पार प्रदर्शन के लिए तरीके
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Boyce Thompson Institute

Environment
 

Summary

हम Setaria viridis (एस viridis) में पार के प्रदर्शन के लिए एक पद्धति को विकसित किया है. विधि व्यवहार्य पराग को मारने के लिए पहले एक गर्म पानी के उपचार के लिए पुष्पगुच्छ छंटाई शामिल है. क्रॉस एक अच्छी तरह से नियंत्रित विकास के शासन के बाद किया जाता है और आम तौर पर 1 बीज / एस पुष्पगुच्छ प्रति पार परागण से 7 की वसूली में परिणाम हैं.

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Jiang, H., Barbier, H., Brutnell, T. Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses. J. Vis. Exp. (80), e50527, doi:10.3791/50527 (2013).

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Abstract

Setaria viridis सी 4 घास के लिए एक उभरती हुई मॉडल प्रणाली है. यह निकटता bioenergy फीड स्टॉक switchgrass और अनाज फसल लोमड़ी की पूंछ बाजरा से संबंधित है. हाल ही में, लोमड़ी की पूंछ बाजरा, एस के 510 एमबी जीनोम Italica, 1,2 अनुक्रम और पतला रिश्तेदार एस के एक 25x कवरेज जीनोम अनुक्रम की गई है viridis कार्य प्रगति पर है. एस viridis यह एक तेजी पीढ़ी समय, छोटे कद, साधारण विकास आवश्यकताओं, विपुल बीज उत्पादन 3 और क्षणिक और स्थिर दोनों परिवर्तन 4 के लिए विकसित प्रणालियों सहित एक संभावित उत्कृष्ट मॉडल आनुवंशिक प्रणाली बनाने कि विशेषताओं का एक नंबर है. हालांकि, एस के आनुवंशिकी viridis वजह पार प्रदर्शन के लिए विस्तृत तरीकों की कमी के कारण, भाग में, बड़े पैमाने पर बेरोज़गार है. तिथि करने के लिए, कोई मानक प्रोटोकॉल नियंत्रित पार से बीज का तेजी से उत्पादन की अनुमति होगी कि अपनाया गया है.

प्रोटोकॉल दबावented यहाँ एस में आनुवंशिक पार प्रदर्शन के लिए अनुकूलित है viridis, परिग्रहण A10.1. हम निर्बलता के बाद नव विकसित फूलों से उत्पन्न बीज खत्म करने के लिए 20-30 फ्लोरेट्स और फूलों की लेबलिंग बनाए रखने के लिए पुष्पगुच्छ छंटाई के बाद निर्बलता के लिए गर्म पानी के साथ एक सरल गर्मी उपचार कार्यरत है. अनुमोदक तापमान पर गर्मी उपचार की एक श्रृंखला के परीक्षण और सूई से अलग अवधि के बाद, हम 3-6 मिनट के लिए एक अधिकतम तापमान और 48 डिग्री सेल्सियस के समय सीमा की स्थापना की है. इस पद्धति का उपयोग करके, 15 पार की एक न्यूनतम प्रति दिन एक भी कार्यकर्ता द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है और पुष्पगुच्छ प्रति 3-5 outcross संतान के एक औसत बरामद किया जा सकता है. इसलिए, 45-75 outcross संतान के एक औसत एक ही दिन में एक व्यक्ति द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. इस तकनीक का व्यापक कार्यान्वयन एस के पुनः संयोजक जन्मजात लाइन आबादी के विकास की सुविधा होगी viridis एक्स एस viridis या एस viridis एक्स एस Italica, एसई थोक के माध्यम से म्यूटेशन मानचित्रणgregant विश्लेषण और आनुवांशिक विश्लेषण के लिए उच्च आदेश म्यूटेंट बनाने.

Introduction

एस viridis बारीकी bioenergy फीड स्टॉक switchgrass (NAD-ME उप प्रकार), अनाज फसल लोमड़ी की पूंछ बाजरा, और कृषि घास गिनी घास 5 से संबंधित एक NADP-ME उप प्रकार सी 4 घास है. Setaria, एस की खेती के फार्म का 510 एमबी जीनोम Italica, हाल ही में 1,2 अनुक्रम और पतला रिश्तेदार, एस के एक 25x कवरेज जीनोम अनुक्रम की गई है viridis, कार्य प्रगति पर है (अप्रकाशित). एस viridis यह एक तेजी पीढ़ी समय, छोटे कद, साधारण विकास की आवश्यकताओं, और विपुल बीज उत्पादन 3 सहित एक संभावित उत्कृष्ट मॉडल आनुवंशिक प्रणाली बनाने कि विशेषताओं का एक नंबर है. महत्वपूर्ण बात है, तरीकों हाल ही में एस के दोनों क्षणिक और स्थिर परिवर्तन के लिए विकसित किया गया है ट्रांसजेनिक पौधों 4 बनाने के लिए अवसर प्रदान करते हैं जो viridis. हालांकि, एस के लिए आनुवंशिक उपकरणों के विकास में एक बड़ी अड़चन viridis अपने recalc हैoutcrossing को itrance. तिथि करने के लिए, कोई मानक प्रोटोकॉल नियंत्रित पार से बीज का तेजी से उत्पादन की अनुमति होगी कि प्रकाशित किया गया है.

एस में जेनेटिक पार Italica आमतौर पर फूलों 6,7,8 से anthers को हटाने के माध्यम से या महिला के माता पिता 9-11 के फूलों की गर्मी उपचार के माध्यम से निर्बलता से प्रदर्शन कर रहे हैं. इन उपचार, anthers या गैर इलाज फूलों से panicles के बाद / पुरुष माता पिता धीरे पराग रिहा कलंक के खिलाफ abraded रहे हैं. निर्बलता में, anthers पुष्पक खोलता है और परागपिटक exsert शुरुआत है तुरंत बाद ठीक संदंश का उपयोग कर हटा रहे हैं, लेकिन अभी तक पराग 6-8 शेड नहीं किया गया है. इस बाद विधि की चुनौतियों के अलावा फूल के उद्घाटन और पराग शेड के बीच एक संकीर्ण समय के अंतराल में निर्बलता प्रदर्शन में कठिनाई है. एक फूल के उद्घाटन और समापन की अवधि के परिग्रहण और पर्यावरणीय स्थिति के आधार पर अलग अलग होंगे, और 7 मिनट से लेकर कर सकते हैं <समर्थन> 6 एस में घंटा 12 2.5 Italica. Anthers पुष्पक से exsert के रूप में पराग का छप्पर होता है, anthers ध्यान से और जल्दी से हटा दिया जाना चाहिए, और इसलिए, यह कारण आत्म - परागण के लिए संक्रमण से बचने के लिए मुश्किल है. Pollinations निर्बलता के तुरंत बाद प्रदर्शन कर रहे हैं इसके अलावा, प्रति दिन प्रति व्यक्ति / किया जा सकता है कि पार की संख्या सीमित है.

एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में, परिपक्व panicles गर्मी मार panicles की एक बड़ी संख्या पर पार प्रदर्शन के लाभ के साथ पराग अनाज 9,10,13,14 विकसित करने के लिए गर्म पानी में डूबा जा सकता है. हालांकि, गर्मी उपचार के तापमान और अवधि विभिन्न प्रयोगों (20 मिनट 10 के लिए 10 मिनट 14 और 42 डिग्री सेल्सियस के लिए जैसे 47 डिग्री सेल्सियस) से व्यापक रूप से भिन्न होता है. इसके अलावा, गर्मी की मध्यस्थता emasculations की प्रभावकारिता पर कोई व्यवस्थित विश्लेषण प्रकाशित किया गया है. एस में आनुवंशिक पार प्रदर्शन के लिए इस प्रकार, एक मानक और सरल विधि वीiridis बहुत एस के आनुवंशिक संसाधन विकास और स्थापना को तेज करेगा अनुसंधान समुदाय के भीतर एक मॉडल प्रणाली के रूप viridis.

हम एस में आनुवंशिक पार प्रदर्शन के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के विकास और अनुकूलन रिपोर्ट viridis. पौधे फूल विकास सिंक्रनाइज़ और प्रक्रिया के reproducibility बढ़ाने के लिए नियंत्रित वातावरण में उगाया जाता है. क्रॉस एक ट्रांसजेनिक एस का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं सफल नियंत्रित आनुवंशिक पार की पहचान की सुविधा के लिए गस रिपोर्टर जीन 4 युक्त पुरुष अभिभावक के रूप में viridis लाइन. गस transgene तुरंत कटाई के बाद F1 बीज की स्कोरिंग में सक्षम बनाता है और इस प्रकार निर्बलता और परागण की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक आसान गुणात्मक परख प्रदान करता है जो एक चावल Ubiquitin प्रमोटर द्वारा संचालित है. हम emascula किया गया है कि फूलों की लेबलिंग के साथ निर्बलता के लिए गर्म पानी के साथ एक सरल गर्मी उपचार कार्यरत हैटेड निर्बलता के बाद नव विकसित फूलों से उत्पन्न बीज खत्म करने के लिए. अनुमोदक तापमान पर गर्मी उपचार की एक श्रृंखला के परीक्षण और गर्म पानी में सूई से अलग अवधि के बाद, हम 3-6 मिनट से 48 डिग्री सेल्सियस के एक अधिकतम तापमान और समय durations की स्थापना की है. एक पूर्व सुबह ठंड उपचार पार परागण की सुविधा के क्रम में दोनों के माता पिता में तुल्यकालिक anthesis को बढ़ावा देने के लिए मिला था. हम भी अन्य Setaria accessions के लिए प्रोटोकॉल और इस विधि का भविष्य आवेदन में महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा की है.

Protocol

1. एस की ग्रोथ viridis

  1. 31 ° C/22 ° C (दिन / रात) 8:30-9:00 15 डिग्री सेल्सियस के पूर्व भोर उपचार के साथ, 12 घंटा light/12 घंटा अंधेरे, 50% सापेक्ष आर्द्रता को विकास कक्ष की स्थिति निर्धारित करें AM. (चित्रा 1). इन शर्तों के तहत, एस viridis A10.1 बीज बुआई से anthesis के लिए लगभग 21-22 दिन लगते हैं.
  2. मेट्रो मिक्स 360 के साथ फ्लैट्स (4 एक्स 9 सेल) भरें और पानी के लिए एक सेल हटा दें.
  3. मिट्टी की सतह पर हल्के से धुंध पानी.
  4. मिट्टी, सेल प्रति एक बीज की सतह पर बीज बोना.
  5. मिट्टी की एक परत के साथ बीज आवरण (लगभग 0.5 सेमी)
  6. नीचे से मिट्टी और पानी फ्लैटों की सतह धुंध. बीज बुवाई के बाद नीचे से पानी रखें.
  7. कम से कम तीन संयंत्रों प्रदर्शन किया जाएगा कि प्रत्येक पार महिला माता - पिता और नौ पौधों के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा के लिए पुरुष माता पिता के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. बीज बोने सभी पौधों में एक ही दिन पर फूल नहीं होगा कंपित किया जाना चाहिए. बीज sowiएनजी एक तीन दिन की अवधि में प्रत्येक दिन की सिफारिश की है.
  8. पौधों 1-2 बार पौधों और मिट्टी की स्थिति के आकार पर निर्भर है जो एक दिन, पानी. मिट्टी में अतिरिक्त पानी पौधों की इष्टतम विकास के लिए अनुकूल नहीं है, और मिट्टी और पत्ता ऊतक के नुकसान में कवक विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  9. जैक 15-16-17 100 पीपीएम की एकाग्रता में उपयोग करते हुए, सप्ताह में दो बार पौधों की खाद डालना.

2. ट्रिमिंग और निर्बलता से पहले पुष्पगुच्छ के लेबल - दिवस 1

  1. पूर्व परागण के लिए दोपहर या शाम में, प्रयोगशाला में वृद्धि कक्ष से पौधों के लिए कदम (तापमान (टी): 24.06 डिग्री सेल्सियस 21.79% 1.15% ± 0.13 डिग्री सेल्सियस, सापेक्षिक आर्द्रता (आरएच) ±).
  2. प्राथमिक panicles पहले से ही खिल गए हैं कि पुष्पगुच्छ पर फूलों का 1/3 के लिए 1 फूल होने का चयन करें.
  3. इस प्रकार इस अध्ययन में पुष्पगुच्छ के भीतर चार डोमेन परिभाषित कर रहे हैं (चित्रा 2A, टिप, बाहर का बीच, समीपस्थ मध्य और आधार).
  4. आदर्श रूप में, choosखिल गए हैं कि 1-5 फूलों के साथ ईए पुष्पगुच्छ, पुष्पगुच्छ (बाहर का अंत) की टिप काट, और वसंत कैंची या ठीक संदंश का उपयोग करके समीपस्थ मध्य और आधार वर्गों में सभी फूलों को हटा दें.
  5. एक पुष्पगुच्छ के बारे में 1/10 खिल है कि फूलों का 1/5 के लिए है, तो टिप काटा और केवल आगे trimming के लिए बाहर का मध्यम और समीपस्थ मध्य के ऊपरी भाग के निचले खंड बनाए रखने, पुष्पगुच्छ के आधार से फूल ट्रिम.
  6. एक पुष्पगुच्छ के बारे में 1/4 खिल गए हैं कि फूलों की 1/2 के लिए है, तो बाहर का मध्य भाग से कट और केवल आगे trimming के लिए समीपस्थ मध्यम वर्ग बरकरार रहती है.
  7. हल्के से बाल ट्रिम करने के लिए शल्य कैंची का प्रयोग करें.
  8. खिल और सभी अपरिपक्व फूल समान रूप से क्षेत्र में वितरित कर रहे हैं कि लगभग 20-30 फूल / पुष्पगुच्छ (चित्रा 3) छोड़ने की है कि सभी फूल निकालें. संभव गर्मी नुकसान से फ्लोरेट्स की रक्षा के क्रम में परागण किया जाएगा कि क्षेत्र में बाल बनाए रखने के लिए ध्यान का अभ्यास करें.प्रत्येक छोटी बाल के लिए, सबसे ऊपरी परिपक्व पुष्पक बरकरार रहती है. ऊपरी सबसे छोटा फूल परागण (चित्रा 2 बी) के समय में anthesis की संभावना अधिक होगा.
  9. एक लाल स्थायी मार्कर के साथ प्रत्येक फूल का एक पक्ष के निशान और पुष्पगुच्छ (चित्रा 2 बी) पर फ्लोरेट्स की संख्या दर्ज करते हैं.
  10. निर्बलता, अवधि और निर्बलता किया जाता है, जिस पर तापमान की तारीख: निम्नलिखित जानकारी के साथ फ्लैग पुष्पगुच्छ.
  11. पुष्पगुच्छ छंटनी की है, एक बार मुख्य पुष्पगुच्छ के विकास के लिए अधिक संसाधनों के पुन: आबंटन सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक संयंत्र के सभी टिलर हटा दें.

3. गर्म पानी की सूई के साथ निर्बलता - दिवस 1

  1. गर्मी उपचार के लिए 0.1 डिग्री सेल्सियस ± 48 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान सेट करें.
  2. धीरे छंटनी panicles मोड़ और 3-6 मिनट के लिए 48 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी में उन्हें डुबकी. पुष्पगुच्छ के स्टेम तोड़ने के लिए नहीं सावधानी बरतें.
  3. के बारे में 3-4 panicles toge डूबा जा सकता हैवहाँ एक समय में, गर्मी के समान वितरण के लिए panicles के बीच पर्याप्त जगह बनाए रखते हुए. यह गर्मी उपचार के दौरान गर्म पानी में पूरी पुष्पगुच्छ डूब के लिए आवश्यक है. झंडा पत्ता (पत्ती पुष्पगुच्छ के लिए पोषक तत्व प्रदान करता है कि पुष्पगुच्छ subtending) पत्ता ऊतक को गर्मी नुकसान को रोकने के लिए गर्म पानी के संपर्क में नहीं आना चाहिए.
  4. निर्बलता वांछित अवधि के लिए किया जाता है एक बार, पानी के स्नान से panicles निकालें और धीरे पुष्पगुच्छ से पानी बंद हिला.
  5. पूरी तरह से नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ कवर और एक मोड़ टाई के साथ सुरक्षित करने के लिए एक स्वनिर्धारित सूक्ष्म छिद्रित रोटी बैग रखें. माइक्रो छिद्रित रोटी बैग पुष्पगुच्छ के आकार के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है (वीडियो में शामिल हैं).
  6. अगले दिन जब तक वापस विकास कक्ष में पौधों रखें.

4. निर्बलता के बाद क्रॉसिंग / परागण - दिवस 2 और 3 दिन

  1. दिन 2 और 3 दिन 9:00 पर, महिला (नपुंसक बना दी जाती है) और मल को स्थानांतरितप्रयोगशाला में वृद्धि कक्ष से ई माता पिता पार प्रदर्शन करने के लिए (टी: 1.15% ± 21.79%: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±).
  2. ध्यान से देखें और खिल गए हैं या एक लाल स्थायी मार्कर का उपयोग कर खिल रहे हैं कि फूलों के लिए एक और लाल डॉट जोड़ें. पुष्पगुच्छ प्रति खिल फूल की कुल संख्या रिकार्ड.
  3. पार प्रदर्शन कर रहे हैं का ट्रैक रखने के लिए परागण की तारीख और टैग पर पुरुष माता पिता के नाम रिकॉर्ड.
  4. पुरुष माता पिता में anthesis के चरम समय का पालन. हमारे चैम्बर शर्तों के तहत (चित्रा 1) पुरुष माता पिता के panicles पर फूल 10:10 के आसपास तुल्यकालिक खोलने शुरू. फूलों के उद्घाटन के समय से, anthers और पराग की रिहाई की पूरी exsertion 20 मिनट के बाद हो जाएगा.
  5. परागण के लिए आदर्श मंच पुरुष माता पिता के पराग जारी की है, जिस पर मंच है. फूलों के पराग रिहाई से 20 मिनट के बाद बंद हो जाएगा. इसलिए, anthesis के लिए अवधि के प्रवाह के उद्घाटन के समय से लगभग 40 मिनट हैनेताओं. फूल के बाद लगभग 30 मिनट की अवधि में भूरे रंग के लिए पीले रंग सफेद से पराग का रंग बदल बंद कर देता है.
  6. पीले रंग सफेद anthers पुरुष माता पिता के फूल पर दिखाई दे रहे हैं एक बार तुरंत परागण प्रारंभ करें. Pollinations तीन तकनीकों में से एक का उपयोग करके दिन 2 और 3 दिन प्रदर्शन कर रहे हैं:
    1. पुष्पगुच्छ को पुष्पगुच्छ परागण: पुरुष के रूप में एक अलग पुष्पगुच्छ का प्रयोग, धीरे परागण की सुविधा के लिए नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ के साथ एक साथ पुष्पगुच्छ रगड़ और संक्रमण से बचने के लिए पुरुष पुष्पगुच्छ त्यागें. प्रत्येक नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ 2-3 panicles द्वारा परागण की गई है जब तक परागण प्रक्रिया को दोहराएं.
    2. Anther करने वाली कलंक परागण: संदंश पीले रंग सफेद anthers साथ खिल जाता है कि एक फूल लेने या anthers लेने और शारीरिक रूप से महिला माता पिता पर फूल के कलंक को छूने का उपयोग. नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ पर एक फूल सेचन पुरुष माता पिता से एक फूल का प्रयोग करें. परागण पी दोहराएँrocess नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ पर प्रत्येक कलंक जब तक कुछ (लगभग 2-3) फूल / anthers द्वारा परागण किया गया है. एक आवर्धक का छज्जा पहने परागण प्रदर्शन करने के लिए बेहतर दृश्यता प्रस्तुत करना होगा.
    3. विभिन्न पुरुष माता पिता के pollinations बीच, ध्वंसावशेष के लिए अलग पार के बीच पराग की वजह से संक्रमण से बचने के लिए Kimwipes के साथ पोंछते द्वारा पीछा 95% इथेनॉल में संदंश डुबकी.
    4. पुष्पगुच्छ बंधन: निर्बलता के बाद, अगले दिन खिल जाएगा कि पुरुष माता पिता पर 3-4 panicles का चयन करें. एक मोड़ टाई का उपयोग कर महिला माता पिता की नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ के साथ उन्हें एक साथ बाँध. थोड़ा पुरुष माता पिता का पुष्पगुच्छ नीचे नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ स्थिति. Panicles पर एक Glassine बैग में रखें और एक पेपर क्लिप के साथ आधार पर बैग सुरक्षित. पुरुष माता पिता के panicles anthesis शुरू एक बार यह दिन 2 पर पूरा किया जा सकता है.
    5. दिन 2 और 3 दिन, झाड़ू या facil को Glassine बैग मिलाने की सुबह में खिल समय के दौरानitate परागण. (: 00 AM से 9:00 AM-11 के बीच) सुबह में anthesis की पूरी अवधि के दौरान हर 15 मिनट झटका या panicles मिलाने के लिए आगे बढ़ें. परागण के बाद पुरुष माता पिता के panicles निकालें और नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ पर खिल फूल के विपरीत पक्ष लेबल. प्रत्येक महिला माता पिता का पुष्पगुच्छ पर खिल फूल की संख्या रिकॉर्ड.
  7. परागण प्रदर्शन किया गया है एक बार, महिला अभिभावक का पुष्पगुच्छ कवर और बीजों को एकत्रित करने तक परागण के बाद एक मोड़ टाई का उपयोग करके आधार पर सुरक्षित करने के लिए एक स्वनिर्धारित सूक्ष्म छिद्रित रोटी बैग जगह.

5. बीजों को एकत्रित

  1. परागण के दिन से 2 सप्ताह (14-16 दिन) के बाद फसल के बीज. बीज की एक ही बैग में टैग रखें. दोनों पक्षों पर लाल चिह्नों है कि बीज नियंत्रित आनुवंशिक पार से हुई कि बीज का प्रतिनिधित्व करते हैं. ये outcross संतान होने की उम्मीद कर रहे हैं.
  2. वे प्रतिनिधित्व के रूप में लाल निशान के बिना किसी भी बीज त्यागेंनिर्बलता के बाद नव विकसित फूलों से होने वाली बीज. केवल एक ही पक्ष पर लाल निशान के साथ बीज संभावना है कि वे नियंत्रित पार प्रदर्शन किया गया जब समय पर खिल नहीं थे के रूप में आत्म - परागण से उत्पन्न बीज का प्रतिनिधित्व करेंगे.
  3. एक बीज ड्रायर में 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सूखे बीज. प्रयोगशाला में स्टोर सूखे बीज (टी: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±: 1.15% ± 21.79%) या एक बीज कक्ष में (टी: 20% ± 1%: 4.0 डिग्री सेल्सियस 1.0 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±).

Representative Results

इस अध्ययन में, हम अनुक्रम एस इस्तेमाल किया महिला माता पिता, और एक ट्रांसजेनिक एस के रूप में viridis परिग्रहण A10.1 सभी pollinations के लिए पुरुष अभिभावक के रूप में गस रिपोर्टर जीन 4 युक्त viridis लाइन (भी A10.1). एक अनुकूलित विकास शासन चित्र 1 में दिखाया के रूप में फूल सिंक्रनाइज़ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम निर्बलता के लिए गर्मी उपचार के तापमान और समय के कई संयोजनों का परीक्षण किया और शेष 3 दिन (चित्रा 2) पर खिल जबकि नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ पर बनाए रखा फूलों के बारे में 40-80% 2 एन डी दिन पर खिल कि मनाया है. गर्मी उपचार भी गंभीर था हालांकि, अगर एक उदाहरण के लिए, 4 बहुत कुछ मिनट, या कोई फूलों के लिए 49 डिग्री सेल्सियस 2 दिन पर खिल. परागण 2 एन डी या पुरुष माता पिता के anthesis की पीक समय पर निर्भर था जो निर्बलता के बाद 3 दिन, पर प्रदर्शन किया गया था.

यह observ था, युवा फूलों निर्बलता के बाद विकसित करना जारी रखा है कि एड परिपक्व और 3-6 दिनों के बाद नियंत्रित pollinations आत्म - परागण. 7-10 दिनों के बाद परागण के बाद, सफेद रंग में हैं कि फूल पुष्पगुच्छ पर दिखाई दे रहे हैं. ये सफेद फूल गर्मी के कारण नुकसान या गरीब परागण या तो unfertilized रहे हैं. इसी समय, सफलतापूर्वक परागण किया गया है कि फूल अंधेरे बीज सहन और 14 दिनों के बाद बिखर शुरू शुरू करते हैं. परागण के बाद 14 वें दिन पर काटा लाल निशान के साथ अंधेरे बीज स्पष्ट रूप से अभी भी हरे थे और चकनाचूर नहीं था कि लाल निशान के बिना बीज से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. कटाई में देरी कर रहा है, दोनों के साथ और लाल निशान के बिना बीज के anthecium यह मुश्किल जल्दी से काटा पूल में लाल निशान के साथ बीज भेद करने के लिए बनाता है, जो अंधेरे बारी है.

तालिका 1 में संक्षेप के रूप में क्रॉसिंग प्रोटोकॉल कई गर्मी उपचार प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया अनुकूलन. के एक औसत0-10 बीज / पुष्पगुच्छ विभिन्न गर्मी उपचार प्रयोगों से बरामद किए गए. कटाई के बाद बीज एक anthecium पदच्युत का उपयोग anthecium को हटाने के बाद एक बीज ड्रायर में 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सूख रहे थे. Anthecium हटा दिया गया था, ख्यात F1 बीज गस धुंधला समाधान के साथ दाग, और outcross संतान 1-2 घंटा (चित्रा 2 एफ) में नीले रंग दाग रहे थे. इन परिणामों के आधार पर, हम 3-6 मिनट के लिए 48 डिग्री सेल्सियस के गर्मी उपचार की सलाह देते हैं. इसके अलावा, हम पार निर्बलता अगले दिन 2 और 3 दिन दोनों पर किया जा सलाह देते हैं.

अन्य Setaria accessions या प्रजातियों के साथ पार प्रदर्शन में इस तकनीक के प्रभाव की जांच करने के लिए, एस के बीच पार viridis A10.1 और आठ विविध एस viridis accessions और एक एस Pumila परिग्रहण प्रदर्शन किया गया. दिनों accessions के बीच विभिन्न फूल को हालांकि हमने पाया कि सभी आठ एस के फूल viridis accessions और एक एसPumila परिग्रहण भोर के पहले ठंड उपचार के बाद 10:20-11:00 पर एक शिखर खोलने समय के साथ 10:00-11:00 के बीच उद्घाटन शुरू करते हैं. यह भोर के पहले ठंड उपचार विविध Setaria accessions के लिए लागू किया जा सकता है कि इंगित करता है. 5-6 मिनट के लिए 48 डिग्री सेल्सियस के गर्मी उपचार एस प्रभावहीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रदर्शन कर सभी को पार करने के लिए महिला अभिभावक के रूप में इस्तेमाल किया गया था जो viridis A10.1. हम A10.1 और विविध एस तीनों के बीच पार से 12 बीज के लिए एक से बरामद viridis accessions और एस के बीच एक भी पार से छह बीज viridis A10.1 और एक भी एस Pumila परिग्रहण. इन बीजों को एक सफल testcross से हुई या स्वयं संदूषण के परिणाम थे हालांकि, अगर इस समय हम निर्धारित नहीं किया है. भले ही, इन प्रारंभिक परिणाम बताते हैं कि एस के लिए इस्तेमाल विकास की स्थिति viridis A10.1 विविध एस के साथ पार उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है viridis accessions और संभवतः Setaria की अन्य प्रजातियों.

अस्थायी गर्मी का इलाज (डिग्री सेल्सियस) समय गर्मी का इलाज (मिनट) # पार औसत. ट्रिम के बाद फूलों की # परागण के दिन (emasc के बाद दिन) औसत. # बीज (लाल) / पुष्पगुच्छ (मतलब) औसत. % गस (+) / बीज (लाल) औसत. # HYB बीज (गस) मिन # बीज HYB मैक्स # HYB बीज 47 10 2 27 2 दिन 0 0 0 0 0 48 3 3 36 2 दिन 5 60 3 1 5 4 3 25 3 दिन 10 50 5 3 7 5 8 25 2 दिन 5 60 3 1 6 6 3 25 2 दिन 4 75 3 0 4 7 4 24 2 दिन 3 33 1 0 4 7 1 25 3 दिन 4 75 3 N / A एन /एक 49 1 3 23 2 दिन 5 25 1 0 2 2 7 26 2 दिन 8 25 2 0 4 3 5 22 2 दिन 0 0 0 0 1 4 4 25 2 दिन 0 0 0 0 0

तालिका 1. निर्बलता के लिए गर्मी उपचार के अनुकूलन. गर्मी उपचार के तापमान और समय दोनों में फेरबदल के परिणाम. Pollinations निर्बलता और सफल outcrosses के बाद एक (2 दिन) या दो दिन (3 दिन) प्रदर्शन किया गयागस धुंधला के साथ cored

चित्रा 1
चित्रा 1. एक पूर्व भोर ठंड उपचार. तापमान और फूल उत्पादन का इष्टतम विकास और synchrony के लिए समय अवधि के साथ अनुकूलित विकास कक्ष की स्थिति दिखाई जाती हैं. हरे और लाल तीर क्रमशः, पार और निर्बलता के प्रदर्शन के लिए इष्टतम खिड़की दिखा.

चित्रा 2
चित्रा 2. क्रॉसिंग और outcross संतान की गस धुंधला के लिए पुष्पगुच्छ तैयारी. लगभग 1/10 खोला फूलों के दिखा, trimming से पहले Setaria viridis A10.1 की (ए) एक पुष्पगुच्छ. पुष्पगुच्छ साथ anthesis की प्रगति में चार वर्गों और दिशात्मकता दिखाया गया है. (ग) एक नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ. (डी) एक नपुंसक बना दी जाती पुष्पगुच्छ AM). (ई) पुरुष माता पिता एक β-glucuronidase (गस ले जाने (ट्रांसजेनिक Setaria viridis A10.1 लाइन का एक पुष्पगुच्छ) तड़के उपचार (तस्वीर को 10:30 बजे लिया) के बाद खिल जाता है कि पत्रकार जीन). एक ई के माध्यम से, स्केल सलाखों = 70% (v / v) इथेनॉल में distaining द्वारा पीछा 2 घंटे के लिए गस धुंधला के बाद 1 मिमी. (एफ) ख्यात outcross संतान. सही से दो बीज नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं, क्रमशः.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रोटोकॉल का फ्लो चार्ट मीटर का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्वएस प्रदर्शन में शामिल ajor कदम viridis पार.

Discussion

तड़के उपचार के महत्व

Outcross संतान की एक उच्च आवृत्ति प्राप्त करने के लिए यह पुरुष और महिला माता - पिता का अत्यधिक तुल्यकालिक anthesis है करने के लिए आवश्यक है. प्रारंभ में, हम तापमान और प्रकाश व्यवस्थाओं साइकिल (31 ° C/22 डिग्री सेल्सियस, दिन / रात) और एस इस्तेमाल किया सभी pollinations के लिए viridis परिग्रहण A10.1. 12:00: तापमान 31 डिग्री सेल्सियस के लिए निकलने से पहले इन शर्तों के तहत, सबसे फूल कुछ फूल खुला हालांकि बेतरतीब ढंग से 8:00-8 के बीच, सुबह जल्दी खुला. एस में पिछले अध्ययनों Italica कि दिन के समय का संकेत मिलता है, स्थान और मौसम anthesis 7,15,16 में बदलाव के लिए योगदान करते हैं. Siles एट अल. 6 पिछले अध्ययनों 7,15 में निष्कर्ष निकाला रूप anthesis, तापमान और आर्द्रता में तेजी से बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन नहीं कम तापमान और उच्च नमी के साथ, दर असल गया था उल्लेख किया. नकल करने के लिए: इसलिए, हम (12:00 08:30 -9 से) 30 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस के पूर्व भोर ठंड उपचार कार्यरतप्राकृतिक पूर्व भोर हालत. इस पूर्व सुबह ठंड उपचार माता - पिता में anthesis सिंक्रनाइज़ करने में सहायता प्राप्त. हम 50% के सापेक्ष आर्द्रता के स्तर के लिए कक्ष की स्थापना के बावजूद, कक्ष के अंदर सापेक्ष आर्द्रता तापमान 15 डिग्री सेल्सियस के लिए 22 डिग्री सेल्सियस से गिरा दिया के रूप में 70% से ऊपर एक स्तर तक वृद्धि हुई है और तापमान तक 70% से ऊपर रहने के लिए जारी रखा है कि मनाया धीरे - धीरे 9:30 के बाद 31 डिग्री सेल्सियस पर पहुंच गया. 9:00 पर, महिला माता पिता नपुंसक बना दी जाती है और पुरुष माता पिता के पौधों प्रयोगशाला में लाया जाता है (टी: 1.15% ± 21.79%: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±). पुरुष माता पिता के फूल 10:10 के आसपास खोलने शुरू, और परागण 10:30 -11 में प्रदर्शन किया जा सकता है: 00:00. सभी अभिकर्मकों और उपकरणों की एक विस्तृत सूची तालिका 2 में प्रदान की जाती है.

निर्बलता के लिए पुष्पगुच्छ तैयारी का महत्व

इस अध्ययन (चित्रा 1) में चैम्बर शर्तों के तहत, प्राथमिक पुष्पगुच्छ खिलने की अवधि को लेकर से2-3 दिन. आमतौर पर, (2A चित्रा) खुला पहला और खोलने पछाड़ proximally और distally पुष्पक्रम के बाहर का बीच पर स्थित फूल. पुष्पगुच्छ पर बनाए रखा जाएगा फूलों की आदर्श संख्या 20-30 है. केवल अच्छी तरह से विकसित फूल (छोटी बाल 17 पर सर्वोच्च फूल या सबसे बड़ा) को रखा जाता है कि इसलिए सावधानी अपरिपक्व फूलों के हटाने के दौरान लिया जाना चाहिए. फूलों के दोनों किनारों पर लाल मार्कर के साथ लेबल कुशलतापूर्वक निर्बलता के बाद नव विकसित फूलों से बीज से ख्यात outcross संतान भेद करने में मदद करता है. इसके अलावा, यह व्यापक गर्मी नुकसान से फ्लोरेट्स की रक्षा के लिए निर्बलता से पहले panicles पर बाल छोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन, एक विकल्प के रूप में, वे एक पुष्पगुच्छ बाध्यकारी है, खासकर जब परागण की सुविधा के क्रम में वसंत कैंची का उपयोग निर्बलता के बाद हटाया जा सकता है तकनीक (आंकड़े -2 सी और 2 डी) कार्यरत है.

अनुकूलित तापमान एकगर्म पानी के उपचार के लिए घ उपचार की अवधि

गर्म पानी की सूई के माध्यम से निर्बलता के आधार पराग स्टिगमैटिक सतह से गर्मी के प्रति संवेदनशील है. हालांकि, अवधि और गर्मी उपचार के तापमान Setaria प्रजातियों और accessions के बीच भिन्न हो सकते हैं. सामान्य तौर पर, एक कम उपचार समय या एक लंबे समय तक इलाज समय के साथ कम तापमान के साथ एक उच्च तापमान निर्बलता पर वही असर होगा. यह बताया गया है कि 20 मिनट 10 या 10 मिनट के लिए 47 डिग्री सेल्सियस 14 गाया एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस के गर्मी उपचार Italica पराग अलाभकारी, लेकिन इन उपचार की दक्षता निर्धारित नहीं किया गया था. हम उपचार के एक अनुकूलित तापमान और अवधि के तहत, सभी फूलों के पराग कलंक ग्रहणशील रहेगा जबकि महिला अभिभावक अलाभकारी हो जाएगा पर बरकरार रखा कि परिकल्पना के बाद हमारे प्रोटोकॉल विकसित किया है. हालांकि, कई तापमान के प्रभाव की तुलना और विश्लेषण करने के बाद औरउपचार की अवधि (1 टेबल), हम इस तरह यह पूरी तरह से आत्म - परागण से उत्पन्न बीज खत्म करने के लिए कठिन है, गर्मी उपचार के लिए संवेदनशीलता प्रत्येक पुष्पगुच्छ पर बनाए रखा फूलों के बीच बदलता है कि पाया. हम उपचार एस में 3-6 मिनट के लिए 48 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं जब outcross संतान उत्पादन की दक्षता सबसे बड़ा निष्कर्ष है कि viridis परिग्रहण A10.1.

Anthesis और पार परागण की पीक समय

फूलों परिपक्वता तक पहुँचने और खोलने जा रहे हैं, anthers पीले रंग में सफेद होते हैं और पराग जैसे ही anthers फूल 8 से exsert के रूप में बहाया जाता है. फूलों को बंद करने के लिए शुरू के रूप में पराग बहाया है के बाद anthers धीरे - धीरे भूरे रंग बदल जाते हैं. एक बार जारी किया, पराग की व्यवहार्यता अज्ञात है. इसलिए, यह जितनी जल्दी हो सके पुरुष माता पिता पर खोलने या हौसले से खोला फूलों से पराग का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे चैम्बर शर्तों (चित्रा 1), flowe के बहुमत के तहतपुरुष माता पिता के रुपये को 10:10 बजे खोलने के लिए शुरू और खोला फूल को 10:30 बजे पराग बहाया. इस प्रकार, परागण के प्रदर्शन के लिए वांछनीय खिड़की 10:30-11:00 है. कलंक करीब फूलों के बाद glumes बाहर रहते हैं और पराग के लिए ग्रहणशील हो सकता है. यह पहले से मनाया जाता है और एस में पुष्टि की गई है Italica कलंक Siles एट अल. 6 से के बारे में 48 घंटे के बाद फूल खोलने के लिए स्वीकार कर रहे हैं, तो यह गर्मी उपचार के बाद बैग panicles के लिए महत्वपूर्ण है और नियंत्रित पार करने के बाद है. ऊपर चर्चा की, हम दिन 2 और 3 दिन बाद निर्बलता दोनों पर प्रदर्शन pollinations की सलाह देते हैं.

परागण के लिए तरीके

हम तीन परागण तकनीक की दक्षता की तुलना में. खिल फूल सीमित नहीं रहे हैं, पुष्पगुच्छ को पुष्पगुच्छ परागण सबसे कारगर तकनीक है और outcross संतान के एक उच्च संख्या निकलेगा. खिल panicles, ओ के एक उच्च आवृत्ति को सीमित कर रहे हैंपरागपिटक करने वाली कलंक विधि का इस्तेमाल किया जाता है जब utcross संतान का उत्पादन किया जाएगा. हम सफलतापूर्वक दोनों तरीकों से outcross संतान प्राप्त किया है. "बंधन panicles" विधि एस पार करने में इस्तेमाल किया गया है Italica 6 लेकिन हम पुरुष माता पिता के पराग बहा के लिए समय खिड़की कम है के रूप में इस विधि से कम कारगर तरीका हो पाया. इसके अलावा, कम परागण पर नियंत्रण और एस पर बाल नहीं है viridis panicles भी स्टिगमैटिक सतह पर पराग की आवाजाही में बाधा हो सकती है.

बीजों को एकत्रित करने, सुखाने और भंडारण

कटाई के बाद बीज 2 दिनों के लिए 30-33 डिग्री सेल्सियस पर सूखे की जानी चाहिए. यदि आवश्यक हो तो Anthecium, गस धुंधला के लिए हटा दिया जाना चाहिए. बीज एक सूखी, शांत स्थान में संग्रहित किया जाना चाहिए (टी: 1.15% ± 21.79%: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±) टी (अल्पकालिक भंडारण (कम से कम दो वर्ष) के लिए या एक बीज चैम्बर में: 4.0- लंबी अवधि के भंडारण के लिए 20% ± 1%): 10 डिग्री सेल्सियस 1.0 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±.गरीब भंडारण की स्थिति कम व्यवहार्यता दरें 8 में हो सकता है. हमने देखा है कि एस के अंकुरण दर viridis A10.1 4 दिनों फसल कटाई के बाद बोया जब लगभग 5% है, लेकिन प्रयोगशाला (टी 1.15% ± 21.79%: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±) में भंडारण के बाद 90-96% तक बढ़ाया जा सकता है 110 के लिए दिनों के बाद कटाई बीज निद्रा को तोड़ने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक तीन दिवसीय स्तरीकरण द्वारा पीछा किया. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्तरीकरण के लिए, सूखे बीज एक कंटेनर (जैसे सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब या एक मोहरबंद प्लास्टिक की थैली में सिक्का लिफाफा) में रखा जा सकता है और बोने से पहले 3 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा. प्रयोगशाला में भंडारण के 16 महीनों के बाद (टी: 24.06 डिग्री सेल्सियस 0.13 डिग्री सेल्सियस, आरएच ±: 1.15% ± 21.79%), 90-95% की अंकुरण प्रतिशत अभी भी प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, निद्रा को तोड़ने के लिए, बीज कटाई के बाद 2 दिनों के लिए 30-33 डिग्री सेल्सियस पर सुखाया जा सकता है, और तब से हटाने के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिवसीय स्तरीकरण दीanthecium पहले रोपण. इन उपचार के बाद, ऊपर से 33% के बीज अंकुरण दर हासिल की जा सकती है.

लाभ, सीमाओं और संभव संशोधनों

यहाँ हम एस में पार के प्रदर्शन के लिए पहले मानक प्रोटोकॉल प्रदान निर्बलता के लिए एक गर्मी उपचार का उपयोग करके viridis A10.1. शारीरिक निर्बलता के विपरीत, इस प्रोटोकॉल कम आक्रामक और एक प्रयोगशाला में स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. यह आमतौर पर एक पुष्पगुच्छ ट्रिम करने के बारे में 15 मिनट लगते हैं और लगभग 15 panicles छंटनी और / व्यक्ति / दिन पार किया जा सकता. 3-5 outcross संतान / पुष्पगुच्छ के एक औसत मानते हुए अनुकूलित की शर्तों के तहत बरामद किया जा सकता है, 45-75 outcross संतान की कुल एक ही दिन में एक व्यक्ति द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक के अतिरिक्त अनुकूलन की संभावना हो जाएगा, हालांकि, अन्य Setaria प्रजातियों में पार करने के लिए लागू किया जा सकता है. विकास कक्ष स्थान सीमित है, पौधों एक पूर्व भोर trea बिना ग्रीन हाउस या विकास कक्षों में उगाया जा सकता हैवे अनुकूलित कक्ष की स्थिति में चले जाते हैं पहले पुष्पगुच्छ उभर तक tment.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgements

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए Sankalpi Warnasooriya और एमी हम्बोल्ट धन्यवाद. इस काम के ऊर्जा विभाग (डी SC0008769) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOS-1127017) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors, spring World Precision Instruments, Inc 14126
Forceps, Dumostar Biology Polished SPI Supplies TD5BP-XD
Surgical Scissors F.S.T (Fine Science Tools) 14005-12
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" http://www.pjpmarketplace.com 361001
Flats T.O. Plastics 715401C
metro mix 360 Hommert International 10-0356-1
Jack's 15-16-17 Hommert International 07-5925-1
Kimwipes VWR International 34120
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red Staples 37002
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length Amazon DA-10, B0015IP380
12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip Amazon N/A
water bath VWR scientific Model: 1166
BDW walk in plant growth chamber Conviron BDW 40

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