に十字架を実行するためのメソッド

Environment
 

Summary

私たちは、 エノコログサ(S.エノコログサ )で十字を実行するための方法論を開発しました。方法は、従来の実行可能な花粉を殺すために熱水処理に穂を剪定することを含む。 ×印は、よく制御された成長政権後に実施し、典型的には、1穂当たりの種子/ Sクロス受粉7の回復につながるされています。

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Jiang, H., Barbier, H., Brutnell, T. Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses. J. Vis. Exp. (80), e50527, doi:10.3791/50527 (2013).

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Abstract

エノコログサは、C 4草のための新たなモデル系である。それは密接にバイオエネルギー供給原料スイッチグラスや穀物作物のアワに関連しています。最近では、アワ、Sの510 Mbのゲノムイタリカは、1,2および雑草相対Sの25Xカバレッジゲノム配列を配列決定されているエノコログサが進行中である。S.エノコログサは迅速な生成時間を含め、潜在的に優れたモデル遺伝系、小柄、単純な増殖要件、多作種子の生産3にし、一過性および安定な形質転換4の両方のためのシステムを開発した多くの特性を持っています。しかし、Sの遺伝学エノコログサは、交配を実施するための詳細な方法がないために、部分的には、大部分が未開拓である。現在まで、標準的なプロトコルは、制御された交雑種子の急速な生産を可能にすることが採択されていない。

プロトコル圧力取得済みはここでSに遺伝的交雑を実行するために最適化されていますエノコログサ 、アクA10.1。私たちは、除雄後に新たに開発された花から生じた種を除去するために、花の20〜30小花とラベルを保持するために穂を剪定した後に骨抜き用の温水で簡単な熱処理を採用している。許容温度での一連の熱処理をテストし、浸漬の持続時間を変える後、我々は3-6分間、最適温度および48°Cの時間範囲を確立した。この方法を用いて、15​​×印の最小一日ごとに1回の作業者が行うことができ、穂当たり3-5異系交配子孫の平均を回収することができる。したがって、45-75異系交配子孫の平均は、1日に1人により製造することができる。この技術の広範な実装はS.の組換え近交系集団の発達を促進するエノコログサ X S.エノコログサまたはSエノコログサ X S.イタリカ 、SEバルクを通じて変異をマッピングするgregant解析と遺伝子解析のための高次の変異体を作成する。

Introduction

S.エノコログサ密接バイオエネルギー供給原料スイッチグラス(NAD-MEのサブタイプ)、穀物作物のアワ、農業雑草ギニアグラス5に関連する、NADP-MEサブタイプC 4草です。 エノコログサ、Sの栽培形の510 Mbのゲノムイタリカは、最近になって、1,2および雑草相対、Sの25Xカバレッジゲノム配列を配列決定されているエノコログサは 、進行中である(未発表)。S.エノコログサは迅速な生成時間を含め、潜在的に優れたモデル遺伝系、小柄、単純な増殖要件、および多産の種子生産3にする多くの特性を持っています。重要なことに、最近の方法はS.の両方で安定した一過性形質転換のために開発されているトランスジェニック植物4を作成するための機会を提供するエノコログサ 。しかし、S.のための遺伝的ツールの開発における主なボトルネックエノコログサは、再計算され他殖にitrance。現在まで、標準的なプロトコルは、制御された交雑種子の急速な生産を可能にすることが発表されていない。

S内遺伝的交雑イタリカは通 ​​常、花が6,7,8から葯の除去を介して、または、女性の両親9月11日の花の熱処理によって骨抜きによって実行されます。これらの治療、葯または無処理の花から穂次/オス親が優しく花粉を解放柱頭に対して摩耗している。骨抜きでは、葯は小花が開き、葯を突き出すし始めた直後に細かい鉗子を用いて除去しているが、まだ花粉6-8を流していない。この後者の方法の課題の中でも、花の花粉杼口開口部との間の狭い時間間隔で除雄を行うことが困難である。単一の花の開閉の持続時間は、受託及び環境条件に依存して変化し、7分間の範囲であることができる<S内SUP> 6から2.5時間12 イタリカ 。葯の小花から突き出すように花粉の脱落が発生するため、葯を慎重かつ迅速に除去する必要があるので、それは、自家受粉による汚染を回避することは困難である。受粉を除雄直後に実行されるようにまた、日あたり/人ごとに実行することができる交雑の数は限られている。

別の方法としては、成熟した穂を熱殺すために穂が多数に十字架を実施することの利点と花粉9,10,13,14の開発、暖かい水に浸漬することができます。しかし、熱処理の温度及び時間は、異なる実験(20分10 10分14および42℃用など 47℃)から大きく異なる。さらに、熱媒介emasculationsの有効性に関する系統的な分析が発表されていない。 Sに遺伝的交雑を実行するためのように、標準的で簡単な方法V虹彩が大幅にSの遺伝資源の開発と確立を加速する研究コミュニティ内でのモデル系として、 エノコログサ

我々はSに遺伝的交雑を実行するための標準プロトコルの開発と最適化を報告エノコログサ 。植物が花の発生を同期させ、手順の再現性を高めるために制御された環境下で成長させる。十字架は、トランスジェニックSを使用して実行される成功した制御された遺伝的交雑の同定を容易にするために、GUSレポーター遺伝子含有する4雄親としてエノコログサ線 。 GUSトランスジーンは、収穫後直ちにF1種子のスコアリングを可能にし、従って、除雄と受粉の効率を決定するための簡単​​な定性アッセイを提供するイネユビキチンプロモーターによって駆動される。我々はemasculaていた花のラベル付けを伴う骨抜き用の温水で簡単な熱処理を採用している除雄後に新たに開発された花から生じた種を排除するためのテッド。許容温度で加熱処理する一連のテストをしてぬるま湯に浸すの期間を変化させた後、我々は3-6分から48℃の最適な温度と時間の期間を設けています。夜明け前の低温処理は、他家受粉を促進するために、両方の親における同期開花を促進することが見出された。我々はまた、プロトコルや他のエノコログサアク 、このメソッドの将来のアプリケーションにおける重要なステップについて説明してきました。

Protocol

1。 Sの成長エノコログサ

  1. 31°C/22°C(昼/夜)9:00 8:30から15℃の夜明け前処理をし、12時間light/12人事暗い、相対湿度50%に成長チャンバ条件を設定午前。 ( 図1)。これらの条件下で、S.エノコログサの A10.1は、シード播種から開花まで約21〜22日かかります。
  2. メトロミックス360でフラット(4×9セル)を記入し、水やりのために一つのセルを削除します。
  3. 軽く土の表面に水を霧。
  4. 土壌、セルあたり1シードの表面に種をまく。
  5. 土の層で種をカバー(約0.5cm)
  6. 下から土壌と水の干潟の表面をミスト。種子播種後底から水やりしてください。
  7. 雌親および9工場は、雄親として使用されるように、少なくとも三つの植物が使用され実行される各断面である。すべての植物が同じ日に花ないので、シード播種をずらさなければならない。シードsowiNGは、3日間にわたって、毎日をお勧めします。
  8. 植物の植物や土壌条件の大きさに依存している1〜2回、1日に水。土壌中の過剰な水が植物の最適な生育に有利ではなく、真菌の土壌中の成長と葉の組織の損傷につながる可能性があります。
  9. ジャックの15-16-17 100 ppmの濃度でを使用して、週二回の植物を受精。

2。トリミングと骨抜きになる前に穂の標識 - 第1日目

  1. 前受粉の午後や​​夕方には、研究室に成長室から植物を移動(温度(T):24.06°Cは21.79パーセント1.15%±0.13℃、相対湿度(RH)を±)。
  2. 既に咲いている穂に1花、花の1/3にした一次円錐花序を選択します。
  3. 以下のように本研究では穂内の4つのドメインが定義されていた( 図2Aは 、先端、遠位中間、近位ミドルとベース)。
  4. 理想的には、読み込むと咲いている1-5花のEA穂は、穂(先端)の先端を切断して、春のはさみや細かい鉗子を使用して、近位ミドルとベースのセクションですべての花を削除します。
  5. 穂は1/10程度咲いている花の1/5にされている場合は、先端を切断し、唯一、さらにトリミングするための遠位中間および近位真ん中の上部の下部を保持し、穂の根元から花をトリミング。
  6. 穂は1/4程度咲いている花の1/2にされている場合は、遠位中央部分を切断してのみ、さらにトリミングするための近位、中間部分を保持します。
  7. 軽く毛をトリミングする外科はさみを使用してください。
  8. 咲いたし、すべての未成熟な花が均等領域に分布している約20〜30花/穂( 図3)を残してきたすべての花を削除します。可能な熱損傷から小花を保護するために受粉される地域の毛を保持するように注意して練習します。各小穂の場合は、上部の最も成熟した小花を保持します。最上部の小花が受粉( 図2B)の時点で開花する可能性が高くなっているでしょう。
  9. 赤い油性ペンでそれぞれの花の片側をマークし、穂( 図2B)に小花の数を記録する。
  10. 以下の情報を有するフラグ穂:骨抜きの日付、持続時間および除雄が行われる温度。
  11. 穂がトリミングされた後、主穂の開発に多くの資源の再配分を確保するために、各工場の全ての分げつを削除します。

3。暖かい水浸漬で骨抜き - デイ1

  1. 熱処理の0.1℃±48℃に水浴を設定します。
  2. 優しくトリミング穂を曲げて3-6分間48℃の温水でそれらを浸します。穂の茎を壊さないよう、十分に注意してください。
  3. 約3〜4穂は峠を浸漬することができますTHER一度、熱の均一な分布のための穂の間に十分な空間を維持する。これは、熱処理中温水に穂全体を沈めることが不可欠である。フラグの葉(穂に栄養を提供穂をサブテンディング葉)葉組織への熱損傷を防止するために暖かい水と接触しないようにしてください。
  4. 除雄が所望の期間に行われた後、水浴から穂を取り外し、ゆっくりと穂から水を振り払う。
  5. 完全に骨抜きに穂をカバーし、ツイストタイで固定するようにカスタマイズされたマイクロ穿孔パンの袋を置きます。マイクロ穿孔パン袋(ビデオに含める)穂の大きさに合わせてカスタマイズすることができます。
  6. 次の日になるまでバック成長チャンバー内の植物を配置します。

4。除雄後クロッシング/受粉 - 2日目と3日目

  1. 2日目と3日目の午前9時に、メス(去勢)およびMALを移動研究室に成長室から電子両親の交配を行うために(T:1.15%±21.79パーセント:24.06°Cで、0.13℃、相対湿度を±)。
  2. 観察し、咲いたか、赤い油性ペンを使用して咲いている花に別の赤い点を追加します。穂当たり咲い花の総数を記録します。
  3. ×印が実施しているかを追跡するために受粉した日付とタグと男親の名前を記録します。
  4. 男性の両親に開花のピーク時間を守ってください。私たちの室条件の下で( 図1)男性の親の穂に花が10:10の周りに同期開放を開始します。花の開口部の時から、葯および花粉の放出を完全exsertionは20分後に発生します。
  5. 受粉のための理想的なステージは、雄親の花粉が放出される段階である。花は花粉リリースから20分後に終了します。したがって、開花のための期間は、フローのオープン時から約40分であるERS。花後に約30分かけて茶色に黄白色の花粉の色が変化が閉じます。
  6. 黄白色の葯が男性の親の花に見えるたらすぐに受粉を開始します。受粉は、3つの技術のいずれかを使用して、2日目および3日目に行われる。
    1. 穂への穂受粉 :男性のように1デタッチ穂を使用して、静かに受粉を促進し、汚染を避けるために男性の穂を廃棄する去勢穂と一緒に穂をこする。各骨抜き穂2-3穂によって受粉されるまで、受粉プロセスを繰り返します。
    2. 葯から柱頭受粉 :使用して鉗子は黄白色の葯に咲いている花を選ぶか、葯を選んで、物理的に女性の親に花の汚名をタッチします。骨抜き穂に1花を受粉するために男性の親から1花を使用してください。受粉pを繰り返しますrocessは骨抜き穂の各汚名まで数(約2-3)の花/葯によって受粉されています。拡大バイザーを身に着けていることは、受粉を行うために、より良い視界をレンダリングします。
    3. 異なる男性の親の受粉の間で、さまざまな十字架の間で花粉のキャリーオーバーによる汚染を避けるためにキムワイプで拭いて、その後95%エタノールに鉗子を浸します。
    4. 穂バインディング :骨抜きした後、次の日に咲くと男親に3-4穂を選択します。ツイストタイを使用して、女性の親の去勢穂と一緒にバインドします。やや男性の親の穂の下に去勢穂を配置します。穂の上グラシン袋を置き、ペーパークリップをベースにバッグを固定します。男性の親の穂が開花を開始すると、これは2日目に完了することができる。
    5. 、2日目と3日目の朝に開花期間中にフリックまたはFACILにグラシン袋を振る洗いたて受粉。 (:00 AM 9:00-11間)朝に開花の全期間を通じて15分毎にフリックするか、穂を揺るがし続ける。受粉後男性の親の穂を削除し、去勢穂に咲いて、花の反対側にラベルを付ける。各女性の親の穂に咲いて、花の数を記録します。
  7. 受粉が行われると、女性の親の穂をカバーし、種子の収穫まで、受粉後ツイストタイを使用して底部に固定するためにカスタマイズされたマイクロ穿孔パンの袋を置く。

5。種子収穫

  1. 受粉の日から2週間(14〜16日)後に収穫種子。種子の同じ袋にタグを配置。両側に赤い印を持っている種子は、制御された遺伝的交雑から生じた種を表す。これらは異系交配後代であると予想される。
  2. それが表すように赤いマーキングがなく、任意の種を捨てる除雄後に新たに開発された花から生じた種子。片側のみに赤いマーキング種子はおそらく、彼らは制御の交配を行った時のブルーミングれていなかったように自家受粉から生じる種を表します。
  3. 種子乾燥機中で2日間、30℃で乾燥種子。研究室に保管して乾燥させた種子(T:24.06°Cで、0.13℃、相対湿度:±1.15%±21.79パーセント)を、または種子室において(T:20%±1%:4.0℃〜1.0℃、相対湿度を±)。

Representative Results

本研究では、配列を決定Sを使用エノコログサアク女性の親としてA10.1、およびトランスジェニックS.すべての受粉のための男性の親としてGUSレポーター遺伝子4を含むエノコログサライン (もA10.1)。最適化された成長レジームは、 図1に示すように、開花を同期させるために使用した。我々は、骨抜きのための熱処理の温度と時間のいくつかの組み合わせをテストし、残りは3 日目図2)に咲いている間除雄穂上に保持され、花の約40〜80%が 2日目に咲いたことを観察した。熱処理は4分間、例えば、49℃あまりに重度であった場合は、非常に少ないまたは全く花は 2日目に咲いた。他家受粉は、雄の親の開花のピーク時に依存していた除雄後2 回目または3 回目の日、上で行った。

それはobservた若い花が骨抜き後に開発を続けていることをエド成熟し、3〜6日後に制御受粉自家受粉。 7〜10日後に受粉した後、白色で花が穂上に表示されます。これらの白い花は、熱損傷や貧しい受粉のいずれかに未受精である。同時に、首尾受粉された花は暗く、種子を負担し、14日後に粉砕を開始し始める。受粉後14日に収穫赤いマーキング暗い種子は明らかにまだ緑色であったと粉々にしませんでした赤いマーキングせずに種子から区別することができた。収穫が遅れた場合、赤のマーキングとない種子のantheciumが困難迅速収穫さプールにおける赤色マーキング種子を区別することができるもの、暗く両方。

表1にまとめたように、交差プロトコルを最適化するためにいくつかの加熱処理実験を行った。の平均0-10個/円錐花序は、種々の熱処理実験から回収した。収穫後、種子をantheciumリムーバーを用いantheciumを除去し、種子乾燥器中で2日間30℃で乾燥した。 antheciumを除去した後、推定上のF1種子をGUS染色溶液で染色し、異系交配子孫は1〜2時間( 図2F)で青色に染色した。これらの結果に基づき、我々は3-6分間48℃の加熱処理をすることをお勧めします。さらに、我々は十字が骨抜き次の日2日3の両方で実行することをお勧めします。

他のエノコログサアクや種との交配を実施する際に、この手法の有効性を検討するために、Sとの間に交差エノコログサの A10.1と8多様なS.エノコログサアクと1 S.ハイマツ受入を実施した。日アクの中で様々開花するものの、我々が発見したすべての8 Sの花エノコログサアクと1 S.ハイマツの加盟は夜明け前の低温処理後の10:20-11:00午前ピーク開放時間とともに10:00-11:00午前の間に開口部を開始します。これは夜明け前の低温処理は、多様なエノコログサアクにも適用できることを示しています。 5-6分48℃の加熱処理は、S.を去勢するために使用された実行されたすべての交配のための女性の親として使用されたエノコログサの A10.1。私たちは、A10.1と多様なSの3間の交配から12種子に1から回収エノコログサアクS.との間に単一のクロスから6シードエノコログサの A10.1とシングルS.ハイマツ加盟 。これらの種子が成功検定交雑から生じた、または自己汚染の結果であった場合は、この時点で、我々は決定していない。それにもかかわらず、これらの予備的な結果は、成長条件はS.のために使用したことを示唆しているエノコログサの A10.1は、多様なS.との交雑を生成するために使用することができますエノコログサアクやエノコログサの可能性が他の種。

一時熱処理温度(℃) 時間熱処理(分) #交配 平均。トリム後の花# 受粉の日(emasc翌日) 平均。 #種子(赤)/穂(平均) 平均。 %のGus(+)/種子(赤) 平均。 #HYBの種子(ガス+) 最小#のHYB種子 マックス#のHYB種子 47 10 2 27 2日目 0 0 0 0 0 48 3 3 36 2日目 5 60 3 1 5 4 3 25 3日目 10 50 5 3 7 5 8 25 2日目 5 60 3 1 6 6 3 25 2日目 4 75 3 0 4 7 4 24 2日目 3 33 1 0 4 7 1 25 3日目 4 75 3 N / A N / AA 49 1 3 23 2日目 5 25 1 0 2 2 7 26 2日目 8 25 2 0 4 3 5 22 2日目 0 0 0 0 1 4 4 25 2日目 0 0 0 0 0

表1。骨抜きのための加熱処理の最適化熱処理の温度と時間の両方を変化させる結果。受粉は骨抜きと成功outcrosses S以下の1(2 番目の日)または2日間(3 日目 )を行ったGUS染色に入り

図1
図1。夜明け前の低温処理温度や花の生産の最適な成長と同期するための期間で最適化された成長室状況が表示されます。緑と赤の矢印は、十字架や骨抜きを実行するための最適なウィンドウが表示されます。

図2
図2。交配と異系交配後代のGUS染色のための穂の準備。(A)1/10程度開いた花を示す、トリミング前エノコログサの A10.1の穂。穂に沿って開花の進行の4セクションと方向性が示されている。 。(C)去勢穂(D)去勢穂AM)。(E)、β-グルクロニダーゼ(GUS運ぶオス親(トランスジェニックエノコログサ A10.1ラインの穂)夜明け前処理(午前10時30分に撮影した画像)の後に咲いているレポーター遺伝子)。A E介して、スケールバー= 70%(v / v)エタノールでdistaining、続いて2時間後のGUS染色1mmである。(F)推定上の異系交配子孫。右から二種子をそれぞれ陰性および陽性対照である。

図3
図3。プロトコルのフローチャートを Mの概略図Sを実行に関与ajor手順エノコログサ交差する。

Discussion

夜明け前治療の重要性

異系交配後代の高い周波数を得るためには、男性と女性の両親の高度同期開花が不可欠です。最初に、我々は、温度と光体制を再投入(31°C/22°C、昼/夜)およびSを使用すべての受粉用エノコログサアク A10.1。 00時:温度が31℃まで上昇する前にこれらの条件の下では、ほとんどの花はいくつかの花のオープンもランダムに8:00 AM-8との間で、早朝に開きます。 S内の以前の研究場所と季節が開花7,15,16の変化に寄与し、その日のその時間を示しているイタリカ 。シレス 6は、従来の研究7,15年に締結ように開花は、それ自体が、低温、多湿で急激な温度変化や湿度ではなく、関連していたことを指摘した。模倣する:したがって、我々は(00 AM 8:30-9から)30分間15℃の夜明け前低温処理を採用自然な夜明け前の条件。この夜明け前の低温処理は、両親に開花を同期で支援。私たちは、50%の相対湿度レベルの室を設定にもかかわらず、チャンバー内の相対湿度は温度に達するまで温度が15℃まで22℃から低下し70%以上の水準に上昇し、70%を超える滞在し続けたことを観察した徐々に9:30後に31℃まで上昇した。午前9時、男性の親の雌の親や植物を去勢は研究室にもたらされる(T:21.79パーセント±1.15%:24.06℃、0.13℃、相対湿度を±)。男性の両親の花が10:10の周りの開口部を起動し、受粉10:30 AM-11で行うことができます:00午前。すべての試薬 ​​および装置の詳細なリストを表2に設けられている。

骨抜き用の穂の準備の重要性

この研究( 図1)内のチャンバ条件下では、一次穂ブルーミングの持続時間があったから2〜3日。一般的に、花序の先端真ん中に位置して花( 図2A)は、最初のオープンと開口部が近位および遠位に先行する。穂上に保持される花の理想的な数は、20〜30である。唯一のよく発達した花(小穂17上の一番上の花や最大)が保持されるよう注意が未熟な花を除去する際に注意が必要です。花の両側に赤いマーカーで標識を効率的に骨抜きした後に新たに開発された花から種子から推定される異系交配の子孫を区別するのに役立ちます。また、大規模な熱損傷から小花を保護するために骨抜き前に穂に剛毛を残すことが重要であるが、オプションとして、それらは、穂結合する場合は特に、受粉を促進するために、スプリングのはさみを使用して除雄後に除去することができる技術は、( 図2Cおよび2D)を用いる。

最適化された温度AN温水処理のためのd個の治療期間

温水浸漬を通して除雄の基本は、花粉が柱頭表面より熱に敏感であるということです。しかし、熱処理の持続時間と温度がセタリア種やアクの間で異なる場合があります。一般に、より長い処理時間が短い処理時間またはより低い温度でより高い温度が骨抜きに対して同じ効果を有するであろう。これは、報告されている20分10又は10分間47℃C 14レンダリングS. 42℃の熱処理イタリカ花粉非生存が、これらの処理の効率が決定されなかった。我々は、治療の最適化された温度及び時間の下で、すべての花の花粉が柱頭に受容残るながら女性の親が生育不能になる上に保持するという仮説次の我々のプロトコルを開発した。しかしながら、いくつかの温度の効果を比較し、分析した後と治療期間( 第1表 )、我々は、このようにそれが完全に自家受粉から得られた種子を除去することは困難であり、熱処理に対する感度が各穂上に保持され、花の間で変化することを見出した。我々は、治療がS.中3-6分間、48℃で実施されるとき異系交配子孫を生産する効率が最大であると結論エノコログサアク A10.1。

開花と他家受粉のピーク時

花が成熟に達すると開くしようとしている場合には、葯の色は黄色がかった白であり、花粉とすぐ葯花8から突き出すように流されている。花が閉じ始めるように花粉が流された後に葯は徐々に茶色に。リリースされたら、花粉の生存率は不明である。そのため、できるだけ速やかに男性の親の開口部または新鮮に開いた花から花粉を使用することが重要です。私たちのチャンバの状態( 図1)、floweの大半の下で男性の両親のRSは10:10で開くように開始し、開いた花は午前10時30分で花粉を流した。このように、受粉を行うために望ましいウィンドウは10:30と11:00の間にある。柱頭は近くの花の後に穎の外に残り、花粉を受け入れるかもしれません。これは、以前に観察され、S.確認されているイタリカ柱頭がシレス 6から約48時間後に開花のために受け入れているので、それは熱処理後バッグ穂にとって重要かつ制御十字架を実行した後であること。上述したように、私たちは2日目と3日目後の除雄の両方で受粉を行ってお勧めします。

受粉のための方法

我々は3つの受粉技術の効率を比較した。花が咲く限定されていない場合は、穂から穂受粉は、最も効率的な技術であり、異系交配の子孫の数が多いが得られる。開花穂は、Oの高い周波数を制限している場合葯から柱頭法を用いた場合utcross子孫が生成される。我々が正常に両方の方法から異系交配の子孫を取得しています。 「バインディング穂」の方法は、Sを横切るで使用されている男性の親の花粉脱落のための時間ウィンドウが短いようイタリカ 6が、我々は、この方法が最も効率的な方法であることが判明。また、あまり受粉を制御し、S上の毛がありますエノコログサの穂も柱頭表面に花粉の動きを妨げることがあります。

種子の収穫、乾燥、ストレージ

収穫後、種子を2日間30〜33℃で乾燥されるべきである。必要に応じてAntheciumは、GUS染色のために削除する必要があります。種子は、乾燥した涼しい場所に保管してください(T:1.15%±21.79パーセント:24.06°Cで、0.13℃、相対湿度を±)、T(短期保存(二年未満)、またはシードチャンバー内:4.0 - 長期保存のために20%±1%):10°Cで、1.0℃、相対湿度を±。貧弱な貯蔵条件は、低い生存率8をもたらし得る。私たちは、観察したことをSの発芽率エノコログサ A10.1 4日後に収穫播種時約5%であるが、実験室で貯蔵した後90から96パーセントまで増加させることができる(T:21.79パーセント±1.15%:24.06°Cで0.13°C、RH、±)110日後に収穫種子休眠を打破するために-80℃で3日間の層別化した。 -80℃での層別化のために、乾燥した種子は、気密容器( 例えば 、マイクロ遠心管又は密封されたビニール袋コインエンベロープ)に配置することができ、植え付けの前に3日間、-80℃で維持した。実験室でのストレージの16ヶ月後(T:24.06°Cが0.13℃、相対湿度:±1.15%±21.79パーセント)を、90から95パーセントの発芽率は、依然として得ることができる。また、休眠を破るために、種子は、収穫後2日間、30〜33℃で乾燥させることができ、その後の除去に続いて-80°Cで3日間与えられた成層anthecium前に植える。これらの処理の後、最大33%の発芽率を達成することができる。

利点、制限および可能な修正

ここでは、S.に交配を行うための第1の標準プロトコルを提供骨抜きのための熱処理を使用して、 エノコログサの A10.1。物理的除雄とは対照的に、このプロトコルは、低侵襲性及び研究室で確立することが比較的容易である。これは通常、1穂をトリミングするのに約15分かかり、約15穂をトリミングおよび/人/日、交差することができます。 45-75異系交配子孫の合計は一日に一人で製造することができ、異系交配子孫3-5 /円錐花序の平均値を仮定すると最適化された条件下で回収することができる。さらに、この技術は、追加の最適化が可能性が高いだろうが、他のセタリア種で交差するように適用することができる。成長室空間が限られている場合、植物は、夜明け前トリートメントルーム、ことなく、温室またはグロースチャンバー中で増殖させることができるこれらは最適化されたチャンバの状態に移動される前に、穂が出てくるまでtment。

Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgements

私たちは、原稿の重要な読書および編集のためSankalpi Warnasooriyaとエイミーフンボルトに感謝します。この作品は、エネルギー省(DE-SC0008769)、国立科学財団(IOS-1127017)からの補助金によって支えられている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors, spring World Precision Instruments, Inc 14126
Forceps, Dumostar Biology Polished SPI Supplies TD5BP-XD
Surgical Scissors F.S.T (Fine Science Tools) 14005-12
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" http://www.pjpmarketplace.com 361001
Flats T.O. Plastics 715401C
metro mix 360 Hommert International 10-0356-1
Jack's 15-16-17 Hommert International 07-5925-1
Kimwipes VWR International 34120
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red Staples 37002
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length Amazon DA-10, B0015IP380
12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip Amazon N/A
water bath VWR scientific Model: 1166
BDW walk in plant growth chamber Conviron BDW 40

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