तुलनात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए चयापचय लेबल और झिल्ली Fractionation

Biology

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Summary

यहाँ हम पूरी तरह से 15 एन लेबल Arabidopsis thaliana सेल संस्कृतियों unlabeled के मिश्रण पर आधारित डिटर्जेंट प्रतिरोधी और डिटर्जेंट घुलनशील झिल्ली में संयंत्र प्लाज्मा झिल्ली के विभाजन के लिए और इन विवो में एक मजबूत विधि का वर्णन है. प्रक्रिया संकेत प्रक्रियाओं को समझने के लिए तुलनात्मक प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए लागू किया जाता है.

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Szymanski, W. G., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures. J. Vis. Exp. (79), e50535, doi:10.3791/50535 (2013).

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Abstract

प्लाज्मा झिल्ली microdomains लिपिड और स्टेरोल पर्यावरण के भौतिक गुणों पर आधारित विशेषताएं हैं और प्रक्रियाओं को संकेत में विशेष भूमिका है. प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए संयंत्र कोशिकाओं से स्टेरोल समृद्ध झिल्ली microdomains निकालने एकाधिक तैयारी कदम और अन्य सेलुलर डिब्बों से संदूषण के लिए स्रोतों की वजह से एक मुश्किल काम है. प्लाज्मा झिल्ली एक संयंत्र सेल में सब झिल्ली के बारे में केवल 5-20% का गठन किया है, और इसलिए अत्यधिक शुद्ध प्लाज्मा झिल्ली अंश का अलगाव चुनौती दे रहा है. एक बार इस्तेमाल विधि 95% 1 की पवित्रता के साथ प्लाज्मा झिल्ली पुटिका जो पैदावार पॉलीथीन ग्लाइकोल और dextran में जलीय दो चरण विभाजन, शामिल है. प्लाज्मा झिल्ली के भीतर Sterol युक्त झिल्ली microdomains क्षारीय पीएच पर ठंड nonionic डिटर्जेंट के साथ इलाज पर अघुलनशील हैं. इस डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंश के रूप में ultracentrifugation द्वारा थोक प्लाज्मा झिल्ली से अलग किया जा सकता हैucrose ढाल 2. बाद में, प्रोटीन मेथनॉल / क्लोरोफॉर्म तेज़ी से sucrose ढाल का कम घनत्व बैंड से निकाला जा सकता है. निकाले प्रोटीन तो, पच desalted और अंत में LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण trypsin किया जाएगा. स्टेरोल युक्त microdomains के लिए हमारी निकासी प्रोटोकॉल Arabidopsis thaliana सेल संस्कृतियों से साफ डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंशों की तैयारी के लिए अनुकूलित है.

हम ब्याज 3 के जैविक उपचार के बाद मात्रात्मक तुलनात्मक प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए केवल नाइट्रोजन स्रोत के रूप में कश्मीर में 15 सं 3 के साथ Arabidopsis thaliana निलंबन सेल संस्कृतियों का पूरा चयापचय लेबलिंग का उपयोग करें. संयुक्त प्रोटीन निकासी के लिए लेबल और unlabeled सेल संस्कृतियों के बराबर अनुपात मिश्रण करके अंतिम मात्रात्मक परिणाम पर तैयारी चरणों का प्रभाव कम से कम रखा है. इसके अलावा निकासी के दौरान माल की हानि नियंत्रण और एक ही तरीके से इलाज के नमूने, एक दोनों को प्रभावित करेगाडी इसलिए प्रकाश और उसांस पेप्टाइड का अनुपात स्थिर रहेगा. प्रस्तावित विधि में लेबल या अन्य 4 नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, जबकि unlabeled सेल संस्कृति, एक जैविक उपचार प्रक्रिया से गुजरता है या तो.

Introduction

1972 में, जोनाथन सिंगर और गर्थ निकोल्सन आम तौर पर जल्दी 1960 में स्वीकार किया गया था कि प्रोटीन लिपिड प्रोटीन सैंडविच मॉडल की जगह, द्रव मोज़ेक मॉडल सेलुलर झिल्ली की एक संरचना मॉडल का प्रस्ताव रखा. सिंगर और निकोल्सन जैविक झिल्ली सभी लिपिड और प्रोटीन अणु स्वतंत्र रूप से और आसानी से 5 फैलाना जहां एक दो आयामी तरल के रूप में माना जा सकता है कि माने. उस समय से, झिल्ली संरचना के प्लाज्मा झिल्ली और ज्ञान की संरचना मॉडल भी अधिक जटिल हो गया. विशेष रूप से, प्लाज्मा झिल्ली के भीतर, ऐसे प्रोटीन परिसरों और लिपिड / स्टेरोल आधारित संरचना की दृष्टि से अव्यवस्थित microdomains रूप संरचनाओं मनाया जा सकता है. कृत्रिम मॉडल झिल्ली 6,7 में, sterols और sphingolipids laterally बदल भौतिक सुविधाओं के साथ क्षेत्रों के लिए फार्म अन्य लिपिड प्रजातियों से अलग कर सकते हैं. सेलुलर झिल्ली के भीतर इस अलगाव मुख्य रूप से sterols और अत्यधिक एसए के बीच स्वयं को संबद्ध गुणों के कारण होता हैphopsho और sphingolipids 8 turated हाइड्रोकार्बन जंजीरों. विशेष रूप से, कठोर स्टेरोल छल्ले stiffer और straighter संतृप्त लिपिड प्रजातियों और इन मुलाकातों झिल्ली मोटाई और कठोरता बढ़ रही है, और अधिक बढ़ाया रचना में पड़ोसी हाइड्रोकार्बन चेन बल के साथ बातचीत का पक्ष लिया.

स्टेरोल समृद्ध झिल्ली microdomains की सामान्यतः मनाया सुविधाओं में से एक गैर ईओण डिटर्जेंट जैसे एक ट्राइटन X-100 या बृज 35 के साथ उपचार पर उनकी जटिलता था. इन अंशों झिल्ली microdomains साथ समान माना गया और उनकी जैव रासायनिक तैयारी विधि 2 पर आधारित डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली (डीआरएम) कहा जाता था. डीआरएम निकासी के दौरान nonionic डिटर्जेंट के उपयोग के जैव रासायनिक डीआरएम तैयारी सीधे जीवित कोशिका 9 के भीतर किसी भी विशिष्ट झिल्ली डिब्बे के अनुरूप नहीं हो सकता है के रूप में कुछ आलोचना का स्वागत किया. विशेष रूप से, प्रोटीन अनुपात करने के लिए डिटर्जेंट, इस तरह की तैयारी में महत्वपूर्ण लगता है एकअलग डिटर्जेंट, साथ ही विभिन्न डिटर्जेंट मात्रा में डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंश 10 की अलग संरचना प्राप्ति कर सकते हैं. हालांकि, विशेष प्रोटीन प्रजाति विशेष रूप से इन सेलुलर स्टेरोल युक्त झिल्ली डोमेन के साथ संबद्ध है, और इन प्रोटीनों अच्छी तरह डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली भिन्न 11 के जैव रासायनिक तैयारी में समृद्ध कर रहे हैं कि कि सबूत है. संयंत्र डीआरएम अंश में पाया गया कि, और DRMS ​​में उपस्थिति निर्भर स्टेरोल था जिसके लिए प्रोटीन की कोर, ऐसे fasciclin तरह arabinogalactan प्रोटीन (Flas) और SKU प्रोटीन परिवार के सदस्यों के रूप में विशेष रूप से जीपीआई लंगर डाले प्रोटीन थे. इसके अलावा ऐसे रिसेप्टर की तरह kinases या phospholipases के रूप में कुछ संकेत प्रोटीन, 11 पाया गया. इन परिणामों स्तनधारी झिल्ली microdomains 12,13 पर कई प्रोटिओमिक पढ़ाई के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा पौधों में तनाव प्रतिक्रिया 14 के संदर्भ में झिल्ली microdomains की भूमिका के लिए सबूत नहीं बढ़ रही है -16.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्लाज्मा झिल्ली microdomains के विभाजन के लिए एक मजबूत तरीका प्रदान करता है और विशेष रूप से हमें स्टेरोल युक्त झिल्ली डिब्बे 4,11,14 का तनाव प्रेरित परिवर्तन को चित्रित करने की अनुमति देता है कि डिटर्जेंट एकाग्रता के लिए एक प्रोटीन का उपयोग करता है.

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Protocol

प्रक्रिया

निकासी प्रोटोकॉल में इस्तेमाल आम अभिकर्मकों और buffers:

  1. Arabidopsis thaliana निलंबन सेल संस्कृतियों के लिए जेपीएल मध्यम
    • 3 माइक्रोन एच 3 बो 3
    • 3 माइक्रोन MnSO 4 एक्स एच 2 हे
    • 1.1 माइक्रोन ZnSO 4 x 7 एच 2 हे
    • 0.15 माइक्रोन के.जे.
    • 0.03 माइक्रोन ना 2 Moo 4 एक्स 2 एच 2 हे
    • 3 एनएम CoCl 2 एक्स 6 एच 2 हे
    • 3 एनएम CuSO 4 एक्स 5 एच 2 हे
    • 0.9 मिमी 2 CaCl 2 एक्स एच 2
    • 0.5 मिमी MgSO 4 x 7 एच 2 हे
    • 0.5 माइक्रोन FeSO 4 x 7 एच 2 हे
    • 0.5 माइक्रोन 2 EDTA एक्स 2 एच ना 2 हे
    • 0.12 माइक्रोन thiamine एचसीएल
    • 0.16 माइक्रोन निकोटिनिक एसिड
    • 0.097 माइक्रोन pyridoxine एचसीएल
    • 0.107 माइक्रोन NAA
    • 0.375 मिमी के.एच. 2 पीओ 4
    • 0.061 मिमी नाह2 पीओ 4 एक्स 2 एच 2 हे
    • 0.039 मिमी ना 2 4 HPO
    • 0.027 मिमी ग्लाइसिन
    • 0.56 मिमी Myo-inositol
    • 1.5% sucrose
    • 10 मिमी कश्मीर 14 सं 3 या 10 मिमी कश्मीर 15 सं 3

नोट: जेपीएल माध्यम की पीएच KOH के साथ 5.7 करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. मध्यम निस्पंदन या autoclaving का उपयोग करने के लिए पहले से निष्फल होना चाहिए.

  1. बफर एच
    • 100 मिमी HEPES-KOH (7.5 पीएच)
    • 250 मिमी sucrose
    • 10% (w / v) ग्लिसरॉल
    • 5 मिमी EDTA
    • 5 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड
    • 0.6% (w / v) पीवीपी कश्मीर 25 या कश्मीर-30
    • 5 मिमी डीटीटी (ताजा जोड़)
    • 1 मिमी PMSF (ताजा जोड़)
    • प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक (ताजा जोड़)
      • 50 मिमी NAF
      • 1 मिमी ना 3 वीओ 4
      • 1 मिमी benzamidin
      • 0.3 माइक्रोन mikrocystin
      • 4 माइक्रोन leupeptin
      • protease अवरोध कॉकटेल
  2. बफर आर
    • 5 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट
    • 0.33 एम सुक्रोज
    • 3 मिमी KCl
    • 0.1 मिमी EDTA
    • 1 मिमी डीटीटी (ताजा जोड़)
  3. बफर TNE
    • 25 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच
    • 150 मिमी NaCl
    • 5 मिमी EDTA
  4. दो चरण प्रणाली (6 जी प्रणाली नमूना ताजा वजन के 15 ग्राम के लिए उपयुक्त है) विधि तैयारी
    नीचे सूचीबद्ध और 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब मिश्रण सामग्री में मिश्रण अच्छी तरह से:
    • 20% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) dextran T500 - 2.6 जी
    • 40% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) (खूंटी 3350) - 1.3 जी
    • सुक्रोज - 0.678 ग्राम
    • 0.2 एम पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.8-0.15 मिलीलीटर
    • 2 एम KCl - 0.014 मिलीग्राम
    • दो चरण प्रणाली के कुल द्रव्यमान 6 ग्राम है जब तक पानी जोड़ें.
  5. TNE बफर में सुक्रोज समाधान
    • 2.4 मीटर, 1.6 मीटर, 1.4 मीटर, 0.15 मीटर
  6. Trypsin पाचन के लिए अभिकर्मकों
    • UTU: 6 एम यूरिया, 2 एम Thiourea (10 मिमी Tris-एचसीएल के साथ 8.0 पीएच) कमी बफर (पानी में 1 ग्राम / μl डीटीटी, 6.5 मिमी)
    • Alkylation बफर (पानी में 5 ग्राम / μl iodoacetamide, 27 मिमी)
    • LysC Endopeptidase (0.5 माइक्रोग्राम / μl)
    • Trypsin, संशोधित अनुक्रमण ग्रेड (0.4 माइक्रोग्राम / μl)
  7. सी 18 से अधिक पेप्टाइड desalting लिए अभिकर्मकों
    • मेजबान समाधान: 2% trifluoroacetic एसिड (TFA), पानी में 5% acetonitrile
    • समाधान एक: 0.5% एसिटिक एसिड
    • समाधान बी: ​​80% acetonitrile, 0.5% एसिटिक एसिड
  8. Phosphopeptide संवर्धन के लिए अभिकर्मकों
    • समाधान एक: 0.1% TFA, 5% acetonitrile
    • समाधान बी: ​​0.1% TFA, 80% acetonitrile
    • 2 TiO 10 माइक्रोन
    • अमोनिया (शेयर 25% समाधान)
    • Piperidine (शेयर 100%)

प्रोटोकॉल

1. Arabidopsis thaliana सेल निलंबन संस्कृतियों के चयापचय लेबल

  1. Arabidopsis कर्नल -0 सेल विकसितपूर्ण 14 एन जेपीएल माध्यम में पत्तियां 17 से व्युत्पन्न निलंबन संस्कृतियों, 80 से 100 μmol / एम पर लगातार प्रकाश हालत में बाँझ फ्लास्क में 15 एन जेपीएल मध्यम में और संस्कृतियों में से एक सेट (18 "आम अभिकर्मकों और buffers" खंड देखें) 120 rpm पर मिलाते हुए निरंतर तहत 2 है, 23 डिग्री सेल्सियस,.
  2. सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए, 1 एल बोतल में सात दिन पुराने सेल संस्कृति के 40 एमएल के साथ ताजा जेपीएल माध्यम की 400 मिलीलीटर टीका लगाना.
  3. सेल संस्कृतियों की कटाई एक स्टेनलेस स्टील के जाल के साथ एक विस्तृत कांच कीप के माध्यम से वैक्यूम सक्शन के माध्यम से होता है. प्रकोष्ठों जाल प्लेट पर और कीप में जमा है और आसानी से वहां से एकत्र किया जा सकता है. प्रकोष्ठों पीसने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं.

नोट: 15 एन के लिए मुमकिन लेबल सेल संस्कृतियों दो सप्ताह 19 से अधिक कम से कम दो मार्ग के लिए नाइट्रोजन का एकमात्र स्रोत के रूप में कश्मीर में 15 सं 3 का उपयोग करें. अनुभव मेंतुलनात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए riments, एक 15 एन लेबल सेल संस्कृति का उपयोग और भी सामान्य मध्यम में एक unlabeled संस्कृति को बनाए रखने. अन्य (चित्रा 1) के नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, जबकि जैविक उपचार तो, लेबल या unlabeled या तो संस्कृति को लागू किया जाएगा. प्रोटीन तैयारी के लिए, दोनों संस्कृतियों 20 संयुक्त हो जाएगा. प्रयोगात्मक स्थापना की योजना बना, हम एक पारस्परिक लेबलिंग ही इलाज एक बार unlabeled कोशिकाओं को 15 एन लेबल की कोशिकाओं को एक बार लागू किया जाता है, जिसमें सेटअप 4 और संबंधित unlabeled या 15 एन लेबल कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में सेवा पर ​​विचार करने की सलाह देते. इस मामले में, सेल संस्कृतियों का डबल मात्रा की जरूरत है.

2. प्लाज्मा झिल्ली शोधन

नोट: यह अन्यथा उल्लेख किया है जब तक कि सभी आगे कदम ठंडे कमरे और / या बर्फ पर बाहर किया जाता है.

  1. तरल नाइट्रोजन में 7 दिनों पुराने सेल निलंबन संस्कृतियों के बारे में 1 एल से कोशिकाओं homogenize.सामग्री आगे उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  2. एक बीकर में ताजा वजन के आधार पर लेबल और unlabeled जमी सेल संस्कृतियों का एक ही मात्रा में मिलाएं और तुरंत बफर एच के 2 संस्करणों जोड़ें. झिल्ली microdomain तैयारी के मामले में यह कम से कम 7 जी दोनों लेबल और unlabeled कोशिकाओं की ताजा वजन का उपयोग करने का सुझाव दिया है.
  3. एक प्रकार के बरतन पर बीकर प्लेस और सामग्री पिघल गए और समाधान तरल और बर्फ क्रिस्टल के बिना है जब तक हिला.
  4. 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में Miracloth की एक परत के माध्यम से homogenate तक.
  5. 8 मिनट के लिए 10,000 XG पर बफर एच और अपकेंद्रित्र के साथ शेष नमूनों.
  6. के बारे में 32 मिलीलीटर की मात्रा के साथ, पूर्व ठंडा अल्ट्रा अपकेंद्रित्र ट्यूब (रोटर Beckman कल्टर SW31Ti के लिए उदाहरण के लिए) में सतह पर तैरनेवाला लोड
  7. शेष बफर एच के साथ नमूने और Beckman SW32Ti रोटर का उपयोग कर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 XG पर centrifuging द्वारा microsomes गोली.
  8. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालें.

    नोट: सतह पर तैरनेवाला घुलनशील प्रोटीन होता है. इस अंश की एक छोटी राशि भी घुलनशील प्रोटीन के आगे प्रोटीन तेज़ी और बाद के विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है.

    1. बफर आर के संबंधित राशि में प्रत्येक नमूने की झिल्ली गोली Resuspend और U1 दो चरण प्रणाली के शीर्ष (चित्रा 2) पर लोड. 6 जी दो चरण प्रणाली का इस्तेमाल किया जाता है, तो resuspended झिल्ली गोली से ठीक 2 जी लोड.

    नोट: बफर आर के अंतिम मात्रा (6 ग्राम प्रणाली का उपयोग करते समय बफर आर के 1.6 मिलीलीटर की जरूरत है ~) का प्रयोग किया जा रहा है कि दो चरण सिस्टम के आकार पर निर्भर करता है. यह तो शुद्ध बफर बल्कि दो चरण प्रणाली पर पूरे नमूना लोड करने में सक्षम होना solubilization के लिए बहुत ज्यादा बफर का उपयोग और नहीं की तुलना में, मांग वजन प्राप्त करने के लिए दो चरण सिस्टम पर जोड़ा जा सकता है मेजबान के लिए कम बफर का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.

    1. वें के लिए इस्तेमाल के रूप में शुद्ध बफर आर के समान मात्रा लोडU2 पर ई नमूना मेजबान.
    2. उन्हें धीरे धीरे 30x (लगभग 1 उलटा / सेक) inverting द्वारा U1 और U2 ट्यूबों मिश्रण.

    नोट: सख्ती दो चरण प्रणाली हिला नहीं है. यह ultracentrifugation कदम में चरणों की जुदाई की कमी पैदा कर सकता है.

    1. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,500 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र.
    2. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    3. U2 पर U1 से ऊपरी चरण हस्तांतरण और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1500 XG पर centrifugation दोहराएँ.
    4. SW41Ti ultracentrifuge ट्यूबों में U2 से ऊपरी चरण ले जाएँ और बफर आर के पांच संस्करणों के साथ यह पतला और मिश्रण अच्छी तरह से.

    नोट: अंतिम ऊपरी चरण यह पांच गुना पतला किया जा सकता से पहले अलग ultracentrifuge ट्यूबों में विभाजित किया जा सकता है.

    1. SW41Ti रोटर का उपयोग कर एक घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 200,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र.
    2. Smal में Resuspend झिल्ली गोलीTNE बफर के एल राशि डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली के अलगाव के लिए (आमतौर पर बफर के 200 μl प्रयोग किया जाता है).

    नोट: इस अंश की एक छोटी राशि unfractionated प्लाज्मा झिल्ली के विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है.

    नोट: प्लाज्मा झिल्ली अंश रातोंरात डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली और डिटर्जेंट घुलनशील भागों में विभाजन से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

    3. डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली तैयारी

    1. ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्लाज्मा झिल्ली अंश की एकाग्रता की जाँच करें.
    2. प्लाज्मा झिल्ली अंश को ट्राइटन X-100 जोड़ें. डिटर्जेंट के अंतिम एकाग्रता 0.5-1% के बीच रहना चाहिए. वजन अनुपात करने के लिए प्रोटीन वजन करने के लिए डिटर्जेंट 13-15 के बीच रहना चाहिए.
    3. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के आस - पास 100 rpm पर हिला नमूनों.
    4. सुक्रोज की 1.8 मीटर अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इलाज प्लाज्मा झिल्ली की एक मात्रा को 2.4 एम sucrose के तीन खंडों में जोड़ें. </ ली>
    5. चित्रा 3 में सचित्र के रूप में 1.8 मीटर अंश के शीर्ष पर संबंधित सुक्रोज समाधान लोड करके SW41Ti ultracentrifuge ट्यूब में sucrose ढाल तैयार करें.
    6. बैकमैन SW41Ti रोटर का उपयोग कर 18 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 250,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र.
    7. ध्यान से 0.15 M/1.4 एम sucrose के इंटरफेस में एक दूधिया की अंगूठी के रूप में दिखाई दे सकता है जो कम घनत्व बैंड का खलल न डालें से बचने के लिए रोटर से ultracentrifuge ट्यूबों निकालें. कभी कभी कुछ भी नहीं देखा जा सकता है लेकिन अंश अभी भी डिटर्जेंट प्रतिरोधी प्रोटीन अंश होता है.
    8. ढाल के ऊपर से 0.75 मिलीग्राम मात्रा के अंश निकालें. अंतरावस्था अंगूठी और नीचे 0.5 मिलीग्राम से ऊपर लगभग 1.5 मिलीलीटर की मात्रा जो कवर अंशों 2 और 3 डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंश का प्रतिनिधित्व करते. 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में इन भिन्न लीजिए. Fractions 9 और 10 डिटर्जेंट घुलनशील झिल्ली अंश होते हैं और भी तुलना के लिए एकत्र किया जा सकता है. आगे के विश्लेषण, पूल fract के लिएआयनों 2 और 3 के रूप में अच्छी तरह से भिन्न 9 और 10.

    4. मेथनॉल / क्लोरोफॉर्म द्वारा डिटर्जेंट प्रतिरोधी अंश से प्रोटीन की निकासी

    नोट: सभी कदम कमरे के तापमान में किया जाता है.

    1. अच्छी तरह से एकत्र भिन्न और भंवर मेथनॉल 4 मात्रा में जोड़ें.
    2. 1 क्लोरोफॉर्म की मात्रा, भंवर अच्छी तरह से जोड़ें.
    3. अच्छी तरह से पानी के 3 खंडों, भंवर जोड़ें.
    4. एक benchtop अपकेंद्रित्र (जैसे Eppendorf 5417R) का उपयोग कर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र.
    5. अंतरावस्था में प्रोटीन की परत के ऊपर जलीय चरण निकालें.
    6. अच्छी तरह से मेथनॉल के 3 खंडों, भंवर जोड़ें.
    7. 10 मिनट के लिए 4000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र.
    8. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली सूखी. सूखे गोली में समाधान पाचन के लिए तैयार है.

    5. इन समाधान trypsin पाचन

    नोट: इस प्रक्रिया में सभी चरणों में किया जाता हैdenaturants द्वारा एमिनो एसिड पक्ष श्रृंखला के अवांछित derivatization कम करने के लिए कमरे के तापमान.

    1. 6 एम यूरिया, 2 एम thiurea, पीएच 8 (UTU) की छोटी मात्रा में नमूना भंग. नमूना (आमतौर पर लगभग 40 μl) के साथ संगत है जितनी कम मात्रा का प्रयोग करें.
    2. किसी भी अघुलनशील सामग्री गोली 10 मिनट के लिए एक benchtop अपकेंद्रित्र (जैसे Eppendorf 5417R) में 5,000 XG पर UTU में solubilized स्पिन नमूने.
    3. अंतिम समाधान के पीएच इष्टतम trypsin पाचन के लिए 8.0 के आसपास होना चाहिए. पीएच स्ट्रिप्स के साथ की जाँच करें.
    4. नमूना प्रोटीन की हर 50 ग्राम के लिए कमी बफर के 1 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट सेते हैं.

    नोट: प्रोटीन सामग्री का केवल एक मोटा अनुमान आवश्यक है. नमूना राशि सीमित है बल्कि यह एक प्रोटीन परख पर नमूना बर्बाद से सटीकता बलिदान करने के लिए बेहतर है.

    1. हर 50 ग्राम नमूना प्रोटीन के लिए alkylation बफर के 1 μl जोड़ें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट सेते.
    2. 50 माइक्रोग्राम नमूना प्रोटीन प्रति lysC के 0.5 μl जोड़ें और लगातार 700 rpm पर झटकों के साथ कमरे के तापमान पर तीन घंटे के लिए सेते हैं. यदि आवश्यक हो, डाइजेस्ट भी रात भर बाहर किया जा सकता है. हालांकि, गर्म तापमान पर विस्तारित समय यह कारण जलीय पीएच 8 परिस्थितियों में प्लास्टिक ट्यूब सामग्री को सोखना के लिए पेप्टाइड नुकसान को बढ़ा सकते हैं के रूप में अनुशंसित नहीं है.
    3. चार खंडों 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8 के साथ नमूना पतला.

    नोट: यह चरण trypsin उच्च नमक के प्रति बहुत संवेदनशील है के रूप में यूरिया एकाग्रता कमजोर करने के लिए अत्यंत आवश्यक है.

    1. 50 माइक्रोग्राम नमूना प्रोटीन प्रति trypsin के 1 μl जोड़ें और लगातार 700 rpm पर झटकों के साथ कमरे के तापमान पर रातोंरात सेते हैं.
    2. पीएच 2 (2% trifluoracetic एसिड की लगभग 1/10 मात्रा जोड़) तक पहुँचने के लिए 0.2% TFA अंतिम एकाग्रता के लिए नमूने खट्टा करना.

    नोट: नमूनों में संग्रहित किया जा सकता है - आगे इस्तेमाल किया 20 डिग्री सेल्सियस तक, लेकिन यह स्टोर करने के लिए बेहतर है4 डिग्री सेल्सियस पर StageTips पर उन्हें यह एक कम समय (एक सप्ताह) के लिए या StageTips desalting बाद उन्हें दुकान है.

    6. सी 18 StageTips का विनिर्माण

    1. इस तरह के एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पेट्री डिश के रूप में एक फ्लैट, स्वच्छ सतह पर एक Empore डिस्क C18 रखें.
    2. 1.5 मिमी व्यास के साथ एक कुंद इत्तला दे दी चमड़े के नीचे सुई का उपयोग करते हुए एक छोटे डिस्क बाहर पंच. डिस्क सुई में चिपक जाता है और एक विंदुक टिप में स्थानांतरित किया जा सकता है.
    3. सुई से बाहर डिस्क पुश और जुड़े सिलिका या सुई के अंदर में फिटिंग ट्यूबिंग का एक टुकड़ा से एक विंदुक टिप के गावदुम में यह तय कर लो.

    नोट: StageTips कमरे के तापमान 21 पर शुष्क संग्रहित किया जा सकता है.

    7. पेप्टाइड desalting और एकाग्रता के लिए सी 18 StageTips का प्रयोग करें

    1. तैयार StageTip पर समाधान बी के 50 μl रखकर एक सी 18 StageTip हालत. एक benchtop सी में 2 मिनट के लिए 2000 rpm पर अपकेंद्रित्र में टिप स्पिनentrifuge (जैसे Eppendorf 5417R).

    नोट: एक Eppendorf अपकेंद्रित्र में StageTips स्पिन करने के लिए प्रयोग करें एडेप्टर, तरल एक 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में एकत्र किया जाएगा. बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए, चरण सुझावों को भी 200 μl सुझावों में से 96 के साथ एक टिप रैक में रखा जा सकता है और तरल एक microtiter प्लेट में एकत्र किया जा सकता है.

    नोट: कारण सिरे से सी 18 डिस्क बाहर कताई के जोखिम को एक benchtop अपकेंद्रित्र (जैसे Eppendorf 5417R) में 3,000 XG तुलना में उच्च गति का उपयोग न करें.

    1. 100 μl समाधान ए एक benchtop अपकेंद्रित्र (जैसे Eppendorf 5417R) में 5,000 XG पर अपकेंद्रित्र में टिप स्पिन का उपयोग StageTip संतुलित करना.
    2. चरण 2 दोहराएँ.
    3. ध्यान से अंदर डिस्क के साथ विंदुक टिप में नमूना pipetting द्वारा डिस्क पर लोड नमूना.

    ध्यान दें: एक डिस्क लगभग बाध्य कर सकते हैं. प्रोटीन की 100 ग्राम.

    1. CE में सुझावों स्पिनntrifuge नमूना की पूरी मात्रा 18 सी डिस्क के माध्यम से पारित जब तक.
    2. समाधान ए के 100 μl अपकेंद्रित्र में सुझावों स्पिन के साथ StageTips दो बार धोएं.

    नोट: धोया और भरी हुई StageTips एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

    1. एक ताजा 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में eluate लीजिए समाधान बी के 40 μl के साथ नमूना Elute.
    2. गति VAC में नमूना ध्यान लगाओ. छोड़ दिया है बस के बारे में 1 या 2 μl तरल रूप में वहाँ आदर्श परिस्थितियों में, निर्जलीकरण की प्रक्रिया को रोकने.

    नोट: सूखे नमूने साल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है.

    1. नमूने के लिए मेजबान समाधान के 9 μl के अंतिम मात्रा जोड़ें और सामूहिक कल्पना के विश्लेषण के लिए microtiterplate को हस्तांतरण.

    नोट: प्रयुक्त मेजबान बफर के अंतिम मात्रा प्रयोगकर्ता और मास स्पेक्ट्रोमीटर की संवेदनशीलता की जरूरतों पर निर्भर हैइस्तेमाल किया.

    8. Phosphopeptide संवर्धन के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल

    नोट: phosphopeptide संवर्धन के लिए, चरण 2 में प्रोटीन निष्कर्षण फॉस्फेट inhibitors की उपस्थिति में किया जाना चाहिए.

    नोट: सटीक प्रोटीन एकाग्रता निम्नलिखित कदम के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता नहीं है. यह अनावश्यक नमूना नुकसान से बचने के लिए प्रोटीन का एक मोटा अनुमान है करने के लिए पर्याप्त है

    1. सी 8 StageTips (6 चरण में 18 सी-StageTips की तैयारी के लिए एक ही प्रोटोकॉल का पालन) तैयार करें.
    2. तैयार सी 8 StageTips के शीर्ष पर स्थानांतरण TiO 2 मोती का 1 मिलीग्राम (प्रोटीन की 100 ग्राम प्रति उपयोग 1 मिलीग्राम 2 TiO).
    3. एक benchtop अपकेंद्रित्र (जैसे Eppendorf 5417R) में 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर समाधान सी, स्पिन के 100 μl के साथ TiO 2-सुझावों संतुलित करना.
    4. (यह समाधान के 100 μl में होना चाहिए कदम 7.7 से पचता है और desalted पेप्टाइड्स की 100 ग्राम मिक्सबी) समाधान ए के 100 μl के साथ
    5. 1,000 XG, 5 मिनट में स्पिन; equilibrated TiO 2 कॉलम पर मिश्रित नमूना लोड.
    6. प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और (दूसरा पास के बाद के माध्यम से प्रवाह रखने के लिए) एक ही बार फिर नोक पर इसे लोड.
    7. समाधान के लिए एक के 100 μl के साथ टिप धो, 2,000 XG पर स्पिन, एक benchtop अपकेंद्रित्र (जैसे Eppendorf 5417R) में 5 मिनट.
    8. 5% अमोनिया की 50 μl के साथ नमूना Elute.
    9. 5% piperidine के 50 μl (दोनों eluates जोड़ा जा सकता है) के साथ नमूना Elute.
    10. इसके तत्काल बाद 20% फॉस्फोरिक एसिड के 50 μl का उपयोग नमूना खट्टा करना. पीएच लगभग 2 में होना चाहिए.

    नोट: TiO 2 युक्तियाँ सहेजें और पाउडर निकालते हैं. यह समाधान बी के साथ धोया और एक या दो और राउंड के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है.

    1. फिर से (चरण 8 देखें) सी 18 सुझावों पर acidified नमूने फीका बनाना.

    9. पेप्टाइड मिश्रण LC-MS/MS विश्लेषण

    1. Desalted Phosph Resuspendमेजबान बफर में opeptides.
    2. लोड चुनाव के LC-MS/MS सिस्टम पर नमूना resuspended और आधा अधिकतम पर 60,000 पूर्ण चौड़ाई के सुझाव के प्रस्ताव पर डेटा निर्भर मोड में स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण.

    नोट: इष्टतम विखंडन के लिए, तटस्थ नुकसान स्कैनिंग या तो multistage सक्रियण 23 22 आवेदन किया है, या यदि उपलब्ध हो जाना चाहिए. ETD उपलब्ध है, तो यह फॉस्फोरिक एसिड 24 की हानि के बिना पेप्टाइड रीढ़ विखंडन की अनुमति देगा.

    नोट: कच्चे डेटा से पीक सूचियों निकाला और डेटाबेस पहचान करने के साथ ही quantitation के लिए प्रस्तुत करने की आवश्यकता है. यहाँ, हम शुभंकर और LTQ, LTQ-Orbitrap और LTQ फुट उपकरणों (थर्मो वैज्ञानिक) से कच्चे डेटा फ़ाइलों के लिए काम करता है जो MSQuant, उपयोग करने के लिए सेटिंग्स का वर्णन.

    1. MSQuant में "सहायक" मेनू के भीतर DTAsupercharge का उपयोग शिखर सूची निकालें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग.
    2. शुभंकर खोज इंजन को शिखर सूची फ़ाइल परिणामस्वरूप सबमिट करें. सीआरitical सेटिंग्स: जन सहिष्णुता 10 पीपीएम आयन अग्रदूत, एमएस / एमएस जन सहिष्णुता 0.5 दा. निश्चित संशोधन: cysteines के carbamidomethylation, चर संशोधनों: methionine के ऑक्सीकरण, सेरीन की phosphorylation, threonine, tyrosine. Quantitation विधि: 15 एन चयापचय लेबलिंग.
    3. वेब पेज फ़ाइल के रूप में शुभंकर परिणाम बचाओ.
    4. MSQuant में शुभंकर परिणाम फ़ाइल और कच्चे फाइल लोड. ब्याज की सभी प्रोटीन का चयन करें और "स्वचालित quantitation" चलाते हैं. कार्यक्रम कच्चे फ़ाइल से पूर्ण स्कैन स्पेक्ट्रा पढ़ सकते हैं और प्रत्येक पेप्टाइड का लेबल और unlabeled भागीदारों के लिए शिखर एकीकरण करना होगा.
    5. एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम के लिए या एक टैब सीमांकित पाठ फ़ाइल को निर्यात quantitation परिणाम. डेटा तो Excel में या ऐसे Statquant 25 या पटाखा 26 के रूप में आगे सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग आगे सांख्यिकीय विश्लेषण को प्रस्तुत किया जा सकता है.

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Representative Results

मुमकिन लेबल एराबिडोप्सिस सेल संस्कृतियों का उपयोग कर प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ यह संयंत्र ऊतक (Step2, 2 आंकड़े और 4) से प्लाज्मा झिल्ली को अलग, और प्लाज्मा झिल्ली के भीतर डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली भागों के लिए समृद्ध करने के लिए संभव है (चरण 3, 3 आंकड़े और 5). बाद में, प्रोटोकॉल की अनुमति देता है इन डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली भिन्न (चरण 4) और तुलनात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण (5 कदम) के लिए प्रोटीन के पाचन से प्रोटीन की निकासी. अंत में, phosphopeptides (चरण 8) की वैकल्पिक संवर्धन सेलुलर संकेत प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में विशेष रूप से दिलचस्प है. अंतिम चरण तब लेबल और unlabeled सेल संस्कृति से झिल्ली भागों में प्रोटीन बहुतायत अनुपात की मात्रात्मक डेटा विश्लेषण (चरण 9, चित्रा 6) है.

2 चरण प्रणाली (चरण 2) और बाद centrifugation के मिश्रण के बाद ठेठ परिणाम एक स्पष्ट रंग का ऊपरी चरण और एक हैंहरी कम चरण (चित्रा 2) रंग का. हरी क्लोरोप्लास्ट और अन्य आंतरिक झिल्ली से झिल्ली पुटिका कम dextran चरण में शामिल कर रहे हैं, जबकि प्लाज्मा झिल्ली पुटिका preferentially, ऊपरी खूंटी चरण के साथ सहयोगी. रंग जुदाई देखा नहीं जा सकता, तो चरण 2 सही ढंग से बाहर नहीं किया गया था और प्लाज्मा झिल्ली आंतरिक झिल्ली के महत्वपूर्ण मात्रा से दूषित हो जाएगा. प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का संवर्धन दो चरण प्रणाली के निचले चरण में प्लाज्मा झिल्ली भिन्न और प्रोटीन के छोटे aliquots की प्रोटिओमिक विश्लेषण से दिखाया जा सकता है. कम चरण कोशिका के भीतर की झिल्ली में शामिल है. उदाहरण के लिए, ऐसे रिसेप्टर kinase प्रोटीन के रूप में विशेष रूप से ठेठ ज्ञात प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन, प्लाज्मा झिल्ली अंश (प्रधानमंत्री) और आंतरिक झिल्ली (आईएम) युक्त कम चरण अंश (चित्रा -4 ए) में कम बहुतायत में उच्च बहुतायत से पता चला है. उच्च endoplasmatic जालिका शो की बारी में जाना जाता है प्रोटीनभीतरी झिल्ली अंश में बहुतायत और प्लाज्मा झिल्ली अंश (चित्रा 4 बी) में नहीं मनाया गया.

डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली भिन्न (कदम 3) के बाद के संवर्धन आदर्श मामलों में कम घनत्व झिल्ली पुटिका ट्यूब ऊंचाई की लगभग 1/5 वें (चित्रा 3) की एक दूधिया अंगूठी के गठन में परिणाम होगा. प्रोटीन अनुपात (3.2 कदम) को ट्राइटन X-100 सांद्रता या साबुन का समायोजन डिटर्जेंट प्रतिरोधी और डिटर्जेंट घुलनशील भागों में अलग होने के लिए इष्टतम है, तो अतिरिक्त छल्ले ढाल के निचले हिस्सों में देखा जा सकता है और भी झिल्ली clumps हो जाएगा कम घनत्व बैंड में. इन मामलों में, प्रोटीन अनुपात या कुल डिटर्जेंट राशि के लिए डिटर्जेंट दो झिल्ली डोमेन अंशों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलग होने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता से अलग है. प्रोटीन अनुपात को अंतिम डिटर्जेंट एकाग्रता और डिटर्जेंट का प्रयोग इंक, यहाँ वर्णितऐसे remorin के रूप में विशिष्ट microdomain प्रोटीन की ichment (AT3G61260) 27 एक डीआरएम अंश का तुलनात्मक बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण, डिटर्जेंट घुलनशील अंश (कदम 3.8) के साथ ही unfractionated प्लाज्मा झिल्ली और आंतरिक झिल्ली से इसकी पुष्टि की जा सकती है. (चित्रा 6A) के रूप में उम्मीद remorin प्रोटीन की सबसे अधिक बहुतायत डीआरएम भागों में पाया गया था. ऐसे एबीसी ट्रांसपोर्टर AT1G59870 (चित्रा 6B) के रूप में झिल्ली microdomains में मौजूद नहीं प्रोटीन, डीआरएम अंश में एक वृद्धि की बहुतायत नहीं दिखाते. ऐसे 60 राइबोसोम (चित्रा 6D) से ATPase F0 जटिल (चित्रा 6C) और ribosomal प्रोटीन (At1G001100) से एक mitochondrial प्रोटीन (AT2G07707) के रूप में भी विशिष्ट contaminants, डीआरएम अंश में एक समृद्ध बहुतायत नहीं दिखाते न्यूनतम मात्रा कर सकते हैं अभी भी पहचान की जा.

प्लाज्मा में प्रोटीन phosphorylation स्थिति का बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण, प्रोटीन abundances अनुपात के बादलेबल और unlabeled सेल संस्कृतियों की झिल्ली भिन्न मात्रात्मक (चित्रा 6) प्रतिष्ठित किया जा सकता. MSQuant (से विशिष्ट परिणाम msquant.alwaysdata.net ) quantitation खिड़की पहचान पेप्टाइड्स (चित्रा 6A) के अधिकांश के लिए 00:59 के एक आयन तीव्रता अनुपात दिखाना चाहिए. आयन तीव्रता अनुपात काफी 1:1 से हटने के साथ वे पेप्टाइड्स अंतर लेबल और unlabeled सेल संस्कृति के बीच विनियमित के रूप में माना जाता है, और (चित्रा 6C) लागू उपचार से प्रभावित प्रोटीन को मिलान के लिए उम्मीदवार हैं कर रहे हैं. सफल चयापचय लेबलिंग की एक अच्छी गुणवत्ता नियंत्रण के सह क्षालन है लेबल और आंकड़े 6B और विकास में नैनो HPLC जुदाई (चरण 9) में एक भी चोटी के रूप में unlabeled पेप्टाइड संस्करणों के रूप में दिखाया दोनों.

चित्रा 1 चित्रा 1. पूरी तरह से चयापचय लेबल और unlabeled thaliana सेल संस्कृतियों का उपयोग करते समय प्रयोगात्मक डिजाइन के दो वेरिएंट की चयापचय लेबलिंग प्रयोगात्मक रणनीति. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. प्रयोगकर्ता ठीक इसके विपरीत जैविक उपचार या से गुजरना है कि एक नियंत्रण और (पाचन लेबल) 15 एन कोशिकाओं के रूप में (unlabeled) 14 एन कोशिकाओं का उपयोग करने का फैसला कर सकते हैं. एक पारस्परिक प्रयोगात्मक डिजाइन में दोनों वेरिएंट समानांतर में किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. क्लोरोप्लास्ट और अन्य आंतरिक झिल्ली Bott साथ जुड़े जबकि polyethylene glycol (खूंटी) और dextran पर आधारित एक जलीय दो चरण प्रणाली पर संयंत्र झिल्ली पुटिका के विभाजन के लिए कार्यप्रवाह. प्लाज्मा झिल्ली पुटिका ऊपरी खूंटी चरण में विभाजितCentrifugation के बाद ओम dextran चरण. ऊपरी चरण की अतिरिक्त धोने के साथ बेहतर शुद्धि प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह भी सामग्री नुकसान में वृद्धि हुई है.

चित्रा 3
चित्रा 3. कम घनत्व झिल्ली अंशों का संवर्धन कम घनत्व डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंशों के संवर्धन के लिए sucrose ढाल की. प्रतिनिधित्व. कम घनत्व झिल्ली पुटिका बैंड की रात भर Centrifugation के बाद उम्मीद स्थान संकेत दिया है.

चित्रा 4
चित्रा 4. दो चरण प्रणाली में शुद्धिकरण के बाद प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन का संवर्धन. सामान्यीकृतप्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) और आंतरिक झिल्ली (आईएम) के अंश में मापा प्रोटीन के लिए प्रोटीन आयन तीव्रता. (ए) प्लाज्मा झिल्ली की विशिष्ट ज्ञात घटक आईएम अंश में से अपराह्न अंश में बहुत अधिक बहुतायत दिखा. आंतरिक झिल्ली (ख) प्राकृतिक ज्ञात घटकों विपरीत व्यवहार को दर्शाता है. सामान्य बनाने के लिए, प्रत्येक प्रोटीन के लिए आयन तीव्रता रकम नमूना प्रति कुल आयन तीव्रता का एक अंश के रूप में व्यक्त किया गया और फिर प्रतिकृति के बीच औसत. कुल आयन तीव्रता के अंश तो दो उपचार के बीच औसत के सापेक्ष के रूप में व्यक्त किया गया. त्रुटि सलाखों के स्वतंत्र रूप से उगाई सेल संस्कृतियों से तीन तैयारी के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5 चित्रा 5. . मापा भिन्न भीतर मानक प्रोटीन मार्कर की बहुतायत भूखंडों विशेष subcellular डिब्बों के लिए चुना प्रोटीन मार्कर (- स्टेरोल युक्त microdomains, अपराह्न - प्लाज्मा झिल्ली, आईएम - आंतरिक झिल्ली, सपा - घुलनशील प्रोटीन डीआरएम) की सामान्यीकृत प्रोटीन आयन तीव्रता के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. (ए) remorin स्टेरोल युक्त झिल्ली microdomains के लिए एक मार्कर के रूप में, (बी) एबीसी प्रकार ट्रांसपोर्टर परिवार प्रोटीन एक Sterol निर्भर नहीं प्रोटीन के एक प्रतिनिधि के रूप में, (सी) mitochondrial F0 परिसर के सबयूनिट, (डी) 60 के दशक बहुतायत पैटर्न एक ठेठ सह सफ़ाई contaminant के रूप में राइबोसोम की सबयूनिट. सामान्य बनाने के लिए, प्रत्येक प्रोटीन के लिए आयन तीव्रता रकम नमूना प्रति कुल आयन तीव्रता का एक अंश के रूप में व्यक्त किया गया और फिर प्रतिकृति के बीच औसत. कुल आयन तीव्रता के अंश तो दो trea के बीच औसत के सापेक्ष के रूप में व्यक्त किया गयाtments. त्रुटि सलाखों के स्वतंत्र रूप से उगाई सेल संस्कृतियों से तीन तैयारी के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6. स्पष्ट रूप से पेप्टाइड DNNLLGK का लेबल और unlabeled Arabidopsis कोशिकाओं. (ए) पूर्ण स्कैन स्पेक्ट्रम से प्रोटीन के अर्क का एक 1:1 मिश्रण से एक पेप्टाइड की उम्मीद 1:01 आयन तीव्रता अनुपात दिखा MSQuant से मात्रात्मक प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री. स्क्रीन शॉट के परिणाम की उम्मीद अलग करने (राइट शिखर) लेबल और मी / z अक्ष पर पेप्टाइड्स के unlabeled (बाएँ शिखर) संस्करण. monoisotopic द्रव्यमान और पहली आइसोटोप नीले निशान से संकेत कर रहे हैं. (बी) लेबल (नीला) एकनैनो HPLC क्रोमैटोग्राफी दौरान एक भी चोटी के रूप में पेप्टाइड सह Elute के डी unlabeled (लाल) संस्करणों. (सी) एक विभिन्न प्रकार से विनियमित प्रोटीन के लिए एक उम्मीदवार के रूप में 01:05 के आयन तीव्रता अनुपात के साथ एक पेप्टाइड का पूर्ण स्कैन स्पेक्ट्रम. (डी ) भी उलट चरण क्रोमैटोग्राफी में 01:01 सह Elute से अलग अनुपात के साथ प्रोटीन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

इस अखबार में प्रस्तुत प्रोटोकॉल कई चरणों में हैं और उन सभी डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली और डिटर्जेंट घुलनशील भागों में संयंत्र प्लाज्मा झिल्ली की शुद्ध और प्रतिनिधि fractionation प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसलिए, यह निर्देशानुसार प्रत्येक चरण का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है.

गैर ईओण डिटर्जेंट (3.2 कदम) के साथ प्लाज्मा झिल्ली अंश का उपचार झिल्ली microdomain विभाजन की गुणवत्ता पर मजबूत प्रभाव है. विभिन्न तैयारियों के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, और एक ही प्रयोग से विभिन्न नमूनों की तुलना में सक्षम होने के लिए, यह ठीक प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन की एकाग्रता का मूल्यांकन करने और प्रोटीन सामग्री के लिए सम्मान के साथ एक ही अनुपात में हमेशा डिटर्जेंट लागू करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और हमेशा एक ही अंतिम एकाग्रता के लिए. व्यावहारिक रूप से, यह कभी कभी यह उच्च प्रोटीन एकाग्रता के साथ नमूनों को कमजोर करने या अलग एकाग्रता शेयरों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है कि इसका मतलब हैट्राइटन X-100 के.

जैव रासायनिक अध्ययन में, हाल ही में झिल्ली microdomains 28-30 के अलगाव के लिए एक डिटर्जेंट मुक्त विधि का उपयोग करने के लिए शोधकर्ताओं के बीच एक प्रवृत्ति किया गया है. इन विधियों फ्रेंच दबाव सेल प्रेस करने के लिए सादृश्य में एक बहुत छोटी सुई के माध्यम से बाल काटना द्वारा प्लाज्मा झिल्ली का एक यांत्रिक विघटन पर आधारित हैं. इन प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक झिल्ली microdomains में अमीर स्तनधारी सेल संस्कृतियों के लिए लागू किया गया है, लेकिन जीव (खमीर, पादप कोशिकाओं) से युक्त कोशिका दीवार के लिए आवेदन की सूचना नहीं किया गया है. ऐसे मिथाइल बीटा cyclodextrin रूप स्टेरोल में खलल न डालें एजेंटों, साथ साथ मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स का प्रयोग, यह संयंत्र प्लाज्मा झिल्ली से तैयार डीआरएम भिन्न झिल्ली microdomains 11 के लिए मार्कर हैं कि प्रोटीन होते है कि दिखाया गया था.

बड़े पैमाने पर spectrometric quantitation के अंतिम परिणाम के बारे में, 6 चित्र में दिखाया ठेठ परिणाम में आदर्श स्थिति का प्रतिनिधित्वलेबल और unlabeled पेप्टाइड्स के बहुमत के लिए आयन तीव्रता समान के करीब हैं जो. हालांकि, कुछ मामलों में लेबल और unlabeled सेल संस्कृतियों के सेट के बीच जैविक विभिन्नता का एक निश्चित डिग्री मनाया जा सकता है. इस प्रकार, का जैविक उपचार से पहले लेबल या unlabeled सेल संस्कृति, लेबल और unlabeled नियंत्रण कोशिकाओं का एक मिश्रण का विश्लेषण किया जाता है, या तो दोनों किसी भी उपचार के बिना, एक स्थितियों के लिए आदर्श एक से भटका हुआ एक अनुपात के साथ पेप्टाइड्स की पहचान देता है. मुक़्तलिफ़ अनुपात के साथ ये प्रोटीन जैविक विभिन्नता के लिए संकेत कर रहे हैं. जैविक विभिन्नता से ख़ास उपचार प्रभाव की चुनौती से निपटने के लिए, हम इसलिए बनती प्रयोगों 20 में पारस्परिक लेबलिंग का उपयोग करने का प्रस्ताव है. पारस्परिक प्रयोगात्मक सेटअप में, चित्रा 1 में प्रस्तावित प्रयोग के दोनों वेरिएंट प्रदर्शन कर रहे हैं और के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल के कदमों का अनुसरण कर रहे हैं. फिर, पी के आयन तीव्रता के अनुपात की तुलनाआयन तीव्रता के अनुपात के बीच मतभेद जैविक विभिन्नता के लिए या लागू उपचार का एक प्रभाव के रूप में की वजह से कर रहे हैं अगर पारस्परिक प्रयोगों की दोनों से roteins, एक भेद कर सकते हैं.

इलाज के प्रभाव और जैविक विभिन्नता के बीच फर्क समस्या के समाधान के लिए एक अन्य विधि सभी उपचार 31 के लिए एक संदर्भ के रूप में एक आंतरिक लेबल मानक का इस्तेमाल होता है. उस दृष्टिकोण में, unlabeled नियंत्रण और जैविक उपचार से गुजरना है कि unlabeled कोशिकाओं को एक ही बैच से आ रहा है, भारी लेबल नियंत्रण कक्षों की एक ही राशि के साथ मिश्रित कर रहे हैं. यह 14 एन नियंत्रण / 15 एन नियंत्रण और 14 एन उपचार / 15 एन नियंत्रण के आयन तीव्रता के अनुपात काफी अलग हैं, तो प्रोटीन, महत्वपूर्ण के रूप में माना जाता है, क्योंकि पेप्टाइड अनुपात पर जैविक विभिन्नता के प्रभाव को नष्ट करने की अनुमति देता है. लेबल मानक सभी मामलों में एक ही सटीक है, क्योंकि यह संभव है.

डॉ. में से एकयहाँ वर्णित डीआरएम संवर्धन प्रक्रिया के awbacks डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंश में पहचाना जा सकता है कि सह शुद्ध प्रोटीन होते हैं. कम घनत्व डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंश से पहचान प्रोटीन की सूची में, हम नियमित रूप से ribosomal प्रोटीन की एक बड़ी संख्या का निरीक्षण कर सकते हैं. कारण ribosomal प्रोटीन की अपेक्षाकृत कम घनत्व के लिए, वे sucrose ढाल में स्टेरोल निर्भर झिल्ली प्रोटीन के रूप में एक ही अंश में चले जाते हैं. यह ribosomal प्रोटीन स्पष्ट रूप से झिल्ली microdomains 11 के घटक नहीं हैं कि किसी भी शक के बिना दिखाया गया था. इन और वास्तव में डिटर्जेंट प्रतिरोधी कम घनत्व झिल्ली भागों के साथ जुड़ा नहीं अन्य सह शुद्ध प्रोटीन छोड़ने के लिए, हम भी दो से कम dextran चरण से निकाला जा सकता है जो intracellular झिल्ली (आईएम) के प्रोटिओमिक संरचना का विश्लेषण करने का प्रस्ताव चरण प्रणाली और भीतरी झिल्ली और डीआरएम के बीच ख्यात contaminants की बहुतायत के अनुपात की तुलना करनाअंश (चित्रा 5 में उदाहरण देखें). डीआरएम सह शुद्ध प्रोटीन दोनों भिन्न (आईएम और डीआरएम) में भी इसी तरह abundances होनी चाहिए.

सेल के अर्क और झिल्ली microdomains की fractionation प्रोटिओमिक विश्लेषण 32 के लिए एक नमूना में जटिलता को कम करने के लिए एक साझा रणनीति है. इसलिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल संयंत्र कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में संकेतन प्रक्रियाओं के सभी के अध्ययन के लिए उपयोगी है. जैविक आवेदन तनाव प्रतिक्रियाओं के साथ ही प्लाज्मा झिल्ली संरचना और झिल्ली प्रोटीन 14,15 के संशोधन में परिवर्तन प्रेरित एक बड़ी हद तक जो सभी रोगज़नक़ संक्रमण का अध्ययन कर रहे हैं. तनाव प्रतिक्रियाओं का अध्ययन कर इसके अलावा, विभिन्न झिल्ली भागों में प्रोटीन abundances के quantitation बहुत अभी तक अज्ञात प्रोटीन 33 34,35 का एनोटेशन सहायता कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

लेखक, Witold Szymanski, आण्विक प्लांट फिजियोलॉजी के मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट के एक कर्मचारी है. लेखक, Waltraud शुल्ज़ Hohenheim विश्वविद्यालय, जर्मनी में एक कर्मचारी है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise
Ammonia (stock 25 % solution) WAKO 010-03166
TiO2 10 μm GL-Science 5020-75010
Empore Disk C18 Varian 12145004
Polyethylene glycol(PEG 3350) Sigma 88276
Dextran T500 Roth 9219.2
Trypsin Promega V5113
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma P9599
K15NO3 Cambridge Isotope Laboratories NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultracentrifuge Beckman
Plate reader BioTek
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific
Centrifuge 5810R Eppendorf
Centrifuge 5417R Eppendorf
Thermomixer Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25 Christ
Shaker Unimax 2010 Heidolph

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References

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