller fosfater därigenom radioaktivt märkt. Via affinitetsmärkning (3xflag) de LRRK proteiner isolerade från andra cellkomponenter genom immunfällning. Immunoprecipitat separeras sedan genom SDS-PAGE, blottades till PVDF-membran och en analys av de införlivade fosfater utförs genom autoradiografi (32 P-signal) och western-detektion (protein-signal) av proteinerna på blotten. Protokollet kan lätt anpassas för övervakning av fosforylering av något annat protein som kan uttryckas i celler och isolerades genom immunfällning.

Introduction

Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är multidomain paraloger som delar en liknande organisation domän. Båda proteinerna koda ett GTPas-sekvens besläktad med Ras-familjen av GTPases (RAS av komplexa proteiner, eller ROC) såväl som en C-terminal av ROC-domänen (COR), vilket effektivt klassificera båda proteinerna till ROCO proteinfamiljen 5,6. N-terminalen av domänen tandem ROC-COR, båda proteinerna koda en leucinrik upprepningsdomän samt en ankyrin-liknande domän, medan endast LRRK2 kodar en extra bält Domein 6-8. C-terminal av ROC-COR, båda proteinerna delar ett serin-treonin-kinas-domänen medan endast LRRK2 kodar ett WD40 domänen i den C-terminala regionen 8. De exakta cellulära roller LRRK1 och LRRK2 har ännu inte klarlagd, men LRRK1 har varit inblandad i tyrosinkinasreceptor signalering 1,2, medan den genetiska bevisen pekar på en roll för LRRK2 i patogenesen av Parkinsons sjukdom 3,4.

9-11. Även LRRK1 cellulära fosforyleringssäten har ännu inte kartläggas, tyder allt från studier med fosfoprotein färgning av blöts av immunoprecipiterade LRRK1 protein från COS7 celler som LRRK1 protein fosforyleras i cellerna 12.

Detta dokument ger en grundläggande protokoll för analys av allmän fosforylering nivån LRRK1 och LRRK2 i cellinjer med hjälp av metabolisk märkning med 32 P-ortofosfat. Den övergripande strategin är okomplicerad. Affinity tagged LRRK proteins uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter bara några timmars inkubation och alla molekyler i cellen som innehåller fosfater är därmed radioaktivt märkt. Den affinitetsmarkör (3xflag) används sedan för att isolera de LRRK proteiner från andra cellulära komponenter genom immunoutfällning. Immunoprecipitat separeras sedan genom SDS-PAGE, blottades till PVDF-membran och en analys av de införlivade fosfater utförs genom autoradiografi (32 P-signal) och western-detektion (protein-signal) av proteinerna på blotten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nuvarande protokollet använder radioaktivt 32 P-märkt ortofosfat att följa cellulär fosforylering av LRRK2. Det är viktigt att komma ihåg att all verksamhet med radioaktiva reagenser bör utföras med lämpliga skyddsåtgärder för att minimera exponeringen för radioaktiv strålning till operatören och miljön. Föreningar med isotoper som avger joniserande strålning kan vara skadliga för människors hälsa och strikt tillståndsgivning och regler på en institutionell och nationell kontroll nivå deras användning. Experimenten i detta protokoll genomfördes efter avslutad utbildning i öppen källkod strålning används vid Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) och följa riktlinjerna för god laboratoriesed som tillhandahålls av hälso-, säkerhets-och miljö-avdelningen på universitetet. Flera steg i våra protokoll är spridda såsom cellodling, SDS-PAGE, western blotting och ges här är detaljer i protokollet som används i vårt laboratorium. Det ärhould noteras att exakta experimentella förhållanden varierar mellan olika laboratorier, därför särskilda åtgärder för att säkerställa korrekt hantering av radioaktivt material skall anpassas till varje ny laboratoriemiljö.

Användning av öppen källkod strålning är föremål för förhandsgodkännande och den tillsynsmyndighet som ansvarar för öppen källkod strålning i laboratorium forskning varierar från land till land. Användarna bör rådgöra med sin institutionella strålning skyddsombud för att säkerställa att förfarandet överensstämmer med lokala regler och föreskrifter. Information om tillsynsorgan finns: i Belgien, den federala myndigheten för Nuclear Control ( http://www.fanc.fgov.be , hemsida på franska eller nederländska), i Förenade kungariket, Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / strålning / joniserande / index.htm ), i USA i Nuclear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), i Kanada Canadian Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), och i Tyskland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Säkerhetsåtgärder som är relevanta för detta protokoll har noterats i texten, markeras med det radioaktiva treklöversymbol ( Rad Symbol ).

1. Metabolisk märkning av celler

  1. Förbered celler för märkning.
    1. Kultur HEK293T cellinjer i enlighet med standardodlingsförhållanden (37 ° C, 5% CO2) i DMEM med 8% fetalt kalvserum och gentamycin.
    2. Expandera celler tillräckligt för atterhålla minst 1 x 10 6 celler per prov för att testa.
    3. Trypsinisera celler och platta ut i 6-brunnsplattor (35 mm diameter) vid 10 6 celler / brunn.
    4. 24 timmar efter bordläggning ut celler, uttrycker 3xflag-LRRK2 protein via transfektion eller lentivirusvektor medierad transduktion.
      1. För transfektion, blanda per prov 4 | ig DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmiden 13-15 eller pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmid-15) och 8 jil av linjär polyetylenimin (linjär PEI, 1 mg / ml) i 80 | al DMEM (utan tillsatser ). Låt det komplexa för 15 till 30 minuter tillsätt sedan komplexet till cellerna genom att blanda väl in i mediet närvarande.
      2. För lentivirusvektor medierad transduktion, späd lentivirusvektor kodning 3xflag-LRRK1 eller -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, som en tumregel, omvandla med dubbelt så många transducerande enheter, det vill säga antalet funktionella vektorpartiklar, av lentivector som det finns celler) in i odlingsmediet. En beskrivning av produkten ion av LV-3xflag-LRRK1 / 2 har tidigare beskrivits 15.
    5. När celler är 80-100% konfluenta (ungefär 48 timmar efter transfektion eller transduktion), skölj celler med förvärmd (37 ° C) DMEM utan fosfater.
  2. Märknings celler med 32 P-ortofosfat.
    1. Kom ihåg allmänna principer för säkerhet vid arbete med strålning.
      1. Rad Symbol Utför all verksamhet med 32p i en utsedd strålningsområdet.
      2. Rad Symbol Lämplig personlig skyddsutrustning skall användas - inom ramen för standardförfarande i vårt laboratorium dessa inkluderar labbrock, dubbla handskar och skyddsglasögon.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Allt arbete med 32p bör avskärmas från användarna med 6 mm Perspex-skärmar för att minimera exponeringen.
      4. Rad Symbol Personlig övervakningsutrustning ska alltid användas - inom KUL alla certifierade öppen källkod strålning användaren bär en film märke fäst på bröstfickan på labbrock att övervaka strålningsexponeringen under experiment.
      5. Rad Symbol Alla experimentella ytor bör utvärderas för radioaktivitet före och efter användning med en geigermätare.
      6. Rad Symbol Alla potentiellt förorenade förbrukningsvaror ska kasseras i strikt följsamhet till institutionella riktlinjer för rabortskaffande dioactive avfall.
    2. I dragskåp, förbereda en Falcon rör med 2,1 ml DMEM utan fosfater (förvärmda till 37 ° C) per 6-brunnar av celler till etiketten.
      1. Till exempel, för att märka celler i alla brunnar i en 6-brunnsplatta bereds 12,6 ml medium (= 6 x 2,1). Detta är för att ge 2 ml medium som skall användas per 6-brunnars platta brunn av celler med ett 5% överskott i volym.
    3. Rad Symbol Förbered bänk vid vilken experimenten med joniserande strålning kommer att utföras. Den arbetsutrymmet är täckt av en spillmatta på vilken en skyddsfilm av absorberande material placeras. Om du använder ett foder med ett vattentätt underlag, lägg den med den absorberande sidan uppåt.
    4. Rad Symbol Även föreskrivaen Perspex burk på arbetsområdet och placera röret i fosfatfritt medium i det.
    5. Rad Symbol Ta ledningen fodrad behållare med flaskan med 32p märkt ortofosfat ur kylskåpet och ta med den till radioaktiviteten bänken. Övervaka behållaren för extern radioaktiv förorening med hjälp av en geigermätare.
    6. Rad Symbol Späd 32 P-märkt fosfat i röret av DMEM utan fosfater i en koncentration av 24 ^ Ci / ml.
      1. Notera: vid 2 ml per 6-brunnar väl av celler, motsvarar detta 5 ^ Ci 32P märkt ortofosfat / cm 2 av odlade celler.
      2. Rad Symbol Hållröret i Perspex burk.
    7. Rad Symbol Förslut behållaren med resten av 32 P-märkt ortofosfat och ersätta i kylskåpet.
    8. Rad Symbol Ta bort de sex-brunnars plattor med celler som skall märkas från inkubatorn och placera på radioaktivitet bänken.
    9. Rad Symbol Avlägsna mellan supernatanten och kasta. Tillsätt 2 ml fosfatfritt medium innehållande 32 P-märkt ortofosfat / brunn.
    10. Rad Symbol Placera odlingsplattor i en plexiglaslåda sedan övervaka behållaren for extern radioaktiv förorening med hjälp av en geigermätare.
    11. Rad Symbol Överför Perspex box med celler till en eukaryot cell inkubator tillägnad isotop metabolisk märkning.
    12. Rad Symbol Inkubera i 1-20 h vid 37 ° C i 5% CO2.
      1. I allmänhet är ett införlivande tid av 3 h eller mer rekommenderas. Den optimala inkubationstiden kan bedömas genom tiden kurs experiment för varje specifikt protein som önskas.
    13. Rad Symbol Tillval: behandla celler med förening.
      1. I experiment med föreningsbehandling (till exempel en kinas-hämmare), en förening behandlingssteg inkluderas efter en initial inkubationstid utan föreningen för att medge märkning. Efter den önskade inkubationstiden, är Perspex låda innehållande odlingsplattorna avlägsnades från inkubatorn och bringades till den radioaktivitet bänken.
      2. Rad Symbol Märkningsmediet avlägsnades och ersattes med förvärmt fosfatfritt medium till vilket föreningen spädes vid den önskade koncentrationen. Kassera medium i ett 50 ml rör för uppsamling som är placerad i den Perspex burk.
      3. Rad Symbol Celler är ersatta i plexiglaslåda och placeras i cellinkubator för den önskade kontakttiden.
  3. Rad Symbol Samla lysat av labeledda celler.
    1. Rad Symbol Avlägsna mediet från cellerna och kassera in i avfallsuppsamlingsröret, som är placerad i Perspex burk.
    2. Rad Symbol Skölj cellerna 2x med iskall TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, 2 ml / sköljning), och kasta bort sköljlösningen till en avfallsuppsamlingsröret placerades i Perspex burk.
    3. Rad Symbol Tillsätt 0,5 ml iskall immunoprecipitation (IP) lyseringsbuffert i varje brunn och samla lysat genom pipettering lysat upp och ned för att lossa alla lyserade celler.
      1. Förbered erforderlig volym IP lyseringsbuffert (0,5 ml / prov plus 5% överskott) i förväg, lägga till proteasinhibitorcocktail och fosfatasinhibitor cocktail färsk strax före användning.
      2. Sammansättningen av lysbuffert är Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton 1%, glycerol 10%, proteas inhibitor cocktail och fosfatas-inhibitor cocktail.
    4. Rad Symbol Överför lysatet till ett mikrocentrifugrör och inkubera på is under åtminstone 10 min.
    5. Rad Symbol Centrifugera lysat i en mikrocentrifug vid> 5000 xg under 10 min.
    6. Rad Symbol Kassera radioaktivt avfall i särskilda avfallskärl som lagras bakom Perspex sköldar.

2. Analysera Märkning av proteiner av intresse

  1. Rad Symbol Isolera protein av intresse genom immunorening (IP).
    1. Rad Symbol Överför mikrocentrifugrör med centrifuge lysat tillbaka till is och pipettera supernatanten i ett mikrocentrifugrör innehållande 10 pl säng volym till jämvikt flagga-M2 agarospärlor.
      1. Förbered rören med jämviktad flag-M2 agarospärlor förväg.
      2. För detta, pipettera en volym av flagg M2 agaros slam motsvarande 10 pl bäddvolym per prov plus 5% överskott.
        1. I allmänhet är ett 10 ul bäddvolym av pärlor motsvarar 20 | il uppslamning. Se produktdatablad för mer information.
      3. Jämvikta pärlorna genom att skölja 3x i 10 volymer (i förhållande till bäddvolym) av IP-lyseringsbuffert.
      4. Fördela jämviktade pärlor jämnt på 10 pl bäddvolym / röret i så många rör som det finns prover. Märk rören med en identifierare för varje prov.
    2. Rad Symbol Överför mikrocentrifugrör till 50 ml rör (ca 6 mikro tubes/50 ml rör) som är märkta med en radioaktiv treklöversymbol och hålla på is.
    3. Rad Symbol Överför proverna till en roterande anordning bakom en Perspex sköld i det angivna området i ett kylrum för ände över ände blandning vid 4 ° C under 1-20 timmar.
    4. Rad Symbol Överför proverna till en designerad arbetsutrymme på is.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spinn ner proteinet bundet flaggan-M2 agaros pärlor i en mikrocentrifug (1000 xg, 1 min) och kassera supernatanten i en avfallsuppsamlingsröret.
    6. Rad Symbol Tvätta proteinbundna flagga-M2 agaroskulor genom återsuspendering i 1 ml IP tvättbuffert.
      1. Sammansättning av IP-tvättbuffert: Tris 25 mM pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Det rekommenderas att även omfatta proteas och fosfatasinhibitorer i tvättbufferten för proteiner som är känsliga för nedbrytning genom co renande proteaser eller defosforylering genom samtidig rening fosfataser.
      2. Rad Symbol Spinn ner proteinbundna flagga-M2 agaros pärlor i en mikrocentrifug (1000 xg, 1 min) och kassera supernatanten i en avfallsinsamlingstion röret.
      3. Rad Symbol Upprepa tvättn 3x.
    7. Rad Symbol Efter tvättningarna, resuspendera kulorna i en ml IP sköljbuffert (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT) 2 mM, Triton 0,02%, beta-glycerofosfat 5 mM, Na 3 VO 4 0,1 mM).
    8. Rad Symbol Spinn ner protein bundna flagga-M2 agaros pärlor i en mikrocentrifug (1000 xg, 1 min) och kassera supernatanten i en avfallsuppsamlingsröret. Ta bort all överflödig buffert.
    9. Rad Symbol Resuspendera pärlor i 40 & mu, l av IP-prov SDS laddningsbuffert (Tris-HCl 160 mM pH 6,8, SDS 2%, DTT 0,2 M, glycerol 40% bromfenolblått 2 mg / ml).
      1. Prover kan analyseras omedelbart eller förvaras i en -20 ° C frys under ulterior analys.
        1. Rad Symbol För lagring av prover vid -20 ° C, placera prover i slanghållare eller lådor i en plexiglaslåda i en radioaktiv treklöversymbol märkt frys dedikerad för lagring av radioaktiva prover.
    10. Rad Symbol Kassera radioaktivt avfall i särskilda avfallskärl som lagras bakom Perspex sköldar.
  2. Rad Symbol Lösa IP prover via SDS-PAGE och blot till PVDF-membran.
    1. Rad Symbol Värme prover i laddningsbuffert till 95 ° C under 2 min och centrifugera under 1 min vid> 1000 xg för att pelletera pärlorna.
    2. Rad Symbol Förbered proteingelelektrofores modulen på radioaktivitet bänken bakom en Perspex skärm.
    3. Rad Symbol Last prov på en 3-8% Tris-acetat-SDS-PAGE-geler.
      1. Denna typ av gel är lämplig för att lösa hög molekylvikt (HMW) proteiner. Andra gel-typer kan även vara utformad såsom en 4-20% Bis-tricin-gel eller Tris-glycin 4-20% geler.
      2. Inkludera en molekylviktsmarkör, som är lämplig för att urskilja storlekar av HMW-proteiner.
    4. <li> Rad Symbol Utför elektrofores vid 150 V under en timme.
    5. Rad Symbol Efter elektrofores avlägsna gelén från sitt plasthölje och överföra gelén till en behållare med Western blotting-överföringsbuffert.
      1. Sammansättning av Western blotting-transferbuffert: Tris 50 mM, glycin 40 mM, SDS 0,04%, metanol 20%.
      2. Rad Symbol Skär av delar av gelén som sticker ut såsom brunns separatorer och bottendelen av gelén som sticker ut.
    6. Förbered en polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran per gel genom doppning i metanol under 1 min, därefter i överföringsbuffert.
      1. Membran skärs till s ame storlek som gelen plus en marginal på 3 mm.
    7. Placera en halvtorr läskmodul på radioaktivitet bänken och ta av locket och övre elektrodplatta.
    8. Rad Symbol Förbered läsk smörgås på ytan av den halvtorr läskmodul.
      1. Blöt en extra tjock (2,5 mm tjock, 7,5 x 10 cm stor) läsk filter i överföringsbuffert och lägg på bottenplatta av läskmodulen.
      2. Rad Symbol Placera pre-våta PVDF-membran på blotting-filter.
      3. Rad Symbol Placera försiktigt gelen på PVDF membran och ta bort eventuella luftbubblor.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Slutför blot smörgås genom att blöta ett extra tjockt läsk filter i överföringsbuffert och plats på bottenplattan på läskmodulen. Ta bort all luft bubblor så småningom förekommer i läsk smörgås.
        Observera att den beskrivning som ges här är kompatibel med BioRad trans blot SD system där elektroderna är sådana, att proteiner vandrar nedåt mot membranet. Andra blotting system är också kompatibla med dessa steg med mindre anpassningar som de behövde till slut för att ta hänsyn till en annan läsk riktning eller, i fråga om tankblotting, extra flytande avfall som skall omhändertas på samma sätt som den elektroforesbufferten ovan.
    9. Rad Symbol Avlägsna all överflödig buffert med en absorberande vävnad och placera den övre plattan och locket hos det halv d ry läsk modul.
    10. Rad Symbol Överför proteiner vid 15 V under 1-2 timmar.
    11. Rad Symbol Under denna tid, rensa upp i elektroforesmodul.
      1. Rad Symbol Kassera radioaktivt avfall i särskilda avfallskärl som lagras bakom Perspex sköldar.
      2. Rad Symbol Skölj elektrofores modulen med destillerat vatten (AD) och släng sköljvattnet i den radioaktiva behållare flytande avfall.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> Efter överföring, ta bort PVDF membran med blottade proteiner från läskmodulen.
    13. Rad Symbol Tillval: utföra en Ponceau S färgning av blottade proteiner för att visualisera proteiner.
      1. Rad Symbol Överför bloten till en ytlig blot inkubationskärl innehållande Ponceau S-lösning och inkubera under 5 min.
      2. Rad Symbol Skölj 2x snabbt i AD.
    14. Rad Symbol Torka membranet.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Utför autoradiografi.
    1. Rad Symbol Exponera membranet till en fosforescens platta för 1-5 dagar.
    2. Rad Symbol Läs 32P bort av den exponerade fosforescens plattan med en Storm 840 fosforescens skanner eller motsvarande och spara bilden som högupplöst tiff.
  4. Rad Symbol Identifiera proteinnivåer via immunodetektion.
    1. Rad Symbol Rehydrera membranen genom att doppa dem kortfattat i metanol, sedan överföra till en ytlig blot inkubationskärl med PBS. Rad Symbol Blockera membranen i PBS-T (PBS med 0,1% Triton) innehållande 5% mjölk.
    2. Rad Symbol Inkubera blotting med anti-LRRK2 kroppen 13,16 eller anti flagga antikropp och processen vidare med lämpliga tvättsteg och sekundär antikropp inkubation.
    3. Rad Symbol Utför kemiluminiscensdetektion att bekräfta de relativa proteinnivåer LRRK2.
  5. Kvantifiera inkorporeringen av 32 P i LRRK2.
    1. Utför densitometrisk analys av banden på blot autoradiogram och immunreaktivitet använder lämplig programvara såsom ImageJ programvara, ett gratis program som finns på den nationella Institnuter of Health webbplats ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Beräkna fosfatnivåerna inkorporering som förhållandet mellan den autoradiografiska signalen över immunoreaktivitet nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att jämföra de totala fosforyleringsnivåer av LRRK1 och LRRK2 i celler, 3xflag tagged LRRK1 och LRRK2 uttrycktes i HEK293T celler 15. Celler odlades i plattor med 6 brunnar och märktes med 32p och analyserades såsom beskrivits ovan i det protokoll text Figur. 1 visar representativa resultat för metabolisk märkning av LRRK1 och LRRK2 i HEK293T celler. Radioaktivt fosfat inkorporering observeras för både LRRK1 och LRRK2. Vid kvantifiering av 32 P-nivåer normaliserades till proteinnivåer mätt genom densitometrisk analys av immunodetektion med anti-FLAG-antikropp, visade det sig att LRRK1 hade en genomsnittlig fosforylering nivå som är lägre än LRRK2 under de förhållanden som testades, även om statistisk signifikans är inte nått (P> 0,05).

1.jpg "/>
Figur 1. Metabolisk märkning av LRRK1 och LRRK2. A. LRRK1 och LRRK2 uttryckt i HEK293T celler metaboliskt märkta med 32p som beskrivs i protokollet och resultat sektioner. Visas här är representativa autoradiogram (övre panelen) vid 32 P inkorporering samt representativa Western blotting (nedre panelen) av LRRK1 och LRRK2 upptäckt via sina 3xflag taggar. B. Kvantifiering av den jämförande metabolisk märkning av LRRK1 och LRRK2 (N = 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument ger en grundläggande protokoll för analys av allmän fosforylering nivån LRRK1 och LRRK2 i cellinjer med hjälp av metabolisk märkning med 32 P-ortofosfat. Den övergripande strategin är okomplicerad. Affinity tagged LRRK proteiner uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter bara några timmars inkubation och alla molekyler i cellen som innehåller fosfater är därmed radioaktivt märkt. Den affinitetsmarkör (3xflag) används sedan för att isolera de LRRK proteiner från andra cellulära komponenter genom immunoutfällning. Immunoprecipitat separeras sedan genom SDS-PAGE, blottades till PVDF-membran och en analys av de införlivade fosfater utförs genom autoradiografi (32 P-signal) och Western detektion (protein-signal) av proteinerna på blotten. Detta protokoll skall skiljas från protokollet för att mäta LRRK2 autophosphorylation 17 i att märkningen av LRRK1 eller LRRK2 utföres i cellkultur snarare än i en in vitro fosforylering reaktion med renade proteiner.

Det bör noteras att den detaljerade protokoll som presenteras här kan justeras för att rymma för flera variationer beroende på experimentella behov. Till exempel, som märkning är effektiv i de flesta vanliga laboratoriecellinjer detta protokoll är inte begränsad till användningen av den HEK293T cellinjen. Dessutom kan andra affinitetsmarkörer kan användas som ett alternativ till 3xflag, såsom HA, myc, V5, GFP eller andra taggar 18 som flera taggar kan användas för att effektivt immunfällningen LRRK1 eller LRRK2. Vid en proteinspecifik antikropp är tillgänglig för det protein som är lämpad för immunprecipitation, såsom är fallet för LRRK2 11 kan detta genomföras också. Med en immunutfällning grad proteinspecifik antikropp, är det också möjligt att utföra metabolisk märkning av LRRKproteiner endogent uttryckta i cellinjer. I fallet med LRRK2 har flera monoklonala antikroppar har beskrivits som kan immunutfällning av endogent LRRK2 19. Slutligen kan den metaboliska märkningen protokollet, som beskrivs här för LRRK1 och LRRK2 också anpassas till något annat protein som kan immunoprecipiteras från cellinjer med användning av den allmänna strategi som beskrivs ovan.

En nyckelfråga innan du utför metabolisk märkning av proteiner i cellkultur är hur denna teknik kan jämföras med andra metoder för att bestämma cellulärt protein fosforylering. Till exempel kan fosforylering vid specifika ställen övervakas genom immunblotting med användning av en fosfo-specifik antikropp. Denna metod följer liknande steg som de som beskrivits här, med undantag för de isotopmärkningssteg, och av denna anledning är denna teknik ofta gynnas framför metabolisk märkning med 32 P-ortofosfat, när det är tillgängligt. Metabolisk märkning med 32 P-ortofosfat ger en signal som är representativ för den totala fosforyleringstillstånd av proteinet, därför inte kan ge information om fosforyleringen av specifika platser. För proteiner med multipla fosforyleringsställen, eftersom det är fallet för LRRK2 10,11 åstadkommer metabolisk märkningsteknik en bedömning i ett steg av den övergripande fosforylering nivå som kan fastställas med fosfo-specifika antikroppar, i avvaktan på flera immunodetection steg. Till exempel är LRRK2 mycket fosforyleras i sin ANK-LRR interdomän-regionen, det vill säga de S910/S935/S955/S973 11,20 webbplatser samt i andra regioner 10 inklusive den nyligen karakteriseras S1292 plats 21. För att dissekera ut betydelsen av enskilda phosphosites, rekommenderas att föredra experiment med phosphosite specifika antikroppar. Exempelvis phosphosite specifika antikroppar har gjort det möjligt att urskilja att S910/S935/S955/S973 phosphosites är defosforylerad i flera patogena mutanter såsom R1441C / G, Y1699C, I2020T, men inte i de G2019S 11,22, medan LRRK2 sjukdomsmutantformer uppvisar generellt högre fosfo-S1292 nivåer 21. Emellertid metabolisk märkning är användbara för ett antal andra studier av cellulär fosforylering. Metabolisk märkning är alltid en tillämplig teknik till exempel i fall av okända fosforyleringssäten, eller när fosfonotio-antikroppar inte finns eller låg känslighet. Slutligen ger metabolisk märkning jämföra totala fosforyleringsnivåer olika proteiner (som visas jämföra cellulära fosforylering nivåer LRRK1 och LRRK2, figur 1), en jämförelse som är utmanande att göra med phosphosite antikroppar givna skillnader i känslighet från en antikropp till en annan .

Sammanfattningsvis ger det nuvarande protokollet effektiv bedömning av de övergripande fosforyleringsnivåer av LRRK proteiner i celler. Protokollet kan lätt anpassas för att övervakafosforylering av något annat protein som kan uttryckas i celler och isolerades genom immunfällning. Användning av detta protokoll rekommenderas vid phosphosite-specifika antikroppar är inte tillgänglig för proteinet i studier eller som ett led i deras validering. Detta protokoll är speciellt användbar när den experimentella målet är att jämföra den totala fosforylering av två eller flera olika proteiner som sådana jämförelser via metabolisk märkning inte är förspända av skillnader i känslighet för detektion av fosforyleringen av ett protein till ett annat. Specifikt för LRRK1 och LRRK2, kan denna teknik användas för att jämförelsevis övervaka aktivitetsberoende förändringar i fosforylering av LRRK1 och LRRK2, med tanke på att sådana förändringar har börjat beskrivas för LRRK2 11,13,23, medan LRRK1 fosforylering reglering är dåligt känd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi är också tacksamma för Michael J. Fox Foundation stödjer denna studie. Vi tackar Research Foundation - Flandern FWO (FWO projekt G.0666.09, senior forskare gemenskap till JMT), IWT SBO/80020 projekt Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A och IOF-KP/07 / 001) för deras stöd. Denna forskning stöddes också delvis av fondens Druwé-Eerdekens förvaltas av King Baudouin Foundation till JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430, (910), 405-413 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics