에 십자가를 수행하는 방법
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Boyce Thompson Institute

Environment
 

Summary

우리는 강아지풀 트리아 비리 디스 (S. 트리아 비리 디스)에있는 십자가를 수행하기위한 방법을 개발했습니다. 이 방법은 가능한 화분을 죽일 전에 뜨거운 물 처리에 원추 꽃차례를 치기 포함한다. 십자가는 잘 통제 성장 정권 다음을 수행하며 일반적으로 1 종 / s의 이삭 당 교차 수분 7의 회복이 발생할 수 있습니다.

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Jiang, H., Barbier, H., Brutnell, T. Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses. J. Vis. Exp. (80), e50527, doi:10.3791/50527 (2013).

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Abstract

강아지풀은 C 4 잔디에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 그것은 밀접 바이오 에너지 공급 원료의 스위치 그래스와 곡식 작물 아와 관련이 있습니다. 최근, 아와, S.의 510 메가 게놈 italica, 1,2 염기 서열과 잡초 상대 S.의 25 배 범위 게놈 서열되었습니다 트리아 비리 디스가 진행 중입니다. S. 트리아 비리 디스는 빠른 세대 시간, 작은 키, 간단한 성장 요구 사항, 다산 종자 생산 3 과도 안정 모두 변환 4 용으로 개발 된 시스템을 포함하는 잠재적으로 훌륭한 모델 유전 시스템을 만드는 특성을 가지고 있습니다. 그러나, S.의 유전학 트리아 비리 디스 인해 교차를 수행하기위한 상세한 방법의 부족 때문에, 부분적으로 큰폭 비경이다. 현재까지 표준 프로토콜은 제어 십자가에서 씨앗의 신속한 생산을 허용하는 것이다 채택되지 않았다.

프로토콜 압력ented 여기 S. 유전 십자가를 수행하기에 최적화되어 있습니다 트리아 비리 디스, 기탁 A10.1. 우리는 거세 후 새로 개발 된 꽃으로 인해 발생하는 씨앗을 제거하기 위해 20 ~ 30 작은 꽃과 꽃의 라벨을 유지하기 위해 원추 꽃차례를 가지 치기 후 거세를위한 따뜻한 물과 함께 간단한 열 처리를 사용했다. 관대 한 온도에서 열처리하는 일련의 테스트와 침지 시간을 변화 한 후, 우리는 3-6 분 동안 최적의 온도와 48 ° C의 시간 범위를 설립했다. 이 방법을 사용함으로써, 15 십자가의 최소 하루 단일 작업자에 의해 수행 될 수 있으며, 이삭 당 3-5 교배 자손의 평균 회수 할 수있다. 따라서, 45-75 교배 자손은 보통 하루에 한 사람에 의해 제조 할 수있다. 이 기술의 광범위한 구현은 S.의 재조합 근친 라인 인구의 개발을 촉진 할 것 트리아 비리 디스 X ​​S. 트리아 비리 디스 또는 S. 트리아 비리 디스 X ​​S. italica, 자체 대량을 통해 돌연변이를 매핑gregant 분석과 유전자 분석을위한 높은 순서 돌연변이를 생성.

Introduction

S. 트리아 비리 디스 밀접 바이오 에너지 공급 원료의 스위치 그래스 (NAD-ME 하위 유형), 곡물 작물의 아와, 및 농업 잡초 기니 잔디 5에 관련된 NADP-ME 서브 타입 C 4 잔디입니다. 강아지풀, S.의 재배 형태의 510 메가 게놈 italica, 최근 1, 2 염기 서열과 잡초 상대, S.의 25 배 범위 게놈 서열되었습니다 트리아 비리 디스가 진행 중입니다 (미 출판). S. 트리아 비리 디스는 빠른 세대 시간, 작은 키, 간단한 성장 요구 사항, 다산 종자 생산 3를 포함하여 잠재적으로 훌륭한 모델 유전 시스템을 만드는 특성을 가지고 있습니다. 중요한 방법은 최근에 S. 모두 일시적이고 안정적인 전환을 위해 개발 된 형질 전환 식물체 4를 만들기위한 기회를 제공 트리아 비리 디스. 그러나, S. 유전 도구의 개발에서 주요 병목 트리아 비리 디스는 다시 계산합니다교배에 itrance. 현재까지 표준 프로토콜은 제어 십자가에서 씨앗의 신속한 생산을 허용하는 것이다 게시하지 않았습니다.

S. 유전 십자가 italica는 일반적으로 꽃 6,7,8에서 꽃밥의 제거를 통해 또는 여성 부모 9-11의 꽃의 열처리를 통해 거세에 의해 수행된다. 이러한 치료, 꽃밥 또는 처리하지 않은 꽃에서 원추 화서 다음 / 남성 부모 부드럽게 화분을 발표 낙인에 마모된다. 거세에, 꽃밥은 작은 꽃이 열리고 꽃밥이 exsert 시작 직후 미세 집게를 사용하여 제거하고 있지만 아직 꽃가루 6-8을 흘렸다 않았습니다. 이 후자의 도전 중 꽃의 개방과 꽃가루 창고 사이의 좁은 시간 간격에 거세를 수행하기에 어려움이있다. 하나의 꽃의 개폐 시간은 기탁 및 환경 조건에 따라 달라질 수 있습니다, 그리고 7 분에 이르기까지 다양 <SUP> 6 S.의 시간 12 2.5 italica. 꽃밥은 작은 꽃에서 exsert로 꽃가루 흘리는 것은 발생하기 때문에, 꽃밥은 신중하고 신속하게 제거 할 필요가 있고, 따라서 인해 자기 수분에 오염을 방지하기 어렵다. pollinations이 거세 직후에 수행되는 또, 하루 / 개인당 행할 수 크로스의 수는 제한된다.

다른 방법으로, 성숙한 원추 화서는 열 죽일 원추 화서의 많은 수의 십자가를 수행하는 이점 꽃가루에게 9,10,13,14을 개발하기 위해 따뜻한 물에 담근 수 있습니다. 그러나, 열처리 온도와 시간은 다른 실험 (20 분 10 10 분 (14)와 42 ° C에 대한 예를 들어, 47 ° C)에서 크게 다릅니다. 또한, 열 매개 emasculations의 효능에 대한 체계적인 분석은 발표되지 않았다. S. 유전 십자가를 수행 따라서, 표준 및 간단한 방법 Viridis 크게 S.의 유전자 자원 개발 및 구축을 가속화 할 연구 공동체 내에서 모델 시스템으로 트리아 비리 디스.

우리는 S. 유전 교배를 수행하기위한 표준 프로토콜의 개발 및 최적화를보고 트리아 비리 디스. 식물은 꽃 개발을 동기화 및 절차의 재현성을 높이기 위해 제어 환경에서 재배되고 있습니다. 십자가는 형질 전환 S를 사용하여 수행됩니다 성공적인 제어 유전 교배의 식별을 용이하게하기 GUS 리포터 유전자를 함유하는 4 수형 부모로 트리아 비리 디스 라인. GUS 형질 전환 유전자는 즉시 수확 후 F1 종자의 점수를 가능하게하고, 따라서 거세과 수분의 효율성을 결정하는 쉬운 질적 분석을 제공하는 쌀 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동된다. 우리는 emascula왔다 꽃의 표시와 함께 거세 따뜻한 물에 간단한 열 처리를 사용했다테드는 거세 후 새로 개발 된 꽃으로 인해 발생하는 씨앗을 제거한다. 관대 한 온도에서 열처리하는 일련의 테스트를 따뜻한 물에 담그는 시간을 변화 한 후, 우리는 3-6 분에서 48 ° C의 최적의 온도 및 시간 기간을 설립했다. 새벽 찬 치료는 간 수분을 용이하게하기 위해 부모의 동기 개화를 촉진하는 것으로 확인되었다. 우리는 또한 다른 강아지풀의 accessions의 프로토콜과이 방법의 미래 응용 프로그램의 주요 단계를 설명했다.

Protocol

1. S.의 성장 트리아 비리 디스

  1. 31 ° C/22 ° C (주간 / 야간) 오전 8시 30분에서 9시까지 15 ° C의 새벽 치료, 12 시간 light/12 인사 어두운, 상대 습도 50 %로 성장 챔버 조건을 설정 AM. (그림 1). 이러한 조건에서, S. 트리아 비리 디스의 A10.1는 종자 파종에서 개화 약 21~22일합니다.
  2. 메트로 믹스 (360)과 아파트 (4 × 9 셀)를 입력하고 물을 하나의 셀을 제거합니다.
  3. 토양 표면에 살짝 안개 물.
  4. 토양, 세포 당 하나의 씨앗의 표면에 씨앗을 뿌리고.
  5. 토양의 층으로 씨앗 커버 (약 0.5 cm)
  6. 바닥에서 흙과 물 아파트의 표면에 안개. 씨앗 파종 후 바닥에서 물을 보관하십시오.
  7. 적어도 세 가지 식물을 수행 할 각 크로스 여성 부모와 아홉 식물로 사용됩니다에 대한 남성의 부모로 사용됩니다. 씨앗 파종은 모든 식물이 같은 날에 꽃하지 않습니다 엇갈려해야합니다. 종자 sowiNG는 세 가지 일에 걸쳐 매일하는 것이 좋습니다.
  8. 식물에게 1 ~ 2 회 식물과 토양 조건의 크기에 의존하는 일, 물. 토양에서 여분의 물은 식물의 최적 성장을위한 유리한하지 않고, 토양과 잎 조직의 손상에 곰팡이 성장으로 이어질 수 있습니다.
  9. 잭 15-16-17는 100ppm의 농도를 사용하여 두 회 식물 거름.

2. 트리밍 및 거세 전에 원추 화서의 라벨링 - 1 일

  1. 전에 수분에 오후 또는 저녁에, 실험실로 성장 실에서 식물을 이동 (온도 (T) : 24.06 ° C가 21.79 % 1.15 % ± 0.13 ° C, 상대 습도 (RH)를 ±).
  2. 기본 원추 화서가 이미 피어있다 휘어 꽃의 1 / 3에 1 꽃을 가지고 선택합니다.
  3. 다음과 같이 본 연구에서는 벼 내에서 네 개의 도메인이 정의되어있다 (그림 2A는, 팁, 말초 중간, 근위 중간베이스).
  4. 이상적의 choos피어있다 1-5 꽃과 EA 이삭은 원추 꽃차례 (선단)의 끝 부분을 잘라 봄 가위 또는 미세 집게를 사용하여 근위 중간베이스 섹션의 모든 꽃을 제거합니다.
  5. 원추 꽃차례는 약 1 / 10 개화 한 꽃의 2 / 10에있는 경우, 끝을 잘라 만 더 트리밍 원심 중간 및 근위 중간의 상단의 아래 부분을 유지, 원추 화서의 기지에서 꽃을 손질.
  6. 원추 꽃차례는 약 1 / 4 피었습니다 꽃의 1 / 2에있는 경우, 말초 중간 부분을 잘라 만 더 트리밍 근위 중간 부분을 유지합니다.
  7. 강모를 가볍게 트림 외과 용 가위를 사용합니다.
  8. 피어 모든 미성숙 한 꽃이 균등하게 지역에 분산되어 약 20 ~ 30 꽃 / 원추 꽃차례 (그림 3)를 떠나 모든 꽃을 제거합니다. 가능한 열 손상으로부터 작은 꽃을 보호하기 위해 수분 될 지역의 털을 유지하기 위해 치료를 연습 할 수 있습니다.각각의 작은 이삭의 경우, 위의 가장 성숙한 작은 꽃을 유지합니다. 상단 가장 작은 꽃은 수분 (그림 2B)시 개화기의 높은 확률을 제공합니다.
  9. 빨간색 유성 매직으로 각 꽃의 한 쪽을 표시하고 원추 꽃차례 (그림 2B)에 작은 꽃의 수를 기록한다.
  10. 거세, 재생 시간 및 거세가 수행되는 온도 일 : 배송지에 플래그를 휘어.
  11. 원추 꽃차례가 정돈되면, 주요 벼의 개발에 더 많은 자원의 재 할당을 보장하기 위해 각 공장의 모든 경운기를 제거합니다.

3. 따뜻한 물 찍기와 거세 - 1 일

  1. 열처리 0.1 ° C ± 48 ° C의 물을 욕조를 설정합니다.
  2. 부드럽게 정돈 원추 화서를 구부리고 3-6 분 동안 48 ° C에서 따뜻한 물에 담갔다. 벼의 줄기를 침입하지 않도록주의하십시오.
  3. 대략 3-4 원추 화서는 도게를 감소 할 수있다거기 한 번에, 열이 균일 한 분포의 원추 화서 사이에 충분한 공간을 유지하면서. 그것은 열처리 동안 따뜻한 물에 전체 벼 잠수함하는 것이 필수적입니다. 플래그 잎 (잎 벼에 영양분을 제공하는 원추 꽃차례를 이루는) 잎 조직에 열 손상을 방지하기 위해 따뜻한 물과 접촉하지 않아야합니다.
  4. 거세가 원하는 기간 동안 수행되면, 물을 욕조에서 원추 화서를 제거하고 부드럽게 휘어에서 물을 흔들어.
  5. 완전히 무기력 원추 꽃차례를 커버 트위스트 타이로 고정하는 사​​용자 정의 마이크로 관통되는 빵 부대를 배치합니다. 마이크로 관통되는 빵 부대는 벼의 크기에 따라 사용자 정의 할 수 있습니다 (동영상에 포함).
  6. 다음 날 때까지 성장 챔버에 식물을 배치합니다.

4. 거세 후 크로싱 / 수분 - 2 일 및 3 일

  1. 하루에 2, 3 일에 오전 9시에, 여성 (무기력)과 말을 이동실험실로 성장 챔버의 전자 부모 십자가를 수행하기 위해 (T : 1.15 % ± 21.79 % : 24.06 ° C는 0.13 ° C, RH를 ±).
  2. 관찰하고 피어거나 빨간색 영구 마커를 사용 피는 꽃에 다른 빨간색 점을 추가합니다. 이삭 당 피어 꽃의 총 수를 기록한다.
  3. 십자가가 수행되는 것을 추적 할 수분의 날짜와 태그에 대한 남성의 부모의 이름을 기록한다.
  4. 남성 부모의 개화기의 피크 시간을 관찰합니다. 우리의 챔버 조건에서 (그림 1) 남성 부모의 원추 화서에 꽃 오전 10:10 주위에 동기 개방을 시작합니다. 꽃의 오픈시부터, 꽃밥과 화분의 릴리스의 전체 exsertion는 20 분 후에 발생합니다.
  5. 수분을위한 이상적인 단계는 남성 상위의 화분이 해제되는 단계입니다. 꽃은 꽃가루 릴리스 20 분 후 종료됩니다. 따라서, 개화를위한 기간은 흐름의 개방 시간이 약 40 분이다ERS. 꽃 후 약 30 분에 걸쳐 갈색에 황색을 띠는 흰색 꽃가루의 색상이 변경이 닫힙니다.
  6. 황백색의 꽃밥은 남성 상위의 꽃에 볼 수 있습니다되면 즉시 수분을 시작합니다. Pollinations은 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 2 일 및 3 일에 수행된다 :
    1. 원추 꽃차례 - 투 - 벼 수분 : 남성으로 한 분리 원추 꽃차례를 사용하여 부드럽게 수분을 용이하게하기 위해 거세 원추 꽃차례와 함께 벼를 문질러 오염을 방지하기 위해 남성 원추 꽃차례를 폐기합니다. 각 거세 원추 꽃차례는 2-3 원추 화서에 의해 수분이 될 때까지 수분 과정을 반복합니다.
    2. 꽃밥에 낙인 수분 : 집게가 황백색 꽃밥에 피는 꽃을 선택하거나 꽃밥를 선택하고 물리적으로 여성의 상위에 꽃의 오명을 터치하여. 무기력 휘어 하나의 꽃을 수분하는 남성 부모로부터 하나의 꽃을 사용합니다. 수분 P를 반복rocess에이 거세 휘어 각 오명 때까지 몇 (2-3) 꽃 / 꽃밥에 의해 수분이되었습니다. 확대 바이저를 착용하는 것은 수분을 수행하기 위해 더 나은 가시성을 렌더링합니다.
    3. 다른 남성 부모의 pollinations 사이에 이월 할 다른 십자가 사이의 꽃가루에 의한 오염을 방지 할 킴 와이프로 닦아 다음 95 % 에탄올에 집게를 찍어.
    4. 원추 꽃차례 바인딩 : 거세 후, 다음날 개화 할 남성 상위 3 ~ 4 원추 화서를 선택합니다. 트위스트 넥타이를 사용하여 여성 부모의 무기력 원추 꽃차례와 함께 그들을 바인딩합니다. 약간 남성 부모의 원추 꽃차례 아래 거세 원추 꽃차례를 배치합니다. 원추 화서에 글라 신지 가방을 놓고 종이 클립 바닥에 가방을 고정합니다. 남성 부모의 원추 화서가 개화를 시작하면이 2 일에 완료 될 수있다.
    5. 하루에 2, 3 일, 영화 또는 FACIL하는 글라 신지 봉투를 흔들의 아침에 피는 시간 동안itate 수분. (: 자정 오전 9시 11 사이) 아침에 개화의 전체 기간에 걸쳐 매 15 분을 가볍게 또는 원추 화서를 흔들 계속합니다. 수분 후 남성 부모의 원추 화서를 제거하고 무기력 원추 꽃차례에 피는 꽃의 반대편에 레이블을. 각 여성 부모의 원추 꽃차례에 피는 꽃의 수를 기록한다.
  7. 수분이 수행되면, 여성 부모의 원추 꽃차례를 커버하고 종자 수확 때까지 수분 후 트위스트 넥타이를 사용하여 기본에 확보하기 위해 사용자 정의 마이크로 관통되는 빵 부대를 배치합니다.

5. 종자 수확

  1. 수분의 일에서 2 주 (14-16일) 후 수확 씨앗. 씨앗의 같은 가방에 태그를 배치. 양쪽에 빨간색 표시가 씨앗 제어 유전자 십자가에서 결과 씨앗을 나타냅니다. 이러한 교배 자손이 될 것으로 예상된다.
  2. 그들이 대표로 빨간색 표시없이 씨앗을 폐기거세 후 새로 개발 된 꽃의 결과 씨. 하나의 측면에 빨간색 표시와 함께 씨앗은 가능성이 그들이 통제 십자가가 수행 된 시간에 개화되지 않은으로 자체 수분으로 인한 씨앗을 나타냅니다.
  3. 종자 건조기에서 2 일간 30 ° C에서 건조 씨앗. 실험실에 보관 건조 씨앗 (T : 24.06 ° C는 0.13 ° C, RH ± 1.15 % ± 21.79 %)를하거나 종자 챔버 (T : 20 % ± 1 % : 4.0 ° C 1.0 ° C, RH를 ±).

Representative Results

이 연구에서, 우리는 순서가 S를 사용 여성의 부모, 그리고 유전자 변형 S. 등의 트리아 비리 디스의 기탁 A10.1 모든 pollinations에 대한 남성의 부모로 GUS 리포터 유전자 4를 포함하는 트리아 비리 디스 라인 (도 A10.1). 최적화 된 성장 체제는 그림 1과 같이 꽃을 동기화하는 데 사용되었다. 우리는 거세를위한 열처리 온도와 시간의 여러 조합을 시험하고 나머지는 제 3 일 (그림 2)에 피어있는 동안 무기력 휘어 유지 꽃에 대한 40~80%는 2 번째 날에 피어 것을 관찰했다. 열처리가 너무 가혹 경우, 예를 들어, 4 거의 분, 또는 꽃도 49 ° C는 2 번째 날에 피어있었습니다. 교차 수분은 2 또는 남성 부모의 개화기의 피크 시간에 의존했다 거세 후 제 3 일에 실시 하였다.

그것은 observ했다젊은 꽃이 거세 후 개발을 계속하는 것이 에드 숙성 3-6 일 후에 제어 pollinations 자체 수분. 7~10일 후 수분 후, 색상에 흰색입니다 꽃은 원추 꽃차례에 볼 수 있습니다. 이 흰 꽃은 열에 의한 손상이나 가난한 수분 하나에 미 수정됩니다. 동시에 성공적으로 수분 된 꽃은 어두운 씨앗을 품고 14 일 후에 산산조각 시작하기 시작합니다. 수분 후 14 번째 날에 수확 한 빨간 표시와 함께 어둠의 씨앗은 분명히 아직도 녹색 있었다 산산조각하지 않은 빨간색 표시하지 않고 씨앗에서 구별 할 수 있습니다. 수확이 지연 될 경우, 둘 다와 빨간색 표시가없는 씨의 anthecium 어려운 빨리 수확 풀에 빨간색 표시와 함께 씨앗을 구별 할 수있는 어두운십시오.

표 1에 요약 횡단 프로토콜 몇개 열처리 실험을 실시했다 최적화하기. 의 평균0-10 씨앗 / 원추 꽃차례는 다양한 열처리 실험에서 발견되었다. 수확 후, 씨앗 anthecium 제거제를 사용하여 anthecium의 제거 다음에 씨앗 드라이어 2 일 동안 30 ° C에서 건조시켰다. anthecium 제거한 후, 추정 F1 씨는 GUS 염색 액으로 염색하고, 교배 자손은 1 ~ 2 시간 (그림 2 층)에서 청색을 염색 하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 우리는 3-6 분 동안 48 ° C의 열 치료를하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 십자가가 거세 다음 날 2, 3 일을 모두 수행하는 것이 좋습니다.

다른 강아지풀의 accessions 또는 종과 교차를 수행하는이 기술의 효과를 조사하기 위해, S.간에 교차 트리아 비리 디스의 A10.1 여덟 다양한 S. 트리아 비리 디스의 accessions 한 S. pumila의 가입은 수행 하였다. 일 accessions 사이에 다양한 꽃에 있지만 우리가 발견하는 모든 여덟 S.의트리아 비리 디스의 accessions 한 S.pumila의 가입은 동트기 감기 치료 후 10시 20분부터 오전 11시까지에서 피크 개방 시간 10시에서 오전 11시까지 사이의 오프닝을 시작합니다. 이것은 동트기 저온 처리가 다양 강아지풀의 accessions에 적용 할 수 있음을 나타낸다. 5-6 분 동안 48 ° C의 열처리 S. 거세를 위해 사용되었다 수행 된 모든 십자가에 대한 여성의 부모로 사용 된 트리아 비리 디스의 A10.1. 우리는 A10.1 및 다양한 S. 세 사이의 십자가에서 12 씨앗 하나에서 복구 트리아 비리 디스의 accessions와 S. 사이에 단일 십자가에서 여섯 씨 트리아 비리 디스의 A10.1 단일 S. pumila의 기탁. 이 씨는 성공적인 testcross의 결과 또는 자체 오염의 결과 인 경우에 그러나,이 시점에서 우리는 결정하지 않았습니다. 어쨌든, 이러한 예비 결과는 그 제안 S. 사용 성장 조건 트리아 비리 디스의 A10.1 다양한 S.과 교차를 생성하는데 사용될 수있다 트리아 비리 디스의 accessions 가능성이 강아지풀의 다른 종.

온도의 열 치료 (° C) 시간 열처리 (분) # 십자가 평균. 손질 후 꽃 중 수분의 날 (emasc 후 일) 평균. # 씨앗 (레드) / 원추 꽃차례 (평균) 평균. % 거스 (+) / 씨앗 (레드) 평균. # 1 HYB 씨 (거스 +) 최소 번호는 씨앗을 HYB 최대 #의 HYB 씨
47 10 2 27 2 일 0 0 0 0 0
48 3 3 36 2 일 5 (60) 3 1 5
4 3 25 3 일 10 (50) 5 3 7
5 8 25 2 일 5 (60) 3 1 6
6 3 25 2 일 4 75 3 0 4
7 4 (24) 2 일 3 33 1 0 4
7 1 25 3 일 4 75 3 N / A N /
49 1 3 23 2 일 5 25 1 0 2
2 7 26 2 일 8 25 2 0 4
3 5 22 2 일 0 0 0 0 1
4 4 25 2 일 0 0 0 0 0

표 1. 거세위한 열처리의 최적화. 열처리 온도와 시간을 변화의 결과. Pollinations은 거세 성공적인 outcrosses의 다음 하나 (2 일) 이틀 (제 3 일)을 실시 하였다GUS 염색과 코어

그림 1
그림 1. 새벽 감기 치료. 온도와 꽃 생산의 최적의 성장과 동기 성을위한 기간과 최적화 된 성장 챔버 조건이 표시됩니다. 녹색과 빨간색 화살표는 각각 십자가 거세을 수행하기위한 최적의 창을 보여줍니다.

그림 2
그림 2. 건너와 교배 자손의 GUS 염색에 대한 이삭 준비. 약 1 / 10 오픈 꽃의 도시, 트리밍 전에 강아지풀의 A10.1의 (A) 원추 꽃차례. 원추 꽃차례에 따라 개화기의 진행에 네 개의 섹션과 방향성이 표시됩니다. (C) 거세 원추 꽃차례. (D) 거세 원추 꽃차례 AM). (E) 남성 상위 β-글루 쿠로니다 아제 (GUS 운반 (유전자 변형 강아지풀 A10.1 라인의 원추 꽃차례) 새벽 치료 (그림 오전 10시 30 분 촬영) 후 피는 리포터 유전자를). E를 통해, 스케일 바 = 70 % (v / v) 에탄올에 distaining 다음 2 시간 동안 GUS 염색 후 1mm. (F) 상상 속 교배 자손. 오른쪽에서 두 개의 씨앗은 부정과 긍정적 인 컨트롤입니다, 각각.

그림 3
그림 3. 프로토콜의 흐름도 m의 개략도S.을 수행하는 단계에 관여 ajor 트리아 비리 디스 십자가.

Discussion

새벽 치료의 중요성

교배 자손의 높은 주파수를 얻을 수는 남성과 여성의 부모의 높은 동기 개화를하는 것이 필수적입니다. 처음에, 우리는 온도와 빛 정권을 순환 (31 ° C/22 ° C, 일 / 1 박) 및 S를 사용 모든 pollinations에 대한 트리아 비리 디스의 기탁 A10.1. 정오 : 온도가 31 ° C로 상승하기 전에 이러한 조건에서, 대부분의 꽃은 몇 가지 꽃 개방하지만 무작위로 오전 8시 - 8 사이에 아침 일찍 엽니 다. S.의 이전 연구 italica 하루의 시간을 표시, 위치, 계절 개화 7,15,16의 변화에 기여한다. 실 레스 등. 6은 이전의 연구 7,15 체결로 개화는, 온도와 습도의 급격한 변화와 관련된, 그러나 낮은 온도와 높은 습도, 자체되었음을 지적했다. 모방 : 따라서, 우리는 (자정 오전 8시 30 분 9에서) 30 분 동안 15 ° C의 새벽 감기 치료를 고용자연 새벽 상태. 이 새벽 감기 치료는 부모의 개화를 동기화하는 원조. 우리는 50 %의 상대 습도 수준의 챔버를 설정에도 불구하고, 챔버 내부의 상대 습도는 온도가 15 ° C에 22 ° C에서 떨어 70 % 이상 수준으로 증가하고, 온도까지 70 % 이상으로 유지하는 것을 계속 관찰 점차 오전 9시 반 후 31 ° C로 상승했다. 오전 9시, 여성 부모를 거세한 수컷 부모의 식물은 실험실로 이동됩니다 (T : 1.15 % ± 21.79 % : 24.06 ° C는 0.13 ° C, RH를 ±). 남성 부모의 꽃 오전 10:10 주위에 개방을 시작하고, 수분 10:30 AM-11에서 수행 할 수 있습니다 자정. 모든 시약 및 기기의 자세한 목록은 표 2에 제공된다.

거세에 대한 이삭 준비의 중요성

이 연구 결과 (그림 1)의 챔버 조건에서 기본 이삭 피는 기간은 원거리에서2~3일. 일반적으로 (그림 2A) 열린 응급 개방이 선행 근위 및 원위 꽃차례의 원심 중간에있는 꽃. 휘어 유지하는 꽃의 이상적인 수는 20 ~ 30이다. 만 잘 발달 된 꽃 (이삭 17 최상위 꽃 또는 큰)이 유지되도록주의 미성숙 한 꽃의 제거시주의해야한다. 꽃의 양쪽에 빨간색 마커와 라벨을 효율적으로 거세 후 새로 개발 된 꽃에서 씨앗에서 추정 교배 자손을 구별하는 데 도움이됩니다. 또, 광범위한 열 손상으로부터 작은 꽃을 보호하기 거세 전에 원추 화서에 강모를 남길 중요하지만, 옵션으로, 그들은 휘어 바인딩 특히, 수분을 용이하게하기 위하여 스프링 가위를 사용 거세 후에 제거 될 수있다 기술은 (그림 2C와 2D) 사용된다.

최적화 된 온도따뜻한 물 처리를위한 D의 치료 기간

따뜻한 물에 담그고을 통해 거세의 기본은 꽃가루 성흔 표면보다 열에 더 민감하다는 것이다. 그러나, 기간 및 열처리의 온도는 강아지풀 종 및 가입에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로, 더 짧은 처리 시간 또는 더 긴 처리 시간에 따라 더 낮은 온도와 높은 온도는 거세에 동일한 효과를 가질 것이다. 이보고되고있다 그 20 분 10 10 분 동안 47 ° C 14 렌더링 S. 42 ° C의 열 처리 italica 화분이 아닌 생존하지만, 이러한 치료의 효율은 결정되지 않았습니다. 우리는 치료의 최적화 된 온도와 기간에 따라, 모든 꽃의 꽃가루가 암술 머리가 수용 남아있는 동안 여성의 부모가 아닌 실행 가능한 것입니다에 유지 가설 다음과 같은 우리의 프로토콜을 개발했습니다. 그러나, 여러 가지 온도의 효과를 비교하고 분석 한 후와치료 기간 (표 1), 우리는 따라서 완전히 자화 수분으로 인해 종자를 제거하기 어렵고, 열처리에 대한 감도가 각각 휘어 유지 꽃 중 달라하였습니다. 우리는 치료가 S.에 3-6 분 동안 48 ° C에서 수행 할 때 교배 자손을 생산의 효율성이이 이상없는 결론 트리아 비리 디스의 기탁 A10.1.

개화와 교차 수분의 피크 시간

꽃은 성숙에 도달하고 열려고 할 때, 꽃밥 컬러로 황백색이며 화분은 즉시 꽃밥은 꽃 8에서 exsert로 흘렸다. 꽃이 닫 시작으로 꽃가루가 흘려 후 꽃밥은 점차 갈색십시오. 일단 출시, 꽃가루의 생존은 알 수 없습니다. 따라서, 가능한 빨리 수컷 부모에 개구 또는 갓 열린 꽃에서 꽃가루를 사용하는 것이 중요하다. 우리의 챔버 조건 (그림 1), 꽃 펜던트의 대부분에서남성 부모의 RS 오전 10:10에 열 시작하고 열린 꽃은 오전 10시 30 분 꽃가루를 흘렸다. 따라서, 수분을 수행하는 것이 바람직 창 오전 10시 반에서 오전 11시까지입니다. 낙인은 가까운 꽃 후 포영 밖에 남아 화분을 받아 들일 수있다. 이것은 이전에 관찰 S.에서 확인되었다 italica 낙인이 실 레스 등. 6 약 48 시간 후 꽃 개방 수용, 그래서 그것은 열처리 다음 가방 원추 화서에 중요하고 제어 십자가를 수행 한 후입니다. 전술 한 바와 같이, 우리는 2 일 및 3 일 후 거세 모두에서 실적이 pollinations을 추천합니다.

수분 방법

우리는 3 수분 기법의 효율을 비교 하​​였다. 피 꽃이 제한되지 않으면, 휘어 투 휘어 수분이 가장 효율적인 기술이며 교배 자손의 수를 높게 얻을 것이다. 피 원추 화서는 O의 높은 주파수를 제한하는 경우꽃밥 투 낙인 방법이 사용될 때 utcross 자손이 생산 될 것이다. 우리는 성공적으로 두 가지 방법에서 교배 자손을 얻었다. "바인딩 원추 화서"방법은 S.을 건너에서 사용되었다 italica 6 그러나 우리는 남성 상위의 화분 흘리기에 대한 시간 창이 부족이 방법이 가장 효율적인 방법이 발견. 또한, 적은 수분 제어 및 S.의 강모가있다 트리아 비리 디스의 원추 화서는 성흔 표면에 꽃가루의 이동을 방해 할 수 있습니다.

종자 수확, 건조, 저장

수확 후 씨는 2 일 동안 30 ~ 33 ° C에서 건조해야한다. 필요한 경우 Anthecium는 GUS 염색을 위해 제거해야합니다. 씨앗은 건조하고 서늘한 장소에 보관해야합니다 (T : 1.15 % ± 21.79 % : 24.06 ° C는 0.13 ° C, RH를 ±) T (단기 기억 (2 년 미만) 또는 시드 챔버 : 4.0 장기 저장을 위해 20 % ± 1 %) : 10 ° C 1.0 ° C, RH를 ±.별로 보관 조건은 낮은 생존 비율 8 발생할 수 있습니다. 우리는 관찰하는 S.의 발아율 트리아 비리 디스의 A10.1는 사일 수확 후 파종하면 약 5 %이지만, 실험실 (T 1.15 % ± 21.79 % : 24.06 ° C가 0.13 ° C, RH를 ±)에 저장 한 후 90-96%로 증가 할 수있다 (110) 일 후 수확 종자 휴면 휴식 -80 ° C에서 사흘 층화 하였다. -80 ° C에서의 계층화를 들어, 건조 씨앗 밀폐 용기 (예를 들어, 마이크로 원심 분리기 튜브 또는 봉인 된 비닐 봉투에 동전 봉투)에 배치 될 수 있으며, 심기 전에 3 일 동안 -80 ° C로 유지. 실험실에서 저장 16 개월 후 (T : 24.06 ° C가 0.13 ° C, RH ± 1.15 % ± 21.79 %)을, 90 % -95 %의 발아 비율은 여전히​​ 얻을 수있다. 또한, 수면을 깰, 종자 수확 후 2 일 동안 30 ~ 33 ℃에서 건조 할 수 있으며, 다음의 제거 다음에 -80 ° C에서 사흘 층화 제공anthecium 전에 심기. 이 처리 후, 33 %까지의 종자 발아 속도가 달성 될 수있다.

장점, 한계와 가능성 수정

여기에서 우리는 S.에서 십자가를 수행하기위한 최초의 표준 프로토콜을 제공 거세위한 열처리를 사용하여 트리아 비리 디스의 A10.1. 물리적 거세는 대조적으로,이 프로토콜은 적게 침략과 실험실에서 확립 상대적으로 쉽습니다. 그것은 일반적으로 하나의 원추 꽃차례를 트림 약 15 분 소요되며 약 15 원추 화서 트리밍 및 / 인 / 일 교차 할 수있다. 3-5 교배 자손 / 휘어의 평균을 가정하면 최적 조건에서 회수 할 수있다, 45-75 교배 자손의 전체는 하루에 한 사람에 의해 제조 할 수있다. 또한,이 기술은 추가적인 최적화가 가능성이있을 것이지만, 다른 강아지풀 종에 교차하도록 적용될 수있다. 성장 챔버 공간이 제한되어있는 경우, 식물은 새벽 누없이 그린 하우스 또는 성장 챔버에서 재배 할 수있다그들은 최적화 된 챔버 상태로 이동하기 전에 이삭이 나올 때까지 tment.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

우리는 원고의 중요한 읽기 및 편집 Sankalpi Warnasooriya 에이미 훔볼트 감사합니다. 이 작품은 에너지 부 (DE-SC0008769)과 국립 과학 재단 (IOS-1127017)에서 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors, spring World Precision Instruments, Inc 14126
Forceps, Dumostar Biology Polished SPI Supplies TD5BP-XD
Surgical Scissors F.S.T (Fine Science Tools) 14005-12
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" http://www.pjpmarketplace.com 361001
Flats T.O. Plastics 715401C
metro mix 360 Hommert International 10-0356-1
Jack's 15-16-17 Hommert International 07-5925-1
Kimwipes VWR International 34120
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red Staples 37002
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length Amazon DA-10, B0015IP380
12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip Amazon N/A
water bath VWR scientific Model: 1166
BDW walk in plant growth chamber Conviron BDW 40

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