संरक्षित संरचनात्मक संगठन के साथ बरकरार माउस नाक ऊतक तैयार करने के लिए एक प्रभावी मैनुअल Deboning विधि

1Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
* These authors contributed equally
Published 8/10/2013
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Biology

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Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization. J. Vis. Exp. (78), e50538, doi:10.3791/50538 (2013).

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Abstract

स्तनधारी नाक जटिल आंतरिक संरचना के साथ एक बहुआयामी अंग है. नाक गुहा इस तरह के संरचनात्मक स्थानों, आकारिकी, और कार्यों में स्पष्ट रूप से अलग है, जो घ्राण श्वसन, और स्क्वैमस epithelia के रूप में विभिन्न epithelia के साथ तैयार है. वयस्क चूहों में, नाक विशेष रूप से आंतरिक संरचना, मुख्य घ्राण उपकला (मो) के रूप में पीछे ऐसे में उन लोगों के लिए प्रयोगात्मक उपयोग को सीमित करने, विभिन्न खोपड़ी हड्डियों के साथ कवर किया जाता है. यहाँ हम संरक्षित संरचनात्मक संगठन के साथ लगभग पूरे बरकरार है और नाक के ऊतकों को प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी विधि का वर्णन है. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करना, हम क्रमिक रूप से नाक के आसपास के ऊतक खोपड़ी हड्डियों को हटा दें. यह प्रक्रिया दोनों paraformaldehyde के निर्धारित और हौसले से विच्छेदित, चमड़ी माउस सिर पर प्रदर्शन किया जा सकता है. पूरे deboning प्रक्रिया पारंपरिक रसायन आधारित डे के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक समय की तुलना में काफी कम है जिसके बारे में 20-30 मिनट लगते हैं,कड़ा हो जाना. इसके अलावा, हम नाक ऊतक तैयारी से बरकरार पतली क्षैतिज या राज्याभिषेक या बाण के समान वर्गों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है जो turbinates, के बीच फंस हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक आसान तरीका मौजूद है. हमारे विधि का उपयोग कर तैयार नाक ऊतक विशेष रूप से क्षेत्र विशेष परीक्षा और तुलना रुचि के हैं, जहां पढ़ाई में, पूरे माउंट पूरे epithelia की प्रेक्षण, साथ रूपात्मक, immunocytochemical, शाही सेना के रूप में स्वस्थानी संकरण में, और शारीरिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

स्तनधारी नाक गुहा के ऊतकों और विशिष्ट कार्यों की सेवा है कि अंगों के विभिन्न प्रकार के होते हैं. नाक गुहा फेफड़ों में और से बाहर हवाई यात्रा की अनुमति देता है, जो ऊपरी श्वास नलिका, के प्रवेश के हिस्से का निर्माण करता है. साँस हवा के रूप में यह अच्छी तरह से सफाई या परेशान और विषाक्त पदार्थों और संक्रामक सूक्ष्मजीवों 2 दूर करने के लिए छानने के रूप में तापमान और नमी कंडीशनिंग 1 से होकर गुजरती है, जहां नाक गुहा से होकर गुजरता है. दोनों उपचार नाक epithelia और ग्रंथियों और जहाजों सहित subepithelial ऊतकों, द्वारा किया जाता है और निचले वायुमार्ग और फेफड़ों की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं. श्वसन और उपकला रक्षा में अपनी भूमिका के अलावा, नाक ऊतक भी गुजर हवा में रासायनिक पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने के जो घ्राण और त्रिपृष्ठी प्रणाली, के परिधीय संवेदी apparatuses शामिल हैं. सक्रिय है जो सिस्टम पर निर्भर करता है, नाक में रसायनों का संवेदी पता लगाने या तो बटोर सकते हैंगंध, जलन, या दर्द 3,4 की भावना.

परिधीय घ्राण प्रणाली जटिल और नाक गुहा के भीतर कई संरचनात्मक रूप से अलग घ्राण संवेदी अंगों से बना है. उनमें से, मुख्य घ्राण उपकला (मो) कृन्तकों 5 में नाक epithelia की लगभग 45-52% बनाता है और पीछे क्षेत्र में स्थित है, जो सबसे बड़ा है. Anteroventral क्षेत्र में, नाक पट के प्रत्येक पक्ष के साथ बैठते हैं जो vomeronasal अंग 6, के रूप में जाना ट्यूबलर संरचना की एक जोड़ी है. Masera 7,8 और Gruneberg नाड़ीग्रन्थि 9 की सेप्टल अंग के रूप में जाना घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की दो अतिरिक्त छोटे समूहों, क्रमशः, उदर पट और नाक गुहा के पृष्ठीय प्रविष्टि क्षेत्र के साथ रहते हैं. ये परिधीय अंगों विशिष्ट आकारिकी में सुविधाओं, सेल मार्कर अभिव्यक्ति, और शारीरिक समारोह के साथ न्यूरो epithelia होते हैं. साथ में वे गंध के हजारों का पता लगाउत्तम संवेदनशीलता 10-12 के साथ अणुओं.

घ्राण संवेदी अंगों के अलावा, नाक गुहा भी अन्य संवेदी प्रणाली मकान. यह पेप्टिडर्जिक trigeminal तंत्रिका तंतुओं नाक उपकला, विशेष रूप से श्वसन उपकला 13,14 में मौजूद हैं जाना जाता है. इन तंतुओं से कुछ परेशान और जहरीले रसायनों का पता लगाने और इस तरह खांसने और 4,15 छींकने के रूप में सुरक्षात्मक सजगता की शुरुआत करने के लिए जिम्मेदार हैं. चिड़चिड़ी सुगंधित और कड़वा यौगिकों भी, जिनमें से कई trigeminal तंत्रिका तंतुओं 16-19 द्वारा innervated हैं एकान्त chemosensory कोशिकाओं (SCCs), के एक हाल ही में खोज की आबादी से पता लगाया जा सकता है. ये SCCs वे भी एक सुरक्षात्मक कार्य 16-18 सेवा कर सकता है कि इशारा है, नाक गुहा और vomeronasal प्रविष्टि नलिकाओं की प्रविष्टि क्षेत्र में उच्च घनत्व में स्थित हैं. इस प्रकार, नाक epithelia समारोह, आकारिकी में काफी अलग कर सकते हैं, और सेल रचना अपने पर निर्भर करता हैसंरचनात्मक स्थानों.

यहां तक ​​कि एक भी और विशेष उपकला भीतर, क्षेत्रीय मतभेद हैं. मो ऐसा ही एक उदाहरण है. जटिल और संरचनाओं कर्ल करवाने रहे हैं जो मो लाइनों विभिन्न turbinates,. इस प्रकार उनकी वजह से, अलग मो अनुभव अलग वायु प्रवाह की दर के क्षेत्रों, और, विभिन्न प्रसार और हवाई गंध अणुओं 20 की निकासी दरों. इसके अलावा, यह एक दिया गंध रिसेप्टर व्यक्त घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स (OSNs) मो 21,22 के क्षेत्रों circumvented चार में से एक में स्थित हैं कि जाना जाता है. इस स्थान अंतर को कैसे प्रभावित करता odorants के लिए एक OSN की प्रतिक्रिया काफी हद तक ज्ञात नहीं है. इसके अलावा, कुछ OSN आबादी क्षेत्रीय वरीयता दिखा रहे हैं. Guanylyl साइक्लेस डी (जीसी डी) व्यक्त OSNs ectoturbinates 23,24 की संस्कृति-de-थैली क्षेत्रों पक्ष जोनल वितरण किया है. हाल ही में, हम (टीआर क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल M5 व्यक्त किया कि विहित OSNs के एक subpopulation पायाpM5) और रियायत के पार्श्व और उदर क्षेत्रों के 25 में स्थित है. ये परिणाम है कि मो वर्दी नहीं है का संकेत मिलता है. हालांकि, इन क्षेत्रीय मतभेद घ्राण कोडिंग कैसे प्रभावित नहीं समझा गया है. संपूर्ण शारीरिक मो की जांच और नाक मौजूदा तरीकों का उपयोग कर संरक्षित संरचनात्मक संगठन के साथ बरकरार नाक epithelia प्राप्त करने की कठिनाई के द्वारा ही सीमित कर दिया गया है क्योंकि इस हिस्से में है.

नाक epithelia मुख्य रूप से नाक, जबडा, तालु, गाल की हड्डी, और सलाखें हड्डियों सहित खोपड़ी की पूर्वकाल हड्डियों, से घिरे हैं. वयस्क चूहों और अन्य कृंतक मॉडल में, इन हड्डियों को विशेष रूप से बारीकी से जुड़े नाक ऊतक, नाजुक turbinates को नुकसान पहुँचाए बिना दूर करने के लिए कठिन और मुश्किल है. अक्सर, रासायनिक आधारित विकैल्सीकरण immunohistochemical, रूपात्मक, और सीटू संकरण अध्ययन में नाक के ऊतकों के cryosectioning अनुमति देने के लिए हड्डियों को नरम करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन, निर्भरताडिंग जानवर की उम्र पर, विकैल्सीकरण प्रक्रिया रातोंरात अप करने के लिए 7 दिनों 24,26-28 पिछले कर सकते हैं. यह ऊतक लगानेवाला से संरक्षित किया जा आवश्यकता है क्योंकि यह इलाज भी सीमित है. इसके अतिरिक्त, रासायनिक विकैल्सीकरण कठोर हो सकता है और कुछ संवेदनशील एंटीबॉडी 29,30 के immunolabeling प्रभावित कर सकते हैं. शारीरिक अध्ययन के लिए, जीवित ऊतक की आवश्यकता है, और इस प्रकार, इन प्रयोगों अक्सर अलग OSNs या जिसका खोपड़ी हड्डियों पतली और 17,31,32 नरम हैं नवजात शिशुओं से प्राप्त मो स्लाइस पर आयोजित की जाती हैं. शारीरिक पढ़ाई भी बंटवारे सिर 25,33,34 द्वारा पूरे माउंट तैयारी का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन नाक की औसत दर्जे का सतह आमतौर पर केवल अन्य क्षेत्रों पर शारीरिक रिकॉर्डिंग सीमित है, आसानी से सुलभ है.

यहाँ, हम संरक्षित मूल संरचनात्मक संगठन और आकारिकी साथ बरकरार नाक के ऊतकों को तैयार करने के लिए एक प्रभावी, मैनुअल deboning विधि का वर्णन है. हम क्रमिक रूप से पूर्वकाल के प्रमुख हड्डियों को दूरचूहों बहुत पुराने हैं, जब तक कि पतली turbinate हड्डियों को बरकरार रखे हुए है और cryosectioning जबकि एक लगभग पूरी तरह से बरकरार नाक उपकला का पर्दाफाश करने के लिए एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे खोपड़ी की जरूरत है. हम भी इस प्रकार परिधीय और केंद्रीय दोनों सर्किट के एक साथ परीक्षा की सुविधा है, नाक के ऊतकों और घ्राण बल्ब के बीच संबंध है, साथ ही मस्तिष्क के बाकी संरक्षित करने के लिए विधि का विस्तार. हमारे विधि paraformaldehyde तय है, साथ ही नए सिरे से, जीना नाक ऊतक तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, हमारे विधि श्वसन, गंध, और नाक की क्षति और बीमारी की, रूपात्मक immunohistochemical और मनोवैज्ञानिक अध्ययन की सुविधा होने की उम्मीद है.

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Protocol

1. माउस नाक तैयारी

हम इस अध्ययन में वयस्क C57BL 6 / पृष्ठभूमि चूहों का इस्तेमाल किया. सभी जानवरों की देखभाल और प्रक्रियाओं मैरीलैंड विश्वविद्यालय, बाल्टीमोर काउंटी पशु की देखभाल और उपयोग समितियों (IACUC) द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं.

1.1 paraformaldahyde तय चूहों से नाक हासिल

चित्रा 1
चित्रा 1. एक माउस खोपड़ी की हड्डी एक:. खोपड़ी के पृष्ठीय दृश्य बी:. हटा जबड़ा साथ खोपड़ी का वेंट्रल दृश्य. खोपड़ी एक 40 दिन पुरानी माउस से तैयार किया गया था. व्यक्तिगत हड्डियों बेहतर दृश्य के लिए रंग होते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

  1. वें का पालन व्यक्तिगत चूहों को ठीक करने transcardially छिड़कनालिन, एट अल. की ई प्रोटोकॉल, (2008) 16. संक्षेप में, चूहों, 3% paraformaldehyde युक्त लगानेवाला बफर एक फॉस्फेट द्वारा पीछा 0.1M फॉस्फेट बफर (पंजाब, 30-50 मिलीग्राम), साथ transcardially perfused tribromoethanol (Avertin 250 माइक्रोग्राम / छ शरीर के वजन), के साथ गहरा anesthetized थे 19 मिमी एल लाइसिन monohydrochloride, और 0.23% सोडियम मीटर periodate (लगभग 35-50 मिलीलीटर). एक भी पशु छिड़काव 35 के लिए जौव लेख में चरणों का पालन कर सकते हैं.
  2. जबड़ा काट (या निचले जबड़े) और सिर पर त्वचा को हटाने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें.
  3. शरीर के बाकी हिस्सों से पूरे सिर अलग करें.
  4. तालू निकालें. इसके अलावा, साफ और आंकड़े 1 ए और 1 बी में दिखाया नमूना प्राप्त करने के लिए खोपड़ी की सतह पर शेष संयोजी ऊतक और मांसपेशियों को हटा दें.
  5. एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, मस्तिष्क और घ्राण बल्ब को कवर खोपड़ी की हड्डी हटा दें. अतिरिक्त ऊतक और हड्डियों बंद ट्रिम. नहींते, मस्तिष्क और नाक जुड़े रहने में जो विस्तारित ऊतक तैयार करने के लिए, केवल खोपड़ी हड्डियों को हटा रहे हैं. Immunohistochemical प्रयोगों के लिए, ऊतक 1.5 घंटे के बाद तय की और रात में 25% sucrose के साथ खारा (पीबीएस) buffered 0.1M फॉस्फेट के लिए स्थानांतरित किया गया था. नाक ऊतक बफर sucrose के समाधान में कई बार यह सूई से विच्छेदन के दौरान humidified रखा जाना चाहिए.

1.2 हौसले euthanized चूहों से नाक हासिल

  1. व्यक्तिगत चूहों एक साफ पिंजरे को हस्तांतरित और अंतिम सांस के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था 5 मिनट के द्वारा पीछा किया गया था, जो सीओ 2 गैस, के संपर्क में थे. नाक के ऊतकों में रक्त को कम करने के लिए, छाती को खोलने और रक्त पलायन करने की अनुमति देने के लिए दिल में कटौती के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें.
  2. 25% sucrose के साथ बाद के निर्धारण और cryoprotection छोड़कर, 1.1.5 के लिए कदम 1.1.2 दोहराएँ. नमूना humidified रखा और Tyrode के खारा युक्त (मिमी) के साथ बनाए रखा जाना चाहिए: 140 नासीएल, 5 KCl, 1 2 MgCl, 1 2 CaCl, 10 ना पाइरूवेट, 10 डी ग्लूकोज, और 10 एन 2 hydroxyethylpiperazine-n '-2-ethanesulfonic एसिड बफर (HEPES, 7.4 पीएच को समायोजित). वैकल्पिक रूप से, Kimwipes का एक टुकड़ा गुना विदारक जबकि नमूना नीचे Tyrode का समाधान, और जगह के साथ लेना और कभी कभी कोशिकाओं और ऊतकों की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए यह humidified रखने के लिए Tyrode के समाधान में नमूना डुबकी या ऊतक पर कुछ समाधान ड्रॉप .

2. छेनी, पूर्वकाल VOMER और जबडा अस्थि निकालना

  1. एक उदर दृष्टिकोण से शुरू करो. VOMER हड्डी जानें और हड्डी के उदर अधिकांश भाग को तोड़ने के दांत के साथ एक rongeur या संदंश का उपयोग इसकी लंबाई के साथ VOMER हड्डी तोड़.
  2. दाँतेदार संदंश का प्रयोग, धीरे vomeronasal अंग (VNO) से दूर हड्डी के टुकड़े चलाने से VOMER हड्डी का टूटा क्षेत्रों हटा दें. नोट, पुराने एक महीने से भी कम, या मो में दिलचस्पी केवल अगर चूहों के लिए इन दो काएंपुनश्च छोड़ी जा सकती हैं.
  3. संदंश के साथ मजबूती से सिर पकड़ो. कृन्तक और दो कृन्तक और VOMER हड्डी के बीच पूर्वकाल उत्तरहनु की jointed क्षेत्र दोनों के सामने के भाग को तोड़ने के लिए rongeur का प्रयोग करें.
  4. ऊपर पृष्ठीय गाल की हड्डी का प्लेट के स्तर तक गण्डचाप के लिए सिर्फ पूर्वकाल क्षेत्र में सही जबडा के उदर भाग को तोड़.
  5. एक पृष्ठीय दृष्टिकोण के लिए नाक पर पलटें. पृष्ठीय गाल की हड्डी का थाली की सही जबडा पूर्वकाल तोड़ने के लिए rongeur का प्रयोग करें. गाल की हड्डी का प्लेट के पूरे अधिकार जबडा पूर्वकाल ढीला होना चाहिए. धीरे जबडा अंतर्निहित किसी भी नाक के ऊतकों को अलग करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें, और फिर धीरे हड्डी टुकड़ा दूर उठा.
  6. बाएं छेनी और बाएँ पूर्वकाल जबडा ढीला और नाक की हड्डी निकाल दिया गया है के बाद उन्हें हटाने के लिए कदम 2.4 और 2.5 दोहराएँ.

3. नाक की हड्डी और पृष्ठीय zygomatic प्लेट हटाने

  1. पुन: करने दाँतेदार संदंश या rongeur का प्रयोग करेंनाक की हड्डियों को सिर्फ दुम ललाट हड्डियों के शेष के लिए कदम. हड्डी के इस टुकड़े को हटाने के बाद, नाक की हड्डी की दुम का हिस्सा संदंश का उपयोग सोचने के लिए मजबूर किया जा सकता है.
  2. गाल की हड्डी की थाली से जुड़ा है जो गाल की हड्डी का मेहराब, का अग्र भाग को तोड़ने के लिए rongeur का प्रयोग करें.
  3. गाल की हड्डी का थाली की पृष्ठीय अंत के पार्श्व किनारे पर ठीक संदंश लो और धीरे हड्डी फ्लिप और इसे हटा दें. हड्डी ढीली नहीं है, को हटाने के लिए यह ढीला करने के लिए धीरे इसे दबाना rongeur का उपयोग करें.
  4. सही और बाएँ नाक हड्डियों के बीच औसत दर्जे सीवन ढीला करने के लिए ठीक संदंश या एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करें.
  5. सही नाक की हड्डी की दुम का अंत पकड़ दाँतेदार संदंश का प्रयोग करें. धीरे ऊतक अंतर्निहित से इसे अलग करने के पक्ष की ओर से हड्डी चाल. यह पक्ष को हड्डी की ओर बढ़ने के लिए नाक की हड्डी की दुम का तीसरा साथ संदंश स्थानांतरित करने के लिए उपयोगी है. नाक की हड्डी को अलग करता है के रूप में, धीरे से दुम अंत से हड्डी उठा.
  6. टी जबकिवह नाक की हड्डी थोड़ा उठाया है, पतली श्वसन उपकला ऊतक के साथ तैयार है कि हड्डी का एक पार्श्व outcropping प्रकट करने के लिए पार्श्वतः हड्डी झुकाव. धीरे नाक की हड्डी से यह ऊतकों को रिलीज करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें. नाक की हड्डी लिफ्ट करने के लिए आगे बढ़ें. हड्डी पूरी तरह से अंतर्निहित ऊतक से अलग किया गया है, जब विजय - स्तम्भ अंत में नाक की हड्डी नाश करने के लिए कैंची का उपयोग करें.
  7. बाईं नाक की हड्डी को हटाने के लिए कदम 3.1, 3.5 और 3.6 दोहराएँ.
  8. कदम नाक के बाईं ओर के लिए 3.2 और 3.3 दोहराएँ.

4. पार्श्व zygomatic प्लेट हटाने

  1. एक समय में गाल की हड्डी का थाली एक तरफ हटा दें. या तो गाल की हड्डी का प्लेट पहले हटाया जा सकता है.
  2. एक उदर दृष्टिकोण से, तोड़ गण्डचाप तक पहुँच गण्डचाप को नीचा जबडा टूट गया.
  3. एक पृष्ठीय दृष्टिकोण से, धीरे गण्डचाप हड़पने के लिए और आगे और पार्श्व उठा. गाल की हड्डी का प्लेट अभी भी किसी भी ऊतक से जुड़ा हुआ है, तो ठीक लेसंदंश और धीरे ऊतक और हड्डी के बीच कनेक्शन तोड़.
  4. नाक के दूसरे पक्ष पर गाल की हड्डी का प्लेट के लिए दोहराएँ.

5. ऑर्बिट अस्थि निकालना

  1. एक उदर दृष्टिकोण से, नाक की दाढ़ के बीच पैलेंटाइन हड्डी तोड़.
  2. नाक के दोनों ओर 3 दाढ़ और जबडा तोड़ने के लिए rongeur का प्रयोग करें.
  3. नाक के दोनों ओर turbinates को उदर और पीछे की हड्डी के किसी भी शेष मोटी टुकड़े को तोड़ने और हटाने.

6. तितवस्थि निकालना

  1. Turbinates को दुम फैला हुआ तितवस्थि के किसी भी हिस्से को तोड़. इस turbinates को कवर तितवस्थि के पतले टुकड़े को हटाने जब turbinate ऊतक के नुकसान से बचने के लिए आवश्यक है.
  2. नाक के दाहिने हिस्से के लिए, सलाखें हड्डी के पूर्वकाल किनारे पर ठीक संदंश जगह है और धीरे इसे हटा दें. हड्डी के एक हिस्से में रहता है, जब तक सभी इस प्रक्रिया को दोहरानेturbinates को कवर पतली हड्डी निकाल दिया गया है. turbinate हड्डियों की तैयारी के अधिकांश में हटाया जा करने की जरूरत नहीं है. आयु वर्ग के चूहों में, चालनी - पटल भंगुर हो जाता है. नाक के ऊतकों के cryosectioning की जरूरत है, हड्डी की वजह से संभावित नुकसान को कम करने के लिए ठीक संदंश के साथ थाली के छोटे टुकड़े को हटा दें.
  3. नाक के बाईं ओर के लिए कदम 6.2) दोहराएँ.
  4. पहले सेक्शनिंग के लिए किसी भी शेष हड्डी के टुकड़े निकालें. नोट: पशुओं में अधिक पट हड्डी का एक वर्षीय, posterodorsal क्षेत्र की तुलना में कुछ मोटी और मुश्किल है. एक ठीक संदंश का उपयोग इस हिस्से को हटा सकते हैं. पट हड्डी और अस्तर उपकला ऊतक के पृष्ठीय भाग को अलग करने के लिए हड्डी के दोनों पक्ष में संदंश की नोक डालें. हड्डी हड़पने और नमूना पकड़ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें. पट के निचले उपास्थि भाग से ऊपरी बोनी हिस्से को तोड़ने के लिए और धीरे इसे दूर करने के लिए संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करें.

  1. हवा खींचने की मशीन वैक्यूम पंप सेट करें.
  2. एक embedding के सांचे में नाक रखें. अक्टूबर मीडिया में डूब नाक.
  3. नाक ऊतक के भीतर फंस हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक निर्वात का उपयोग करें. इस प्रक्रिया में 5 मिनट तक लग जाते हैं.
  4. हवाई बुलबुले को हटाने के बाद, वांछित अभिविन्यास में ऊतक सेट.
  5. अक्टूबर और सूखी बर्फ का उपयोग कर मोल्ड में ऊतक फ्रीज. एम्बेडेड ऊतक तो तुरंत cryosectioned या -80 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है.

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Representative Results

इस पद्धति का उपयोग करके, हम मज़बूती से लगभग पूरी तरह से बरकरार नाक ऊतक प्राप्त कर सकते हैं. चित्रा 2A एक paraformaldehyde तय सिर से वयस्क नाक नमूना की एक छवि से पता चलता है. इस नमूने में, मो, सेप्टल अंग, Gruneberg नाड़ीग्रन्थि, और VNO सहित सभी चार उप घ्राण संवेदी अंगों, बरकरार हैं. इसके अलावा, श्वसन epithelia और इस तरह के ग्रंथियों और जहाजों के रूप में subepithelial ऊतकों, संरक्षित कर रहे हैं. हम सफलतापूर्वक हम आकारिकी, वितरण, तंत्रिका तंत्रिका वितरण, और विभिन्न विशिष्ट संवेदी सेल आबादी 16,17,36-38 में सेल मार्कर अभिव्यक्ति की जांच में जो अध्ययन का एक संख्या में इस विधि का इस्तेमाल किया है.

चित्रा 2 बी एक साथ मस्तिष्क, घ्राण बल्ब, और नाक के साथ एक नमूना दिखाता है. इस विस्तारित तैयारी परिधीय और केंद्रीय घ्राण प्रणालियों के बीच तंत्रिका कनेक्शन की आवश्यकता है कि अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है. हम खोपड़ी हड्डियों सु निकाल कर इस नमूना तैयारपहले चेहरे की हड्डियों को हटाने के लिए मस्तिष्क rrounding. हमारे विस्तारित विधि जांचकर्ताओं एक भी तैयारी में परिधीय और केंद्रीय दोनों घ्राण प्रणाली पर प्रयोगों का संचालन करने की अनुमति देता है.

चित्रा 2 में दिखाया नाक ऊतक पूरे माउंट अवलोकन, साथ ही ऊतक वर्गों की तैयारी के लिए के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 3 मो और सांस दोनों क्षेत्रों के माध्यम से एक क्षैतिज खंड कटौती दिखा. चित्रा 3B बीच के माध्यम से कटौती एक राज्याभिषेक अनुभाग से पता चलता है मो की. हम विभिन्न संरचनात्मक स्थानों पर उपकला और submucosal संरचनाओं के विभिन्न प्रकार का एक बेहतर विचार के लिए तटस्थ लाल के साथ वर्गों दाग. इन परिणामों से हमारी तकनीक सामान्य और रोग की स्थिति के तहत नाक रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन का व्यापक और तुलनात्मक जांच सक्षम जो भी नाजुक मो turbinate संरचना और नाक के संरचनात्मक संगठन, को बरकरार रखता है कि प्रदर्शित करता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. पृथक नाक और मस्तिष्क के ऊतकों एक:.. हमारे deboning विधि का उपयोग विच्छेदित बरकरार नाक के ऊतकों के पृष्ठीय दृश्य बी:. बरकरार केंद्रीय और परिधीय घ्राण प्रणालियों के बीच तंत्रिका कनेक्शन के साथ एक नाक और मस्तिष्क के पृष्ठीय दृश्य बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. नाक के ऊतकों की धारा एक:.. घ्राण और सांस epithelia के साथ ही अन्य नाक संरचनाओं दिखा क्षैतिज खंड बी: turbinates ओ के माध्यम से कोरोनल अनुभागच नाक के पीछे में मो. दोनों वर्गों तटस्थ लाल के साथ 14 माइक्रोन मोटी और दाग थे मो. मुख्य घ्राण उपकला उत्तर:.. श्वसन उपकला बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ, हम नीचे ऊतक बख्शते हुए क्रमिक रूप से आसपास के हड्डियों को निकाल कर माउस नाक से बरकरार घ्राण और श्वसन ऊतक अलग करने के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया का प्रदर्शन किया. हम सावधान हड्डी को हटाने की उनकी संपूर्णता में भी सबसे नाजुक ऊतकों की रक्षा कर सकते हैं. हम यह भी तंत्रिका कनेक्शन की रक्षा करने के साथ मस्तिष्क और नाक के ऊतकों दोनों को अलग जिसमें इस तकनीक के संभावित संशोधनों में अंतर्दृष्टि साझा करें. इस नई विधि स्वस्थानी संकरण में immunohistochemical, शाही सेना में आगे की प्रक्रिया, और शारीरिक प्रयोगों के लिए एक भी नमूना में पूरे घ्राण और श्वसन ऊतकों को अलग करने के लिए एक साधन प्रदान करता है.

अस्थि हटाने के लाभ

हमारे विधि से पहले, विकैल्सीभवन एजेंट आमतौर पर ऊतक सेक्शनिंग और immunohistochemistry के लिए हड्डियों को नरम करने के लिए इस्तेमाल किया गया. हालांकि, विकैल्सीकरण, हड्डी के आकार और जानवरों की उम्र के आधार परघंटे या कई दिनों 29,30 के लिए हड्डी decalcifiers में ऊतक ऊष्मायन की आवश्यकता होती है एक लंबी प्रक्रिया हो सकती है. आमतौर पर इस्तेमाल एजेंटों को भी बदलने या 29,30 immunolabeling बाधित कर सकते हैं कि ऊतक पर प्रभाव पड़ सकता है जो एसिड होते हैं. इस लड़ाई, कुछ शोधकर्ताओं हड्डी 24,26-28 से कैल्शियम आयनों पृथक समाधान ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) का उपयोग करें. विकैल्सीकरण का यह तरीका भी दिन की आवश्यकता है. यहाँ दिखाया विच्छेदन के बारे में 20-30 मिनट में किया जा सकता है और ऊतक के stainability बदल सकता है कि किसी भी रासायनिक समाधान के आवेदन की आवश्यकता नहीं है.

हमारे विधि भी शारीरिक रिकॉर्डिंग के लिए जीवित ऊतक प्राप्त करने के लिए एक लाभ प्रदान करने, हौसले से विच्छेदित नाक से बरकरार नाक ऊतक प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, नाक स्लाइस सामान्यतः 2 सीए के लिए उपयोग किया जाता है + घ्राण उपकला 31,32 में OSNs और समर्थन कोशिकाओं की इमेजिंग. इन स्लाइस होना जरूरीकठोर ऊतकों के आसपास के हड्डियों से पहले नवजात चूहों से तैयार किया. घ्राण उपकला postnatally विकास और परिपक्वता जारी है क्योंकि हालांकि, नवजात नमूनों वयस्कों के लिए समान नहीं हैं. हमारे विधि का प्रयोग, शोधकर्ताओं ने नवजात की उम्र से अधिक उम्र के चूहों से बरकरार घ्राण ऊतक प्राप्त कर सकते हैं. यह विशेष रूप से उम्र पर निर्भर परिवर्तन के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है.

संशोधन और निवारण

हम आसपास के हड्डियों को दूर करने के लिए एक प्रभावी अनुक्रम दिखाया. हालांकि, वहाँ बरकरार नाक के ऊतकों को प्राप्त करने के लिए हड्डी को हटाने के अन्य दृश्यों रहे हैं, और कदम प्रक्रिया द्वारा कदम शोधकर्ता और सबसे अधिक ब्याज के ऊतकों की व्यक्तिगत जरूरतों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है. Vomeronasal अंग की जरूरत है अगर हटाने के दौरान वांछित जगह में ऊतक पकड़ को काबू करने के लिए अधिक हड्डी से ढके क्षेत्र हैं क्योंकि उदाहरण के लिए, VOMER हड्डी जल्दी प्रक्रिया में हटाया जाना चाहिए. Adap द्वाराटिंग प्रत्येक आवेदन करने की प्रक्रिया, ब्याज के ऊतकों और प्रसंस्करण के लिए बरकरार रहने की संभावना हैं. नाक की हड्डियों को भी नीचे ऊतक हड्डियों को पकड़ लेता है और हड्डियों को दूर हटा लिया जाता है के रूप में अक्सर आंसू जाएगा, के रूप में दूर करने के लिए मुश्किल हो जाते हैं. वीडियो में दिखाया गया है नाक की हड्डियों wiggling के अलावा, छोटे संदंश धीरे नाक की हड्डी और हटाने के दौरान हड्डियों से ऊतक नीचे ले जाने और दूर करने में मदद करने के लिए अंतर्निहित ऊतक के बीच में डाला जा सकता है.

विच्छेदन भी थोड़ा चूहों की उम्र पर निर्भर करता है. युवा चूहों में, हड्डियों बड़े चूहों की हड्डियों अधिक भंगुर होते हैं और दृढ़ता से कुछ क्षेत्रों में पड़ोसी हड्डियों के लिए जुड़े हुए हैं, जबकि नरम हो जाते हैं. नरम हड्डी को अलग करना और कठिन हड्डी से छोटे टुकड़ों में दूर करने के लिए आसान है. इस अंतर को आसानी से उनकी जुदाई और स्वच्छ हटाने में सहायता करने के लिए हड्डियों के बीच कनेक्शन पर स्कोर या परिमार्जन करने संदंश का उपयोग करके दूर किया जा सकता है. बड़े जानवरों में, posterodorsal पुनःपट के इलाके कुछ मोटी और कठिन है और cryosectioning से पहले हटा दिया जाना चाहिए. प्रक्रिया 6.4 में वर्णित के रूप में पट की बोनी हिस्से को हटाया जा सकता है. पुराने और युवा चूहों के विच्छेदन में छोटे मतभेद हैं, उम्र एक कारक सीमित नहीं है. हमारे अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक 14 दिन से दो साल की उम्र से लेकर चूहों से बरकरार नाक के ऊतकों को तैयार किया है.

ताजा ऊतक नरम है और अधिक सावधान हेरफेर की आवश्यकता है, हालांकि लगानेवाला तय नाक के लिए और ताजा नाक के लिए इस्तेमाल किया विदारक कदम के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर है. दोनों की तैयारी में, विच्छेदन के दौरान ऊतक humidified रखते हुए महत्वपूर्ण है. यह समय समय पर इसके विरुद्ध बनाए रखने के लिए आपूर्ति की ऊतक humidified और पोषक रखेंगे के रूप में महत्वपूर्ण है Tyrode के समाधान में ऊतक सूई या विदारक जबकि ऊतक पर समाधान टपकता है, तथापि, बफर खारा में ताजा ऊतक विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक नहीं हैiability.

यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया आगे एक भी नमूना (चित्रा 2 बी) में मस्तिष्क और नाक दोनों बरकरार छोड़ देता है कि हड्डी को हटाने में शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इस संशोधन चालनी - पटल के माध्यम से उस पास मस्तिष्क और नाक के बीच तंत्रिका कनेक्शन की जरूरत नहीं पड़ती. अधिक तकनीकी कौशल और समय अकेले नाक से इस विच्छेदन के लिए आवश्यक हैं. हालांकि, परिधि से मस्तिष्क के लिए कनेक्शन के संरक्षण के लिए इस विधि से अधिक विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है.

सीमाएं

हम सीटू संकरण विश्लेषण में immunohistochemical लेबलिंग और mRNA सहित अध्ययन का एक नंबर, के लिए नाक के ऊतकों को तैयार करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है, और सफलतापूर्वक संकेत दे रास्ते, विभिन्न सेल आबादी में दाग सेल मार्कर में कई प्रोटीन लेबल है, और रूपात्मक सुविधाओं और सेल वितरण की जांच की नाक गुहा 16,17,36-39 के माध्यम से. हम विस्तार नहीं कियाcryosectioning और immunolabeling में erience सीमाओं. एक भी नमूना में जुड़े मस्तिष्क और नाक के ऊतकों रहता है कि विस्तारित तैयारी की cryosectioning की आवश्यकता है कि अध्ययन के लिए, हम बड़े चूहों में भंगुर चालनी - पटल सेक्शनिंग दौरान ऊतकों को नुकसान बना सकते हैं के बाद से 4 महीने की तुलना में छोटी चूहों का उपयोग करने की सलाह देते हैं. हालांकि, electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए इरादा ताजा ऊतक के लिए, turbinates के बीच औसत दर्जे ऊतकों पूरे माउंट तैयारी में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं. असतत क्षेत्रों में ऊतक या बंटवारे के छोटे टुकड़े से निकालना समस्या को दूर कर सकते हैं. परंपरागत विद्युत olfactogram एंडो turbinates 25,33,34 की औसत दर्जे की सतह पर किया गया है, इसलिए हमारे ऊतक तैयारी थोड़ा हेरफेर के साथ अन्य क्षेत्रों से रिकॉर्डिंग अनुमति दे सकता है.

Immunohistochemistry परे एप्लीकेशन

प्रक्रिया के कई आवेदन तकनीक में महारत हासिल है, जो उन लोगों के लिए मौजूद हैं. संभव अनुप्रयोगोंआयनों के अन्य तरीकों का उपयोग कर, अक्षत और उनके मूल संरचनात्मक विन्यास में प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो गया है, जो घ्राण और श्वसन ऊतकों पर जोनल अध्ययन में शामिल हैं. आवेदन भी पूरे, ताजा ऊतकों पर एक साथ एकाधिक रिकॉर्डिंग की अनुमति देकर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए मौजूद हैं. मौजूदा तकनीक का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल थे जो इन आवेदनों में से कुछ,, हमारे deboning विधि द्वारा ही संभव बनाया है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी महत्वपूर्ण तुलना के लिए विभिन्न क्षेत्रों में लगातार नमूना संग्रह की आवश्यकता होती है, जैव रासायनिक जीनोमिक और प्रोटिओमिक पढ़ाई के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

संक्षेप में, हम तेजी से और मज़बूती से आसपास के हड्डियों को निकाल कर माउस नाक में घ्राण और श्वसन ऊतकों का उपयोग करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित किया है. इस विधि ऐसे विकैल्सीकरण के रूप में अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है. इसके अलावा, हमारे विधि कोई रासायनिक उपचार की आवश्यकता होती है, इसलिए ऊतकों immunohistochemist में इस्तेमाल के लिए ही सीमित नहीं हैंry के प्रयोगों, लेकिन यह भी स्वस्थानी संकरण और मनोवैज्ञानिक अध्ययनों में के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रकार, हमारे विधि आगे की प्रक्रिया के लिए माउस नाक तैयार करने के लिए एक तेज, और अधिक सीधा रास्ता है. हम हमारे विधि नाक क्षेत्रों में घ्राण और सांस की पढ़ाई की सुविधा होगी उम्मीद है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgements

इस काम Weihong लिन के लिए अनुसंधान अनुदान (एनआईएच / NIDCD 009269, 012831 और ARRA प्रशासनिक पूरक एनआईएच अनुदान) द्वारा समर्थित किया गया था. हम विशेष रूप से videotaping और प्रसंस्करण में उनकी तकनीकी सहायता के लिए UMBC पर श्री टिम फोर्ड धन्यवाद. हम भी videotaping में उनके उपकरणों की सहायता के लिए ओलिंप अमेरिका इंक से डा. डाफ्ने ब्लमबर्ग, UMBC पर सुश्री Chere पैटी और श्री निकोलस McCollum शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width World Precision Instruments (WPI) 501333
Fine forceps, Dumont 3 WPI 503235
Fine forceps, Dumont 55 WPI 14099
Fine forceps, Dumont AA Fine Science Tools (FST) 11210-20
Specimen forceps, Serrated VWR 82027-440
Operating scissors WPI 501753
Iris scissors, Straight Miltex V95-304
Dissection microscope Olympus SZ40
Name Company Catalog Number Comments
Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound Sakura Finetek 4583
Plastic embedding mold VWR 15160-215
Aspirator vacuum pump Fisher Scientific 09-960-2
Name Company Catalog Number Comments
Section staining
Neutral red ACROS Organic CAS 553-24-2 Nuclei staining

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References

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Comments

1 Comment

  1. dear David dunston,
    I would appreciate to be able to visualize your dissection method.Thanking you by advance, best regards, Patricia Duchamp-Viret

    Reply
    Posted by: Patricia D.
    February 4, 2014 - 5:31 AM

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