보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

1Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
* These authors contributed equally
Published 8/10/2013
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Biology

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Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization. J. Vis. Exp. (78), e50538, doi:10.3791/50538 (2013).

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Abstract

포유 동물의 코는 복잡한 내부 구조를 가진 다기능 기관이다. 비강은 이러한 해부학 적 위치, 형태 및 기능에 크게 차이, 후각 호흡하고, 편평 상피 등 다양한 상피 세포에 늘어서있다. 성인 쥐에서 코는 특히 내부 구조, 주요 후각 상피 세포 (MOE)와 같은 후방 등의 사람들에게 실험적인 접근을 제한하는 각종 두개골 뼈 덮여있다. 여기에 우리가 보존 해부 조직과 거의 전체와 그대로 비강 조직을 얻기위한 효과적인 방법을 설명합니다. 해부 현미경 수술 도구를 사용하여, 우리는 순차적으로 비강 조직을 둘러싼 두개골 뼈를 제거합니다. 이 절차는 모두 파라 포름 알데히드 고정 갓 해부, 피부 마우스 머리에 수행 할 수 있습니다. 전체 발골 절차는 기존 화학 기반 데 필요한 실험 시간보다 훨씬 짧은 20 ~ 30 분 정도를 소요석회화. 또한, 우리는 비강 조직 준비에서 그대로 얇은 수평 또는 관상 또는 시상 부분을 얻기위한 중요한 비갑개 사이에 갇힌 공기 방울을 제거하는 쉬운 방법을 제시한다. 우리의 방법을 사용하여 준비 비강 조직은 특히 특정 지역과 관련된 검사와 비교가 관심의 연구에서, 전체 마운트 전체 상피 세포의 관찰뿐만 아니라, 형태 학적, 면역 세포, RNA 등의 현장 하이브리드 화, 그리고 생리 학적 연구에 사용할 수 있습니다.

Introduction

포유류 비강은 조직과 별개의 기능을 제공 기관의 다양한 유형을 포함하고 있습니다. 비강은 폐에 그리고 밖으로 항공 여행을 할 수 상부 호흡기의 입구 부분을 차지합니다. 흡입 공기는 그것뿐만 아니라 청소를하거나, 자극성 및 독성 물질 및 전염성 미생물 2를 제거하는 필터링으로 온도와 습도 조절 1 거쳐 비강을 통해 전달합니다. 두 치료는 비강 상피와 땀샘과 혈관을 포함하여 피하 조직에 의해 수행과 하부기도와 폐를 보호하기 위해 중요합니다. 호흡 상피 방어의 역할뿐만 아니라, 비강 조직은 지나가는 공기에 화학 물질의 넓은 범위를 감지 후각과 삼차 시스템의 말초 감각기구를 포함합니다. 활성화되는 시스템에 따라, 코 화학 물질의 감각 감지 중 하나를 유도 할 수냄새, 자극, 또는 고통 3,4의 감각.

주변 후각 시스템은 복잡하고 비강 내에서 여러 해부학 적으로 분리 후각 감각 기관으로 구성되어 있습니다. 그 중에서도, 주요 후각 상피 세포 (MOE)는 설치류 5 비강 상피 세포의 약 45~52%을하게하고 후방 지역에 위치한 가장 큰 것입니다. anteroventral 지역에서 비중격의 각 측면을 따라 앉아 vomeronasal 기관 6로 알려진 관상 구조의 쌍입니다. Masera 7,8와 Gruneberg 신경절 9 중격 기관으로 알려진 후각 감각 뉴런의 두 개의 추가 작은 그룹, 각각 복부 중격과 비강 등의 항목 영역을 함께 상주합니다. 이러한 주변 장기 독특한 형태의 기능, 세포 마커 발현 및 생리 기능과 신경 상피가 포함되어 있습니다. 이들은 냄새의 수천을 감지절묘한 감도 10-12를 가진 분자.

후각 감각 기관뿐만 아니라, 비강도 다른 감각 시스템을 전시하고 있습니다. 그것은 peptidergic 삼차 신경 섬유는 비강 상피 세포, 특히 호흡기 상피 세포 13,14에 존재하는 것으로 알려져있다. 이러한 섬유의 일부는 자극과 독성 화학 물질을 감지하고 기침과 4,15 재채기 등의 보호 반사를 개시 할 책임이 있습니다. 자극성 악취 쓴 화합물은 또한 그 중 대부분은 삼차 신경 섬유 16-19로 떨어짐을하는 고독한 chemosensory 세포 (SCC에)의 최근에 발견 된 인구 감지 할 수 있습니다. 이 SCC에들은 또한 보호 기능에게 16-18를 제공 할 수 있다는 암시, 비강 및 vomeronasal 항목 덕트의 입구 영역에서 높은 밀도에 있습니다. 따라서, 비강 상피 기능, 형태 실질적으로 다를 수 있고, 세포 성분은에 따라해부학 적 위치.

심지어 하나의 전문 상피 세포 내에서 지역적 차이가 있습니다. 환경부는 하나의 예입니다. 복잡하고 구조 말려 MOE 줄 다양한 비갑개. 따라서 그 때문에, 다른 MOE 경험을 다른 공기 유량 영역, 그리고 다른 확산 및 공기 냄새 분자 (20)의 제거율. 또한, 그것은 특정 냄새 수용체를 표현하는 후각 감각 뉴런 (OSNs)은 환경부 21,22의 영역을 우회 네 가지 중 하나에있는 것으로 알려져있다. 이 위치의 차이에 미치는 영향에 악취에 OSN의 반응은 대부분 알려져 있지 않다. 또한, 일부 OSN 인구는 지역의 환경 설정을 나타냅니다. Guanylyl cyclase의-D (GC-D) 표현 OSNs는 ectoturbinates 23,24의 막 다른 골목 영역을 선호 존의 분포가있다. 더 최근에, 우리는 (TR 일시적인 수용체 잠재적 인 채널 M5를 표현 정식 OSNs의 모집단을 발견PM5)과는 우선적으로 측면과 복부 지역 25에 위치하고 있습니다. 이러한 결과는 환경부가 균일하지 않습니다 나타냅니다. 그러나 이러한 지역적 차이는 후각 코딩에 어떻게 영향을 미치는지 이해되지 않습니다. 철저한 생리 환경부의 조사와 코는 현재의 방법을 사용하여 보존 해부학 적 조직 손상 비강 상피 세포를 얻기의 어려움에 의해 제한되어 있기 때문에이 부분에 있습니다.

비강 상피는 주로 비강, 상악, 라틴, 광대뼈, 그리고 사골 뼈를 포함하여 두개골의 앞쪽 뼈에 의해 둘러싸여 있습니다. 성인 마우스 및 기타 설치류 모델에서,이 뼈는 특히 밀접한 관련이 비강 조직, 섬세한 비갑개를 손상없이 제거하기 어렵고 어렵다. 종종, 화학 기반의 탈회는 면역, 형태, 및 현장 하이브리드 화 연구에서 비강 조직의 cryosectioning 수 있도록 뼈를 부드럽게하는 데 사용되지만, depen딩은 동물의 연령, 탈회 과정은 하룻밤 7 일에게 24,26-28을 지속 할 수있다. 그것은 조직이 정착 보존 할 필요하기 때문에이 치료는 제한됩니다. 또한, 화학 탈회는 가혹한 일부 민감한 항체 29,30의 immunolabeling의 영향을 미칠 수 있습니다. 생리 학적 연구에, 살아있는 조직이 필요하며, 따라서이 실험은 종종 고립 OSNs 또는 그 두개골 뼈 얇고 17,31,32 부드러운 신생아에서 얻은 MOE 조각에 실시하고 있습니다. 생리 학적 연구는 또한 분할 머리 25,33,34에게로 전체 마운트 준비를 활용할 수 있지만, 코의 내측 표면에 일반적으로 다른 영역에 생리 녹음을 제한, 쉽게 액세스 할 수 있습니다.

여기, 우리는 보존 원래의 해부학 적 조직 형태로 그대로 비강 조직을 준비하는 효과적인, 수동 발골 방법을 설명합니다. 우리는 순차적으로 전방의 주요 뼈를 제거마우스가 아주 오래된 않는 얇은 비갑개의 뼈는 그대로 유지하고 cryosectioning 동안 거의 그대로 비강 상피 세포를 노출 해부 현미경 두개골이 필요합니다. 우리는 또한 이렇게 주변과 중앙 두 회로의 동시 검사를 촉진, 비강 조직과 후각 전구 사이의 연결뿐만 아니라, 뇌의 나머지 부분을 유지하기 위해 방법을 확장합니다. 우리의 방법은 파라 포름 알데히드 고정뿐만 아니라, 신선한, 살아있는 비강 조직을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 호흡, 후각, 그리고 비강 손상 및 질병, 형태 면역 및 생리 학적 연구를 촉진 할 것으로 예상된다.

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Protocol

1. 마우스 코 준비

우리는이 연구에서 성인 C57BL / 6 배경 마우스를 사용했습니다. 모든 동물 관리 및 사용 절차는 메릴랜드 대학 볼티모어 카운티의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인됩니다.

1.1 paraformaldahyde 고정 생쥐 코를 취득

그림 1
그림 1. 마우스 두개골의 뼈 A :. 두개골의 등쪽보기 B :. 제거 하악과 두개골의 복부 볼 수 있습니다. 두개골은 40 일 오래된 마우스에서 준비되었다. 각각의 뼈가 더 나은 시각화를 위해 착색하는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

  1. 일에 따라 각각의 생쥐를 해결하기 위해 transcardially 붓는다린, 외.의 E 프로토콜 (2008) 16. 간단히 마우스는 3 % 파라 포름 알데히드가 포함 된 고정액 버퍼 인산 뒤에 0.1M 인산 버퍼 (PB, 30 ~ 50 ML)로 transcardially 관류 tribromoethanol (Avertin의 250 ㎍ / g 체중)와 깊이 마취 19 mM의 L-라이신 염산염, 0.23 % 나트륨 M-과 요오드 (약 35-50 ML). 하나는 동물의 재관류 35 조브 문서의 단계를 수행 할 수 있습니다.
  2. 하악을 잘라 (또는 아래턱)과 머리에 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다.
  3. 신체의 나머지 부분에서 전체 헤드를 분리합니다.
  4. 미각을 제거합니다. 또한, 청소 통계 1A와 1B에 표시된 시료를 얻기 위해 두개골의 표면에 남아있는 결합 조직과 근육을 제거합니다.
  5. 해부 현미경, 뇌와 후각 전구를 덮고있는 두개골 뼈를 제거합니다. 여분의 조직과 뼈를 잘라. 아니TE는 뇌와 코가 연결되어있는 확장 된 조직 준비를 위해, 단지 두개골의 뼈가 제거됩니다. 면역 실험을 위해, 조직은 1.5 시간 동안 후 고정 야간 25 % 자당과 (PBS) 식염수 버퍼 0.1M 인산 옮겨졌다. 비강 조직은 버퍼 자당 용액에 몇 번을 찍기로 해부를 통해 가습 보관해야합니다.

1.2 갓 안락사 쥐의 코를 취득

  1. 개인 마우스는 깨끗한 케이지로 옮겨와 최종 흡입 후 자궁 전위 5 분으로 이어졌습니다 CO 2 가스에 노출되었다. 코 조직에 혈액을 줄이기 위해, 가슴을 열고 혈액을 배출 할 수 있도록 마음을 잘라 가위를 사용합니다.
  2. 25 % 자당을 가진 후 고정 및 cryoprotection 제외하고, 1.1.5 단계 1.1.2를 반복합니다. 시편은 가습 보관하고 Tyrode의 염분 함유 (mm 단위)로 유지해야한다 : 140 나CL, 5 KCl을, 1 MgCl 2, 1 염화칼슘 10 나의 피루 베이트 10 D-글루코오스, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-에탄 산 버퍼 (HEPES, pH를 7.4로 조정). 또는, 킴 와이프의 조각을 접어 해부하는 동안 시편 아래 Tyr​​ode의 솔루션과 장소를 흡수하고 때때로 세포와 조직의 생존을 유지하는 것이 가습 계속 Tyrode의 솔루션에 시험편을 찍어이나 조직에 어떤 해결책을 드롭 .

2. 앞니, 전방의 Vomer 및 상악골 뼈 제거

  1. 복부 관점에서 시작합니다. vomer 뼈를 찾아 뼈의 복부 대부분을 깰 이빨 rongeur이나 집게를 사용하여 길이를 따라 vomer 뼈를 휴식.
  2. 톱니 모양의 집게를 사용하여 부드럽게 vomeronasal 기관 (VNO)에서 떨어져 뼈 조각을 부지런히하여 vomer 뼈의 깨진 부분을 제거합니다. 참고, 이전 달보다 작거나 환경부에 관심이있는 경우에만 마우스를위한 두 인트PS는 생략 할 수 있습니다.
  3. 집게로 단단히 머리를 잡아. 앞니와 두 개의 앞니와 vomer 뼈 사이의 상악 전치부의 관절 부위 모두의 앞 부분을 깰 수있는 rongeur를 사용합니다.
  4. 최대 지느러미 광대뼈 판의 레벨로 광대뼈 아치 바로 전방 지역에서 오른쪽 상악의 복부 부분을 휴식.
  5. 등의 견해 코 뒤집어. 지느러미 광대뼈 플레이트의 오른쪽 상악 전방을 깰 rongeur를 사용합니다. 광대뼈 플레이트의 전체 오른쪽 상악골의 전방이 느슨합니다. 부드럽게 상악의 기초가 어떤 비강 조직을 분리하는 미세 집게를 사용하고 부드럽게 뼈 조각을 올립니다.
  6. 왼쪽 앞니와 왼쪽 상악 전치부를 풀고 코 뼈가 제거 된 후 그들을 제거하는 단계 2.4 및 2.5를 반복합니다.

3. 코 뼈와 지느러미 광대뼈 플레이트 제거

  1. 다시 톱니 모양의 집게 또는 rongeur를 사용하여코 뼈 바로 꼬리 정면 뼈의 나머지를 이동합니다. 뼈 조각을 제거한 후, 코 뼈의 꼬리 부분이 집게를 사용하여 파지 할 수 있습니다.
  2. 광대뼈 플레이트에 연결되어있는 광대뼈 아치의 앞쪽 부분을 깨고 rongeur를 사용합니다.
  3. 광대뼈 플레이트의 지느러미 끝의 측면 가장자리에 미세 집게를 타고 부드럽게 뼈를 뒤집어을 제거합니다. 뼈가 느슨한 경우, 제거를 풀어 부드럽게 클램프 rongeur를 사용합니다.
  4. 왼쪽 및 오른쪽 코 뼈 사이의 중간 봉합을 느슨하게 미세 집게 또는 면도날을 사용합니다.
  5. 오른쪽 코 뼈의 꼬리 끝을 그립하는 톱니 모양의 집게를 사용합니다. 부드럽게 조직을 기본 구분하기 위해 좌우로 뼈를 이동합니다. 그 옆에 뼈 측면 이동을위한 비강 뼈의 꼬리 세번째 따라 집게를 이동하는 데 유용합니다. 코 뼈가 분리로, 천천히 꼬리 끝에서 뼈를 들어 올립니다.
  6. T가그는 코 뼈를 약간 들어 올려 얇은 호흡기 상피 조직 늘어서 뼈의 측면 outcropping 표시를 나타 내기 위해 측면으로 뼈를 기울이십시오. 부드럽게 비골에서이 조직을 해제하는 미세 집게를 사용합니다. 코 뼈가 들어 계속합니다. 뼈가 완전히 하부 조직에서 분리 될 때, 주동이의 끝에서 코 뼈를 잘라 가위를 사용합니다.
  7. 왼쪽 코뼈를 제거하는 단계 3.1, 3.5 및 3.6를 반복합니다.
  8. 단계 코의 왼쪽 3.2 및 3.3를 반복합니다.

4. 옆 광대뼈 플레이트 제거

  1. 한 번에 광대뼈 플레이트 한쪽을 제거합니다. 어느 광대뼈 플레이트를 먼저 제거 할 수 있습니다.
  2. 복부 관점에서, 휴식 광대뼈 아치에 도달 할 때까지 광대뼈 아치 열등 상악을 깰.
  3. 등의 관점에서, 부드럽게 광대뼈 아치를 잡고 앞으로 측면 올립니다. 광대뼈 판은 여전히​​ 모든 조직에 연결되어있는 경우, 벌금을포셉 부드럽게 조직과 뼈 사이의 연결을 절단.
  4. 코의 반대편에있는 광대뼈 플레이트를 반복합니다.

5. 궤도 뼈 제거

  1. 복부 관점에서, 코의 어금니 사이 palantine 뼈를 휴식.
  2. 코의 양쪽에 3 대구치와 상악을 깰 rongeur를 사용합니다.
  3. 코의 양쪽 비갑개에 복부와 뒤쪽 뼈의 나머지 두꺼운 휴식 및 제거합니다.

6. 사골 뼈 제거

  1. 비갑개에 꼬리 튀어 나온 사골 뼈의 일부를 휴식. 이 비갑개를 덮고있는 사골 뼈의 얇은 조각을 제거 할 때 비갑개 조직의 손실을 방지 할 필요가있다.
  2. 코의 오른쪽 측면, 사골 뼈의 앞쪽 가장자리에 미세 집게를 놓고 조심스럽게 제거합니다. 뼈의 일부가 남아있는 경우, 모든 때까지이 절차를 반복비갑개를 덮고있는 얇은 뼈가 제거되었습니다. 비갑개 뼈 준비의 대부분 제거 할 필요가 없습니다. 세 생쥐에서 소공 질의 접시 취성됩니다. 비강 조직의 cryosectioning이 필요한 경우, 뼈에 의한 손상을 줄이기 위해 미세 집게로 접시의 작은 조각을 제거합니다.
  3. 코의 왼쪽 측면 단계 6.2) 반복합니다.
  4. 이전의 단면에 남아있는 뼈 조각을 제거합니다. 주 : 동물에서 더 중격 뼈의 살, posterodorsal 지역보다 다소 두껍고 단단하다. 하나는 미세 집게를 사용하여이 부분을 제거 할 수 있습니다. 심장의 뼈와 안감 상피 조직의 지느러미 부분을 분리하는 뼈의 양쪽에 집게의 끝 부분을 삽입합니다. 뼈를 잡고 시험편을 잡아 포셉 한 쌍을 사용합니다. 심장의 아래 연골 부분에서 위쪽 뼈 부분을 깨고 조심스럽게 제거 포셉의 다른 쌍을 사용합니다.

  1. 흡인기 진공 펌프를 설정합니다.
  2. 임베딩 형에 코를 놓습니다. 10월 미디어 잠수함 코.
  3. 코 조직 내에 갇혀있는 공기 방울을 제거하기 위해 진공을 사용합니다. 이 프로세스는 5 분 소요됩니다.
  4. 기포를 제거한 후, 원하는 방향으로 조직을 설정합니다.
  5. OCT를하고 드라이 아이스를 사용하여 금형 조직을 고정합니다. 내장 조직은 다음 즉시 cryosectioned 또는 -80 ° C 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다.

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Representative Results

이 방법을 사용하여, 우리는 신뢰성 거의 그대로 비강 조직을 얻을 수 있습니다. 그림 2A는 파라 포름 알데히드 고정 머리에서 성인 코 시편의 이미지를 보여줍니다. 이 시편에서, 환경부, 중격 기관, Gruneberg 신경절 및 VNO 등 네 가지 하위 후각 감각 기관은 그대로입니다. 또한, 호흡 상피와 같은 땀샘과 혈관 등의 피하 조직은 보존됩니다. 우리는 성공적으로 우리가 형태, 분포, 신경 신경 분포, 다양한 특수 감각 세포 집단 16,17,36-38의 세포 마커 발현을 조사하는 연구의 숫자에이 방법을 사용했습니다.

그림 2B 함께 뇌, 후각 전구 및 코 표본을 보여줍니다. 이 확장 준비는 주변과 중앙 후각 시스템 사이의 신경 연결이 필요 연구에 특히 유용합니다. 우리는 두개골 뼈 스와을 제거하여이 시편 준비전에 얼굴 뼈의 제거에 머리를 rrounding. 우리의 확장 방법은 연구자가 하나의 준비에 주변과 중앙 모두 후각 시스템에서 실험을 수행 할 수 있습니다.

그림 2에서와 같이 비강 조직은 전체 마운트 관찰뿐만 아니라, 조직 절편의 준비에 사용할 수 있습니다. 그림 3A는 환경부와 호흡 영역 모두를 통해 수평 단면 컷을 보여줍니다. 그림 3B는 중간을 잘라 코로나 섹션을 보여줍니다 환경부의. 우리는 다른 해부학 적 위치에서 상피 점막 구조의 다양한 유형의 더 나은 전망을위한 중립 빨간색 부분을 염색. 이러한 결과는 우리의 기술은 정상 및 병적 상태에서 코 형태 및 기능 변화의 포괄적 인 비교 연구를 활성화도 섬세한 MOE 비갑개의 구조와 코의 해부학 적 조직을 유지하는 보여줍니다.

그림 2
그림 2. 절연 코와 뇌 조직 A :.. 우리 발골 방법을 사용하여 해부 그대로 코 조직의 등쪽보기 B :. 그대로 중앙과 말초 후각 시스템 사이의 신경 연결과 코와 뇌의 등쪽보기 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 비강 조직의 섹션 A :.. 후각 및 호흡기 상피뿐만 아니라 다른 비강 구조를 보여주는 수평 섹션 B : 비갑개 O를 통해 코로나 섹션F 코의 후방에있는 MOE. 두 절은 중립 레드 14 μm의 두께 및 스테인드했다 MOE :. 주요 후각 상피 RE :.. 호흡기 상피 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

여기에, 우리는 아래 조직을 살려주는 동안 순차적으로 주변의 뼈를 제거하여 마우스 코에서 그대로 후각 및 호흡기 조직을 분리하기위한 단계별 절차를 보여 주었다. 우리는 조심 뼈 제거가 전체에서도 가장 민감한 조직을 보존 할 수 있다는 것을 보여. 우리는 또한 우리가 신경 연결을 유지하기 위해 함께 뇌와 코 조직을 모두 분리하는이 기술의 가능성 개조에 대한 통찰력을 공유 할 수 있습니다. 이 새로운 방법은 현장 하이브리드 화에 면역, RNA에서 추가 처리 및 생리 학적 실험 한 시편 전체 후각 및 호흡기 조직을 분리하는 방법을 제공합니다.

뼈 제거의 장점

우리의 방법 전에 decalcifying 에이전트는 일반적으로 조직 절편과 면역을위한 뼈를 부드럽게하는 데 사용되었습니다. 그러나 석회는 뼈의 크기와 동물의 나이에 따라시간 또는 며칠 29,30에 대한 뼈 decalcifiers의 조직 배양을 요구하는 긴 과정이 될 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 에이전트는 변경하거나 29,30을 immunolabeling의 방해 할 수 조직에 영향을 미칠 수 있습니다 산을 포함합니다. 이를 방지하기 위해 일부 연구자들은 뼈 24,26-28에서 칼슘 이온을 격리 할하려면 솔루션 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 사용합니다. 탈회이 방법은 또한 일을 필요로한다. 여기에 표시된 절개는 약 20 ~ 30 분에서 수행 할 수 있으며, 조직의 염색성을 변경할 수있는 화학 솔루션의 응용 프로그램을 필요로하지 않습니다.

우리의 방법은 생리 레코딩을위한 살아있는 조직을 얻기위한 이점을 제공 갓 해부 코에서 그대로 비강 조직을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 코, 조각은 일반적으로 칼슘에 사용되는 + 후각 상피 31,32에서 OSNs 및 지원 세포의 이미지. 이 조각해야경화 조직을 둘러싸고있는 뼈 전에 신생아 생쥐에서 준비합니다. 후각 상피 세포는 출생 후 발달과 성숙을 계속하고 있기 때문에, 신생아 표본은 성인과 동일하지 않습니다. 우리의 방법을 사용하여, 연구진은 신생아 나이보다 오래된 마우스에서 그대로 후각 조직을 얻을 수 있습니다. 이것은 특히 나이에 따라 변화 연구에 중요한 이점을 제공합니다.

수정 및 문제 해결

우리는 주변의 뼈를 제거하는 하나의 효과적인 순서를 보였다. 그러나, 그대로 비강 조직을 얻기 위해 뼈를 제거 다른 시퀀스가​​ 있으며, 단계 절차에 의해 단계는 연구원 및 가장 관심있는 조직의 개별 요구 사항에 따라 변경 될 수 있습니다. vomeronasal 기관이 필요한 경우 제거하는 동안 원하는 장소에 조직을 유지하기 위해 파악하기 위해 더 많은 골 덮인 부분이 있기 때문에 예를 들어, vomer 뼈는 초기 프로 시저에서 제거해야합니다. ADAP로딸랑 딸랑 각 응용 프로그램의 절차, 그 조직은 추가 처리를 위해 그대로 유지 가능성이 더 높습니다. 코 뼈는 아래의 조직이 뼈에 달라 붙고 뼈가 멀리 해제 될 때 자주 눈물 때문에 제거하기 어려운 경향이있다. 비디오와 같이 코 뼈를 흔드는뿐만 아니라, 작은 포셉 부드럽게 코 뼈 및 제거하는 동안 뼈 조직을 아래로 이동하고 멀리하는 데 도움이되는 기본 조직 사이에 삽입 할 수 있습니다.

절개는 약간 생쥐의 나이에 따라 다릅니다. 젊은 생쥐에서 뼈 나이가 생쥐의 뼈가 더 취성 강하게 일부 지역 주변의 뼈에 융합하면서 부드러운 경향이 있습니다. 부드러운 뼈 분리하고 열심히 뼈보다 작은 조각으로 제거하는 것이 더 쉽습니다. 이 차이는 쉽게 분리하고 깨끗한 제거에 도움 뼈 사이의 연결에 점수 나 부스러기에 집게를 사용하여 극복 할 수 있습니다. 오래된 동물, posterodorsal 다시심장의 기온이 다소 두껍고 어렵고, cryosectioning하기 전에 제거해야합니다. 절차 6.4에 설명 된대로 심장의 뼈 부분을 제거 할 수 있습니다. 나이가 어린 쥐의 해부의 작은 차이가 있지만, 나이는 제한 요인이되지 않습니다. 우리의 연구에서, 우리는 성공적으로 십사일에서 두 살까지 쥐에서 그대로 비강 조직을 준비했습니다.

신선한 조직이 연약하고 더 조심 조작을 필요로하지만 고정액 고정 코와 신선한 코에 사용 해부 단계 사이에는 큰 차이가 없습니다. 모두 준비에서 해부하는 동안 조직 가습을 유지하는 것이 중요합니다. 주기적으로 그것의 V을 유지하기 위해 공급 조직이 가습 및 영양소 유지되므로 중요합니다 Tyrode의 솔루션의 조직을 찍기 또는 해부하는 동안 조직에 솔루션을 떨어지는 그러나, 버퍼 식염수에 신선한 조직의 절개를 수행 할 필요가 없습니다iability.

여기에 제시된 절차는 더 이상 하나의 시편 (그림 2B)의 뇌와 코를 모두 그대로 유지 뼈 제거를 포함하도록 수정 될 수 있습니다. 이 수정은 소공 질의 플레이트를 통해 해당 패스 뇌와 코 사이의 신경 연결을 여분. 더 많은 기술과 시간을 혼자 코보다이 해부가 필요합니다. 그러나 주변에서 뇌에 연결을 유지하는 것은이 방법의보다 다양한 응용 프로그램을 할 수 있습니다.

제한

우리는 현장 하이브리드 화 분석에서 면역 라벨 및 mRNA를 포함하여 연구의 숫자에 대한 비강 조직을 준비하기 위해이 방법을 사용했으며, 성공적으로 신호 전달 경로, 다양한 세포 인구의 스테인드 세포 마커 많은 단백질을 표시했으며, 형태 학적 특징과 세포의 분포를 조사 비강 16,17,36-39를 통해. 우리는 특급하지 않았다cryosectioning 및 immunolabeling의의의 erience 제한합니다. 하나의 표본에 연결된 뇌와 비강 조직을 유지 확장 준비의 cryosectioning이 필요한 연구를 위해, 우리는 나이가 생쥐에서 취성 소공 질의 플레이트 단면 동안 조직 손상을 만들 수 있기 때문에 4개월 미만의 쥐를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 전기 생리학 녹음위한 새로운 조직을 위해, 비갑개 사이의 중간 조직은 전체 마운트 준비에 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 이산 지역 조직 또는 분할의 작은 조각의 제거는 문제를 극복 할 수 있습니다. 기존의 전기 olfactogram는 엔도 비갑개 25,33,34의 내측 표면에서 수행되기 때문에, 우리의 조직 준비는 거의 조작으로 다른 지역에서 녹음을 허용 할 수 있습니다.

면역 이상 신청

절차의 대부분의 응용 프로그램 기술을 익힌 사람들을 위해 존재한다. 가능한 입학 원서이온은 다른 방법을 사용하여 그대로 원래의 해부학 적 구성에서 얻기 어려운되었습니다, 후각 및 호흡기 조직에 존의 연구를 포함한다. 또한 응용 프로그램은 전체, 신선한 조직에 동시 다중 녹음을 허용하여 전기 생리학을 위해 존재한다. 기존 기술을 사용하여 수행하기 어려운 된 이러한 응용 프로그램 중 일부는 우리의 발골 방법에 의해 가능하게된다. 또한,이 프로토콜은 또한 중요한 비교를 위해 다양한 지역에서 일관된 시료 채취를 요구 생화학 게놈 및 프로테옴 연구에 적용 할 수 있습니다.

요약하면, 우리는 신속하고 안정적​​으로 주변의 뼈를 제거하여 마우스 코 후각 및 호흡기 조직에 액세스 할 수있는 절차를 개발했습니다. 이 방법은 석회 같은 일반적으로 사용되는 기술에 비해 상당한 장점이 있습니다. 또한, 우리의 방법은 화학 처리가 필요하지 않으므로 조직을 immunohistochemist에있는 사용을 위해 제한되지 않습니다스피 실험뿐만 아니라, 현장 하이브리드 화 및 생리 학적 연구에 적용 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 추가 처리를 위해 마우스 코를 준비하는 더 빠르고 직접적인 방법입니다. 우리는 우리의 방법은 비강 지역에서 후각과 호흡 연구를 촉진 할 것으로 예상된다.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

이 작품은 Weihong 린에 연구 보조금 (NIH / NIDCD 009269, 012831 및 ARRA 관리 보충 NIH 보조금)에 의해 지원되었다. 우리는 특히 찍고 및 처리에있는 그의 기술 지원 UMBC에서 씨 팀 포드 감사합니다. 우리는 또한 찍고 자신의 장비 지원을 올림푸스 미국 주식 박사 다프네 베르크, UMBC에서 양 Chere 페티 니콜라스 McCollum에 감사하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width World Precision Instruments (WPI) 501333
Fine forceps, Dumont 3 WPI 503235
Fine forceps, Dumont 55 WPI 14099
Fine forceps, Dumont AA Fine Science Tools (FST) 11210-20
Specimen forceps, Serrated VWR 82027-440
Operating scissors WPI 501753
Iris scissors, Straight Miltex V95-304
Dissection microscope Olympus SZ40
Name Company Catalog Number Comments
Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound Sakura Finetek 4583
Plastic embedding mold VWR 15160-215
Aspirator vacuum pump Fisher Scientific 09-960-2
Name Company Catalog Number Comments
Section staining
Neutral red ACROS Organic CAS 553-24-2 Nuclei staining

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References

  1. Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
  2. Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
  3. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  4. Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. 2nd, Wiley-Liss. (2000).
  5. Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
  6. Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
  7. Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
  8. Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
  9. Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
  10. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
  11. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
  12. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
  13. Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
  14. Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
  15. Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
  16. Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
  17. Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
  18. Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
  19. Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
  20. Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
  21. Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
  22. Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
  23. Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
  24. Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
  25. Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
  26. Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
  27. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
  28. Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
  29. Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
  30. Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
  31. Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
  32. Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
  33. Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
  34. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
  35. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  36. Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
  37. Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
  38. Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
  39. Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).

Comments

1 Comment

  1. dear David dunston,
    I would appreciate to be able to visualize your dissection method.Thanking you by advance, best regards, Patricia Duchamp-Viret

    Reply
    Posted by: Patricia D.
    February 4, 2014 - 5:31 AM

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