Методы Выполнение Кресты в
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Boyce Thompson Institute

Environment
 

Summary

Мы разработали методику выполнения кресты в Setaria Viridis (С. Viridis). Способ включает обрезки метелки до лечения горячей воды, чтобы убить жизнеспособную пыльцу. Кресты выполняются следующие хорошо контролируемого режима роста и обычно приводит к восстановлению от 1 до 7 перекрестное опыление семян / с на метелки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, H., Barbier, H., Brutnell, T. Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses. J. Vis. Exp. (80), e50527, doi:10.3791/50527 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Setaria виридис является новой модельной системой для C 4 трав. Она тесно связана с биоэнергетики сырья просо и зерновых культур щетинника проса. В последнее время 510 Мб геном щетинника просо, S. Италийский, была последовательность 1,2 и 25x охват генома последовательность сорной относительной S. виридис продолжается. С. виридис имеет ряд характеристик, которые делают его потенциально отличная модель генетическая система, включая время быстрое поколения, небольшого роста, простых требований роста, плодовитый производства семян 3 и развитых систем и переходных и стабильной трансформации 4. Тем не менее, генетика S. виридис в значительной степени неисследованными, в частности, в связи с отсутствием детальных методов для выполнения кресты. На сегодняшний день ни стандартный протокол не был принят, что позволит быстрое производство семян из контролируемых крестов.

В прес протоколатированной здесь оптимизирована для выполнения генетических кресты в S. виридис, присоединение А10.1. Мы использовали простой термической обработки с теплой водой для кастрации после обрезки в метелку, чтобы сохранить 20-30 цветочки и маркировки цветов для устранения семена в результате недавно разработанных цветов после кастрации. После тестирования серию термообработки в разрешительных температурах и изменения длительности погружения, мы создали оптимальную температуру и временной диапазон 48 ° С в течение 3-6 мин. При использовании этого метода, как минимум, 15 крестов могут быть выполнены с помощью одного работника в день и в среднем 3-5 скрещивания потомства на метелки могут быть восстановлены. Таким образом, в среднем 45-75 скрещивания потомство может быть получено путем одного человека в течение одного дня. Широкое применение этого метода будет способствовать развитию рекомбинантных инбредных популяций линии из S. виридис X С. виридис или S. виридис X С. Италийский, отображение мутации через навалом себеgregant анализ и создание более высокие мутантов порядка для генетического анализа.

Introduction

С. виридис является НАДФ-МЭ подтип С 4 трава тесно связана с биоэнергетики сырья просо (НАД-ME подтипа), зернового поля щетинника просо, и сельскохозяйственного сорняками морской травы 5. 510 Мб геном культивируемых виде Setaria, S. Италийский, недавно был последовательность 1,2 и 25x охват генома последовательность сорной родственника, S. виридис, находится в процессе (не опубликовано). С. виридис имеет ряд характеристик, которые делают его потенциально отличная модель генетическая система, включая время быстрое поколения, небольшого роста, простых требований роста и плодовитый производства семян 3. Важно отметить, что методы последнее время были разработаны и для переходных и стабильной трансформации S. виридис которые дают возможность для создания трансгенных растений 4. Однако главным препятствием в развитии генетических инструментов для S. виридис является его пересчетitrance чтобы ауткроссинг. На сегодняшний день ни стандартный протокол не было опубликовано, что позволит быстрое производство семян из контролируемых крестов.

Генетические кресты в S. Италийский обычно выполняются кастрации за счет удаления пыльников из цветов 6,7,8 или через термообработки цветов женских родителей 9-11. После этих обработок, пыльников или метелки из необработанных цветов / мужчины родители мягко истирается против рылец выпуская пыльцу. В кастрации, пыльники удаляются с помощью тонких щипцов сразу после цветочек открывается и пыльников начинает exsert, но до сих пор не пролить пыльцу 6-8. Среди проблем этого последнего метода является сложность в выполнении выхолащивание в узком интервале времени между открытием и пыльцы сарай цветка. Продолжительность открытия и закрытия одного цветка будет варьироваться в зависимости от присоединения и состояния окружающей среды, и может составлять от 7 мин <SUP> 6 до 2,5 ч 12 в S. Италийский. С пролития пыльцы происходит пыльники exsert от цветочек, пыльники нужно осторожно удалить и быстро, и поэтому, трудно, чтобы избежать загрязнения из-за самоопыления. Кроме того, как опыление осуществляется непосредственно после кастрации, количество крестов, которые могут выполняться на человека / в день ограничено.

В качестве альтернативного способа, зрелые метелки может быть, смоченной в теплой воде, чтобы нагреть убить развития пыльцевых зерен 9,10,13,14 с преимуществом выполнения кресты на большом количестве метелки. Однако температура и продолжительность термической обработки варьируется от различных экспериментах (например, 47 ° С в течение 10 мин 14 и 42 ° С в течение 20 мин 10). Кроме того, никаких систематических анализов об эффективности тепловых опосредованного emasculations не были опубликованы. Таким образом, стандартный и простой способ выполнения генетических кресты в S. объемрадужки бы значительно ускорить развитие генетических ресурсов и создание S. виридис в качестве модельной системы в рамках научно-исследовательского сообщества.

Мы сообщаем о разработке и оптимизации стандартного протокола для выполнения генетических кресты в S. виридис. Растения выращиваются в контролируемых условиях для синхронизации развития цветок и увеличить воспроизводимость процедуры. Кресты выполняются с использованием трансгенного S. виридис линия как отцовского, содержащего ген GUS репортер 4 для облегчения идентификации успешных контролируемых генетических кресты. GUS трансген приводится в действие риса Убиквитин промоутера, который позволяет счет семян F1 сразу после сбора урожая и, следовательно, обеспечивает легкий качественный анализ, чтобы определить эффективность кастрации и опыления. Мы использовали простой термической обработки с теплой водой для кастрации сопровождении маркировки цветов, которые были emasculaТед устранить семена в результате недавно разработанных цветов после кастрации. После тестирования серию термообработки в разрешительных температурах и изменения длительности погружения в теплой воде, мы создали оптимальную температуру и время продолжительности 48 ° C 3-6 мин. Предрассветный холод лечение было найдено содействовать синхронный опыления в обоих родителей в целях содействия перекрестное опыление. Мы также обсудили ключевые шаги в протоколе и будущего применения этого метода к другим присоединений Setaria.

Protocol

1. Рост S. виридис

  1. Установить условия роста камерные до 31 ° C/22 ° C (день / ночь), 12 ч light/12 ч темно, относительная влажность 50% с предрассветной лечения 15 ° C с 8:30 до 9:00 AM. (Рис. 1). В этих условиях С. виридис А10.1 принимает приблизительно 21-22 дней от посева семян до цветения.
  2. Заполните квартиры (4 х 9 клеток) Метро-Микс 360 и удалить одну ячейку для полива.
  3. Слегка туман воды на поверхности почвы.
  4. Семена семена на поверхности почвы, одного семени на ячейку.
  5. Обложка семена слоем почвы (около 0,5 см)
  6. Туман поверхность почвы и водных квартир снизу. Держите полива снизу после посева семян.
  7. Для каждого поперечного что будет выполнено по крайней мере три завода будет использоваться в качестве женских родителей и девять растений будет использоваться в качестве мужских родителей. Посева семян должны быть расположены в шахматном как все растения не зацветут в тот же день. Семя sowiнг рекомендуется каждый день в течение трех дней.
  8. Поливать растения 1-2 раза в день, который зависит от размера растений и состояния почвы. Избыток воды в почве не выгодно для оптимального роста растений, и могут привести к роста грибов в почве и повреждение ткани листьев.
  9. Удобряйте растения два раза в неделю, используя Джек 15-16-17 при концентрации 100 частей на миллион.

2. Обрезка и маркировки метелки Перед выхолащивание - день 1

  1. Во второй половине дня или вечером до опыления, двигаться растения от камеры роста в лабораторию (температура (Т): 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительной влажности (RH) 21.79% ± 1,15%).
  2. Выберите первичные метелки имея 1 цветок на 1/3 цветов на метелки, которые уже расцвел.
  3. В данном исследовании четыре домена в пределах метелки определены следующим образом (фиг. 2А; наконечник, дистальный средний, проксимальный и средний основание).
  4. В идеале, Выбираяшт метелки с 1-5 цветами, которые цвели, отрезать кончик метелки (дальний конец), и удалить все цветы в проксимальных средних и базовых разделов с помощью пружинных ножниц или тонкий пинцет.
  5. Если метелка имеет около 1/10 до 1/5 из цветов, которые цвели, отрезать кончик и отделка цветы от основания метелки, только сохранить нижнюю часть дистального средней и верхней части проксимального середине для дальнейшего обрезки.
  6. Если метелка имеет около 1/4 до 1/2 цветов, которые цвели, отрезали дистального среднюю секцию и только сохраняют проксимального среднюю секцию для дальнейшего отделкой.
  7. Используйте хирургические ножницы, чтобы слегка обрезать щетину.
  8. Удалите все цветы, которые цвели и все незрелые цветы, оставляя примерно 20-30 цветы / метелку, которые равномерно распределены в регионе (рис. 3). Практика ухода, чтобы сохранить щетинки в регионе, которые будут опыляются в целях защиты цветочки от возможного теплового повреждения.Для каждого колоска, сохранить верхний наиболее зрелый цветочек. Верхние большинство цветочек будет иметь более высокую вероятность цветения во время опыления (рис. 2В).
  9. Отметить одну сторону каждого цветка с красным маркером и записи количества цветков на метелки (рис. 2В).
  10. Флаг метелки со следующей информацией: дата кастрации, продолжительности и температуры, при которой выхолащивание осуществляется.
  11. После того, как метелка отделан, удалить все мотоблоки каждого растения, чтобы обеспечить перераспределение дополнительных ресурсов для развития основного метелки.

3. Выхолащивание теплой водой нагишом - день 1

  1. Установите водяной бане до 48 ° С ± 0,1 ° С в течение тепловой обработки.
  2. Аккуратно согнуть обрезанные метелки и опустите их в теплой воде при 48 ° С в течение 3-6 мин. Будьте осторожны, чтобы не сломать стебель метелки.
  3. Около 3-4 метелки можно погрузить TogeТам в одно время, при сохранении достаточной пространство между метелки для равномерного распределения тепла. Важно, чтобы погрузить весь метелку в теплой воде при термической обработке. Флаг лист (лист стягивающей метелки, которая обеспечивает питательные вещества к метелки) не должны вступать в контакт с теплой водой, чтобы предотвратить повреждение тепла к ткани листа.
  4. После того, как выхолащивание выполняется для требуемой продолжительности, удалить метелки из водяной бани и аккуратно стряхните воду из метелки.
  5. Наведите индивидуальные микроперфорированной хлеб мешок, чтобы полностью покрыть выхолащивается метелку и закрепите его с твист-галстук. Micro-перфорированные мешки хлеба могут быть настроены в соответствии с размером метелки (в том числе в видео).
  6. Поместите растения обратно в камеру роста до следующего дня.

4. Пересечение / опыление после кастрации - День 2 и 3-й день

  1. В 9:00 в день 2 и день 3 переместите женщина (выхолащивается) и ТЗАе родители из камеры роста в лаборатории (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительная влажность: 21.79% ± 1,15%), чтобы выполнить кресты.
  2. Наблюдать и добавить еще один красную точку на цветы, которые цвели или цветущие использованием красной перманентным маркером. Запишите общее количество распустившихся цветков на метелки.
  3. Запишите дату опыления и имя отцовского в теге отслеживать то, что выполняются кресты.
  4. Соблюдайте время пика цветения у самцов родителей. В наших условиях камеры (рис. 1) цветы на метелки мужского родителя начинают синхронное открытие около 10:10 утра. С момента открытия цветов, полный exsertion пыльников и освобождения пыльцы произойдет через 20 мин.
  5. Идеальная сцена для опыления является этап, на котором пыльца отцовского освобождается. Цветки закроется через 20 мин от пыльцы релизе. Таким образом, продолжительность цветения составляет около 40 мин с момента открытия потокаERS. Цвет изменений пыльцу с желтовато-белого до коричневого в течение примерно 30 мин после цветок закрывается.
  6. Начните опыление сразу как только желтовато-белые пыльники могут видеть на цветы мужского родителя. Опыление выполняются на день 2 и 3-й день с помощью одного из трех методов:
    1. Метелка к метелки опыление: используя один отдельный метелку как мужчина, аккуратно протрите метелку вместе с выхолощенном метелки для облегчения опыления и выбросьте мужской метелку, чтобы избежать загрязнения. Повторите процесс опыления, пока каждый выхолащивается метелки не было опыляются 2-3 метелки.
    2. Пыльник к стигматизации опыление: используя щипцы сорвать цветок, что цветет с желтовато-белых пыльников или забрать пыльники и физически прикоснуться клеймо цветка на женский родителя. Используйте один цветок из отцовского опылять один цветок на выхолощенном метелки. Повторите опыления рrocess до каждого стигмы на выхолощенном метелки не было опыляются нескольких (2-3) Цветы / пыльников. Ношение увеличительное козырек будет оказывать лучшую видимость для выполнения опыление.
    3. Между опылений различных мужских родителей, окуните щипцы в 95% этанола с последующим протиранием Kimwipes, чтобы избежать загрязнения из-за перенос пыльцы между различными крестами.
    4. Метелка обязательными: После кастрации, выберите 3-4 метелки на отцовской, что будут цвести на следующий день. Свяжите их вместе с выхолощенной метелки женского родителя с помощью твист-галстук. Расположите выхолащивается метелку немного ниже метелки мужского родителя. Поставьте пергамин мешок на метелки и закрепите сумку у основания с канцелярской скрепкой. Это может быть завершена в день 2 после того, как метелки отцовского начала опыления.
    5. Во время цветения раз в первой половине дня 2-й день и 3-й день, щелчком или потрясти пергамин сумку Facilitate опыление. Продолжить, чтобы щелкнуть и не трясите метелки каждые 15 мин в течение всей продолжительности цветения утром (между 9:00 утра-11: 12 утра). Удалить метелки отцовского после опыления и напишите на противоположной стороне цвели цветы на выхолощенном метелки. Запишите количество распустившихся цветов на метелки каждого женского родителя.
  7. После опыления была выполнена, поместите настроенную микроперфорированной хлеб мешок, чтобы покрыть метелку женского родителя и закрепите у основания по не используя твист-галстук после опыления до семян урожая.

5. Семя Уборочная

  1. Семена урожая после 2 недель (14-16 дней) со дня опыления. Поместите тег в той же сумке семян. Семена, которые имеют красные отметины на обеих сторонах представляют семена, которые привели с контролируемой генетической креста. Это, как ожидается, ауткросс потомство.
  2. Откажитесь от любых семян без красной маркировкой, поскольку они представляютсемена, которые являются результатом недавно разработанных цветов после кастрации. Семена с красной маркировкой только на одной стороне, скорее всего, представляют собой семена в результате самоопыления, поскольку они не цвели в то время, когда были совершены контролируемые кресты.
  3. Сухие семена при 30 ° С в течение 2 дней в сушилке семян. Храните сушат семена в лаборатории (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительная влажность: 21.79% ± 1,15%) или в семенной камеры (T: 4.0 ° C ± 1.0 ° C, относительная влажность: 20% ± 1%).

Representative Results

В этом исследовании мы использовали секвенированных S. виридис вступление А10.1 как женского родителя, и трансгенного S. виридис линия (также А10.1), содержащий ген GUS репортер 4 в качестве отцовской для всех опылений. Оптимизированный режим рост был использован для синхронизации цветения, как показано на рисунке 1. Мы протестировали несколько комбинаций температуры и времени термообработки для кастрации и отметил, что о 40-80% из цветов нераспределенной на выхолощенном метелки расцветал на й день 2 а остальные расцветал на 3-й день (рис. 2). Однако, если тепловая обработка была слишком тяжелой, для примера, 49 ° С в течение 4 мин, очень мало или совсем нет цветов расцветал на й день 2. Перекрестное опыление проводили на 2-й или 3-й день после кастрации, который был зависит от пиковое время цветения мужских родителей.

Это было наблюдаемыеред, что молодые цветы продолжали развиваться после кастрации, созрели и самоопыляемыми 3-6 дней после контролируемые опыление. Через 7-10 дней после опыления, цветы, которые белого цвета видны на метелки. Эти белые цветы неоплодотворенных или из-за теплового повреждения или плохое опыление. В то же время, цветы, которые были успешно опыленные начинают нести темные семена и начать разрушать через 14 дней. Темные семена с красной маркировкой, собранного на 14-й день после опыления может быть четко отделены от семян без красной маркировкой, которые были еще зеленые и не уничтожат. Если заготовка задерживается, anthecium семян с и без красной маркировкой и потемнеть, что делает его трудно быстро отличить семена с красной маркировкой в ​​собранных бассейнов.

Для оптимизации протокола пересечение несколько экспериментов термообработки проводились как показано в таблице 1. В среднем0-10 семена / метелки были извлечены из различных экспериментов термообработки. После сбора семена высушили при 30 ° С в течение 2 дней в семени сушилке с последующим удалением anthecium использованием anthecium удаления. После anthecium был удален, предполагаемые семена F1 окрашивали GUS красящим раствором, и ауткросс потомство окрашенных синим цветом в 1-2 ч (рис. 2F). Основываясь на этих результатах, мы рекомендуем термообработку 48 ° С в течение 3-6 мин. Кроме того, мы рекомендуем кресты быть выполнены как на 2-й день и 3-й день следующем кастрации.

Для изучения эффективности этого метода при выполнении кресты с другими присоединении или видов Setaria, кресты между S. виридис А10.1 и восемь разнообразны С. Viridis присоединениях и один С. стланика вступление проводились. Хотя дней до цветения разнообразны среди присоединившихся мы обнаружили, что цветы всех восьми S. Viridis присоединениях и один С.стланика вступление начать отверстие между 10:00-11:00 утра со временем пик открытия в 10:20-11:00 утра после предрассветной холодной обработки. Это означает, что предрассветный холодной обработки могут быть применены к различным присоединений Setaria. Термическая обработка 48 ° С в течение 5-6 мин использовался выхолостить S. виридис А10.1 который использовался в качестве женского родителя для всех крестов, выполненных. Мы оправились от одного до 12 семян от скрещивания A10.1 и трех разнообразной S. Viridis присоединениях и шесть семена из одного помесь S. виридис А10.1 и один С. стланика присоединении. Тем не менее, в это время мы не определяется, если они семя стало следствием успешного testcross или были результатом самостоятельного загрязнения. В любом случае, эти предварительные результаты показывают, что условия роста, использованные для S. виридис A10.1 может быть использован для создания кресты с разнообразной S. Viridis присоединениях и, возможно, другие виды Setaria.

Темп термической обработки (° C) Время термической обработки (мин) # кресты Средняя. # Цветов после отделкой День опыления (день после emasc) Средняя. # семена (красный) / метелка (в среднем) Средняя. % Гас (+) / семена (красные) Средняя. Семена # HYB (Гас +) Min # HYB семена Макс # HYB семена 47 10 2 27 2-й день 0 0 0 0 0 48 3 3 36 2-й день 5 60 3 1 5 4 3 25 3-й день 10 50 5 3 7 5 8 25 2-й день 5 60 3 1 6 6 3 25 2-й день 4 75 3 0 4 7 4 24 2-й день 3 33 1 0 4 7 1 25 3-й день 4 75 3 N / A N / 49 1 3 23 2-й день 5 25 1 0 2 2 7 26 2-й день 8 25 2 0 4 3 5 22 2-й день 0 0 0 0 1 4 4 25 2-й день 0 0 0 0 0

Таблица 1. Оптимизация термической обработки для кастрации. Результаты изменения как температура и время термообработки. Опыление проводили один (2-й день) или два дня (3-й день) после кастрации и успешные скрещивания сс сердечником из окрашивания GUS

Рисунок 1
Рисунок 1. Оптимизированные условия камерные рост с предрассветный холод лечения. Температуры и периодов времени для оптимального роста и синхронности цветочной продукции показаны. Зеленые и красные стрелки показывают оптимальную окно для выполнения кресты и выхолащивание, соответственно.

Рисунок 2
Рисунок 2. Подготовка Метелка для пересечения и GUS окрашивания скрещивания потомство. (А) метелки из Setaria Viridis A10.1 до обрезки, показывая приблизительно 1/10 цветов открытых. Четыре секции и направленность в прогрессировании цветения вдоль метелки показано. (С) выхолащивается метелка после удаления щетины. (D) выхолащивается метелки на 2 день после кастрации, показывая цветы, которые цветут (сфотографироваться в 10:30 AM). (Е) метелки из отцовского (трансгенная Setaria виридис А10.1 линии неся β-глюкуронидазы (GUS) репортер ген), который цветущий после предрассветной лечения (Фото сделано в 10:30). через Е, масштабные линейки = 1 мм. (F) Предполагаемые ауткросс потомство после окрашивания GUS в течение 2 часов с последующим distaining в 70% (объем / объем) этанола. Два семена права являются отрицательный и положительный контроль, соответственно.

Рисунок 3
Рисунок 3. Блок-схема протокола схематическое представление мAJOR шаги, участвующие в выполнении S. виридис кресты.

Discussion

Важность лечения предрассветной

Чтобы получить высокую частоту скрещивания потомство важно иметь высоко синхронного опыления мужских и женских родителей. Изначально мы ездили на велосипеде температурные режимы и легкие (31 ° С/22 ° С, день / ночь) и использовали S. виридис вступление А10.1 для всех опылений. В этих условиях, большинство цветов открываются рано утром перед температура повышается до 31 ° С, хотя некоторые цветы открыт случайно между 8:00 утра-8: 12 вечера. Предыдущие исследования в S. Италийский показывают, что время суток, место и сезон способствовать изменение в цветения 7,15,16. Силес соавт. 6 отметил, что цветения было связано с резким изменениям температуры и влажности, но не с низкой температурой и высокой влажностью, по сути, заключенным в предыдущих исследованиях 7,15. Поэтому мы использовали предрассветный холод лечение 15 ° С в течение 30 мин (с 8:30-9: 12 утра), чтобы имитироватьестественное состояние предрассветный. Это лечение холодом предрассветный помогал в синхронизации опыления у родителей. Мы наблюдали, что, несмотря установки камеры для относительных уровней влажности 50%, относительная влажность внутри камеры повышается до уровня выше 70%, как температура упала от 22 ° С до 15 ° С и продолжали оставаться выше 70%, пока температура постепенно вырос до 31 ° С, после 9:30. В 9:00 утра, выхолащивается женские родителей и растения отцовского доводятся до лаборатории (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительная влажность: 21.79% ± 1,15%). Цветы в мужских родителей начинают открываться вокруг 10:10 утра, и опыление может быть выполнена в 10:30 AM-11: 12 утра. Подробный список всех реагентов и оборудования приведены в таблице 2.

Важность подготовки метелки для кастрации

В условиях камеры в этом исследовании (рис. 1), продолжительность основного метелки цветения колебалась от2-3 дня. Как правило, цветы, расположенные на дистальном середине соцветия (2А) открыт первый и открытие предшествует проксимально и дистально. Идеальное количество цветов, которые будут сохранены на метелки 20-30. Внимание должно быть принято во время удаления незрелых цветов так, что только хорошо развитые цветы (самый верхний цветок или большие на колоска 17) сохраняются. Маркировка с красным маркером на обеих сторонах цветов помогает эффективно различать предполагаемый ауткросс потомство из семян из недавно разработанных цветов после кастрации. Кроме того, важно, чтобы оставить щетину на метелки до кастрации, чтобы защитить маленькие цветки от обширного теплового повреждения, однако, в качестве опции, они могут быть удалены после кастрации помощью пружинных ножниц в целях содействия опыление, особенно при связывании метелка метод используется (фиг. 2С и 2D).

Оптимизированная температураПродолжительность г лечение теплом водоподготовки

Основой для кастрации через теплой водой погружением в том, что пыльца является более чувствительным к теплу, чем стигматического поверхности. Тем не менее, продолжительность и температура термообработки могут отличаться для разных Setaria видов и образцов. В общем, выше температуры с более коротким временем лечения или более низкой температуре с более длительным временем обработки будет иметь тот же эффект на кастрации. Было сообщено, что термообработка 42 ° С в течение 20 мин 10 или 47 ° С в течение 10 мин 14 оказывается С. Италийский пыльца нежизнеспособными, но эффективность этих методов лечения не был определен. Мы разработали протокол следующие гипотезы, что при оптимизации температуры и продолжительности лечения, пыльца всех цветов сохраняется на женский родитель будет нежизнеспособным а рыльца останется восприимчивым. Тем не менее, после сравнения и анализа воздействия нескольких температурах ипериоды лечения (табл. 1), мы обнаружили, что чувствительность к термической обработки зависит среди цветов, удерживаемых на каждом метелки, таким образом, трудно полностью исключить семена в результате самоопыления. Мы пришли к выводу, что эффективность производства ауткросс потомство является наибольшей, когда процедуры проводили при 48 ° С в течение 3-6 мин в S. виридис вступление А10.1.

Пик время цветения и перекрестного опыления

Когда цветы достигают зрелости и собираетесь открыть, пыльники желтовато-белый цвет и пыльца пролить как только пыльники exsert из цветов 8. Пыльники постепенно буреют после пыльца пролить как цветы начинают закрываться. После освобождения, жизнеспособность пыльцы неизвестно. Поэтому, очень важно, использовать пыльцу с открытия или недавно открытых цветов на отцовской как можно скорее. В наших условиях камеры (рис. 1), большинство цветочков, цврс от мужских родителей начинают открываться в 10:10 и открытые цветы пролить пыльцу в 10:30. Таким образом, желательно окно для выполнения опыление между 10:30 утра и 11:00. В рыльца остаются вне чешуй за цветами близких и может быть восприимчивым к пыльце. Это было ранее отмечено и подтверждено в S. Италийский, что рыльца восприимчивы около 48 ч после цветочной открытия по Силес др.. 6, поэтому важно, чтобы сумка метелки следующие термообработки и после выполнения контролируемых кресты. Как уже говорилось выше, мы рекомендуем выполнять опыление как на 2-й день и День 3 после кастрации.

Методы опыления

Мы сравнили эффективность трех методов опыления. Если цветущие цветы не являются ограничивающими, метелка к метелки опыление является наиболее эффективным методом и даст большее количество скрещивания потомство. Если цветущие метелки ограничивают, более высокую частоту Outcross потомство будет производиться, когда метод пыльников к стигматизации используется. Мы получили ауткросс потомство от обоих методов успешно. Метод "привязки метелки" был использован в пересечении S. Италийский 6, но мы нашли этот метод наименее эффективный метод, как временное окно для пыльцы пролития отцовского коротка. Кроме того, там меньше контроля над опыления и щетина на S. Viridis метелки может также препятствуют движению пыльцы на стигматического поверхности.

Семя сбор, сушка и хранение

После сбора семена должны быть высушены при 30-33 ° С в течение 2 дней. Anthecium должен быть удален по окрашиванию GUS, если это необходимо. Семена должны храниться в сухом, прохладном месте (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительная влажность: 21.79% ± 1,15%) для кратковременного хранения (менее двух лет) или в семенной камеры (Т: 4.0- 10 ° C ± 1.0 ° C, относительная влажность: 20% ± 1%) для долговременного хранения.Плохие условия хранения могут привести к низким ставкам жизнеспособности 8. Мы наблюдали, что всхожесть S. виридис A10.1 составляет примерно 5% при посеве через 4 дня после сбора урожая, но может быть увеличено до 90-96% после хранения в лаборатории (Т: 24.06 ° C ± 0,13 ° С, RH: 21,79% ± 1,15%) в течение 110 дней после сбора урожая с последующим трехдневным стратификации при температуре -80 ° С сломать покоя семян. Для стратификации при температуре -80 ° С, сухие семена могут быть размещены в герметичном контейнере (например, микро-центрифуги трубки или монета конверт в запечатанном пластиковом пакете) и выдерживают при температуре -80 ° С в течение 3 дней до посадки. После 16 месяцев хранения в лаборатории (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, относительная влажность: 21.79% ± 1,15%), прорастание процент 90-95%, может быть получена. Кроме того, чтобы разорвать покоя, семена можно высушить при 30-33 ° С в течение 2 дней после сбора, а затем дали три дня расслоение при -80 ° С с последующим удалениемanthecium перед посадкой. После такого лечения, семя ставки прорастания до 33% может быть достигнута.

Преимущества, ограничения и возможные модификации

Здесь мы предлагаем первый стандартный протокол для выполнения кресты в S. виридис A10.1 с помощью термической обработки для кастрации. В отличие от физической кастрации, этот протокол является менее инвазивным и относительно легко установить в лаборатории. Обычно это занимает около 15 минут, чтобы обрезать одну метелку и около 15 метелки можно обрезать и пересек / человек / день. Предполагая, в среднем 3-5 скрещивания потомство / метелки могут быть восстановлены в оптимальных условиях, в общей сложности 45-75 скрещивания потомство может быть произведено одним человеком в течение одного дня. Кроме того, этот метод может быть применен к пересекает у других видов Setaria, хотя дополнительные оптимизации будет вероятно. Если камера рост пространство ограничено, растения можно выращивать в теплице или камерах роста без предрассветной сточtment пока метелки не возникает, прежде чем они будут перемещены в оптимизированных условиях камеры.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgements

Мы благодарим Sankalpi Warnasooriya и Эми Гумбольдта за критическое прочтение и редактирования рукописи. Эта работа была поддержана грантами от Министерства энергетики (DE-SC0008769) и Национального научного фонда (IOS-1127017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors, spring World Precision Instruments, Inc 14126
Forceps, Dumostar Biology Polished SPI Supplies TD5BP-XD
Surgical Scissors F.S.T (Fine Science Tools) 14005-12
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" http://www.pjpmarketplace.com 361001
Flats T.O. Plastics 715401C
metro mix 360 Hommert International 10-0356-1
Jack's 15-16-17 Hommert International 07-5925-1
Kimwipes VWR International 34120
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red Staples 37002
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length Amazon DA-10, B0015IP380
12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip Amazon N/A
water bath VWR scientific Model: 1166
BDW walk in plant growth chamber Conviron BDW 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
  2. Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
  3. Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
  4. Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
  5. Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
  6. Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
  7. Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
  8. Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
  9. Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
  10. Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
  11. Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 28-37 (1955).
  12. Malm, N. R., Rachie, K. O. Setaria millets: A review of the world literature S.B. University of Nebraska, Lincoln. 513-529 (1971).
  13. Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 1-6 (1954).
  14. Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
  15. RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. 561-571 (1933).
  16. Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
  17. Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics