Un désossage méthode manuelle en vigueur pour préparer Intact souris tissu nasal avec l'organisation anatomique préservée

1Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
* These authors contributed equally
Published 8/10/2013
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Biology

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Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization. J. Vis. Exp. (78), e50538, doi:10.3791/50538 (2013).

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Abstract

Le nez des mammifères est un organe multifonctionnel avec des structures internes complexes. La cavité nasale est bordée de divers épithéliums comme l'épithélium olfactif, respiratoires et squameuses qui se distinguent nettement dans des endroits anatomiques, la morphologie et les fonctions. Chez la souris adulte, le nez est couvert de différents os du crâne, ce qui limite l'accès expérimental aux structures internes, en particulier ceux dans le postérieur comme l'épithélium olfactif principal (MOE). Nous décrivons ici une méthode efficace pour obtenir la quasi-totalité et intact tissus nasaux avec l'organisation anatomique préservée. L'utilisation d'outils chirurgicaux sous un microscope à dissection, nous enlevons successivement les os du crâne autour du tissu nasal. Cette procédure peut être effectuée sur les deux, têtes de souris peau paraformaldéhyde fixes et fraîchement disséqué. La procédure de désossage complet prend environ 20-30 min, ce qui est nettement plus courte que la durée de l'essai requis pour conventionnel à base chimique decalcification. En outre, nous présentons une méthode facile pour éliminer les bulles d'air piégées entre cornets, ce qui est critique pour obtenir des coupes horizontales ou coronale ou sagittale minces intactes de la préparation de tissu nasal. Tissu nasal préparés en utilisant notre méthode peut être utilisée pour toute observation de montage de l'ensemble de l'épithélium, ainsi que morphologique, immunocytochimique, l'ARN par hybridation in situ et des études physiologiques, en particulier dans les études où spécifique à la région examen et la comparaison d'intérêt.

Introduction

La cavité nasale mammifères contient différents types de tissus et d'organes qui remplissent des fonctions distinctes. La cavité nasale constitue la partie d'entrée de l'appareil respiratoire supérieur, ce qui permet des déplacements de l'air dans et hors des poumons. L'air inhalé passe à travers la cavité nasale où il subit une température et une humidité conditionnement 1, ainsi que de nettoyage ou de filtration pour éliminer les substances et les micro-organismes infectieux 2 irritantes et toxiques. Les deux traitements sont effectués par l'épithélium nasal et les tissus sous-épithéliaux, y compris les glandes et les vaisseaux et sont essentiels pour protéger les voies respiratoires inférieures et des poumons. En plus de son rôle dans la respiration et de la défense épithélial, le tissu nasal contient également des appareils sensoriels périphériques des systèmes olfactifs et trijumeau, qui détectent un large éventail de substances chimiques dans l'air qui passe. Selon le système est activé, la détection sensorielle de produits chimiques dans le nez peut provoquer soitun sens de l'odorat, de l'irritation ou de la douleur 3,4.

Le système olfactif périphérique est complexe et composée de plusieurs organes sensoriels olfactifs anatomiquement séparés dans la cavité nasale. Parmi eux, l'épithélium olfactif principal (MOE) est le plus grand, ce qui représente environ 45-52% de l'épithélium nasal chez les rongeurs 5 et est situé dans la région postérieure. Dans la région antéroventrale, il ya une paire de structures tubulaires connues sous le nom organe voméronasal 6, qui siègent le long de chaque côté de la cloison nasale. Deux petits groupes supplémentaires de neurones sensoriels olfactifs, connu comme l'organe septal de Masera 7,8 et le ganglion Gruneberg 9, résident le long de la cloison ventrale et la zone d'entrée dorsale de la cavité nasale, respectivement. Ces organes périphériques contiennent neuro-épithélium avec des caractéristiques distinctives de la morphologie, de l'expression des marqueurs des cellules et la fonction physiologique. Ensemble, ils détectent des milliers d'odeursmolécules avec une exquise sensibilité 10-12.

En plus des organes sensoriels olfactifs, la cavité nasale abrite également d'autres systèmes sensoriels. Il est connu que les fibres de nerf trijumeau peptidergiques sont présents dans l'épithélium nasal, en particulier l'épithélium respiratoire 13,14. Certaines de ces fibres détection des produits chimiques irritants et toxiques et sont responsables d'initier réflexes protecteurs tels que la toux et les éternuements 4,15. Composés odorants et amer irritants peuvent également être détectés par une population récemment découvert des cellules chimiosensoriels solitaires (SCC), dont beaucoup sont innervés par des fibres de nerf trijumeau 16-19. Ces CSC sont situés à une densité plus élevée dans la région d'entrée de la cavité nasale et des voies d'entrée voméronasal, laissant entendre qu'ils pourraient également avoir une fonction protectrice 16-18. Ainsi, l'épithélium nasal peut varier considérablement en fonction, la morphologie et la composition de la cellule en fonction de leuremplacements anatomiques.

Même au sein d'une seule et spécialisée épithélium, il existe des différences régionales. Le ministère de l'Environnement en est un exemple. Les lignes MEO différents de cornets, qui sont complexes et structures recourbé. Grâce à eux, les différentes régions de l'expérience différents débits d'air Moe, et donc différente de diffusion et de taux d'élimination des molécules odorantes air 20. En outre, on sait que les neurones sensoriels olfactifs (ARS) exprimant un récepteur d'odeur donnée sont situés dans l'une des quatre zones contournées de la MOE 21,22. Comment cette différence de situation affecte la réponse de l'OSN à odorants est largement inconnue. En outre, certaines populations présentent OSN préférence régionale. ARS Guanylyl cyclase-D (GC-D) exprimant des répartitions zonales favorisant les régions cul-de-sac de l'ectoturbinates 23,24. Plus récemment, nous avons constaté une sous-population des ARS canoniques qui exprime transitoire récepteur potentiel canal M5 (trpM5) et est de préférence situé dans les régions latérales et ventrale 25. Ces résultats indiquent que le MEO n'est pas uniforme. Cependant, comment ces différences régionales affectent codage olfactif n'est pas compris. C'est en partie à cause physiologique enquête approfondie de la MOE et le nez a été limitée par la difficulté d'obtenir intact nasal épithélium avec l'organisation anatomique conservés par des méthodes actuelles.

L'épithélium nasal sont principalement entouré par les os du crâne antérieures, y compris le nasal, maxillaire, palatin, zygomatique, et les os ethmoïde. Chez les souris adultes et d'autres modèles de rongeurs, ces os sont durs et difficiles à enlever sans endommager le tissu nasal étroitement associé, notamment les cornets délicates. Souvent, détartrage à base chimique est utilisé pour adoucir les os pour permettre cryosectioning des tissus nasaux pour morphologique, immunohistochimique, et dans les études d'hybridation in situ, mais dépendanceding sur l'âge de l'animal, le processus de décalcification peut durer une nuit jusqu'à 7 jours 24,26-28. Ce traitement est également limitée car elle nécessite tissu soit fixateur préservé. En outre, la décalcification chimique peut être dur et affecter l'immuno-marquage de certains anticorps sensibles à 29,30. Pour les études physiologiques, les tissus vivants est nécessaire, et donc, ces expériences sont souvent effectués sur ARS isolés ou en tranches ME obtenues à partir de nouveau-nés dont les os crâne sont minces et souples 17,31,32. Des études physiologiques peuvent également utiliser des préparations de montage entières en divisant la tête 25,33,34, mais en général seulement la surface interne du nez est facilement accessible, ce qui limite les enregistrements physiologiques sur d'autres domaines.

Ici, nous décrivons une méthode de désossage efficace, manuel pour préparer les tissus nasaux intactes avec l'organisation anatomique d'origine préservé et la morphologie. Nous enlevons successivement les principaux os de la partie antérieurecrâne sous un microscope de dissection pour exposer un épithélium nasal presque entièrement intact tout en gardant les os minces cornets intact à moins que les souris sont très vieux et cryosectioning est nécessaire. On étend également la méthode pour préserver la connexion entre les tissus des voies nasales et des bulbes olfactifs, ainsi que le reste du cerveau, ce qui facilite l'examen simultané des deux circuits périphériques et centraux. Notre méthode peut être utilisée pour préparer paraformaldéhyde-fixe, ainsi que les frais, tissu nasal direct. Ainsi, on s'attend à notre méthode pour faciliter les études morphologiques, immuno et physiologique de la respiration, olfaction, et nasale dommages et la maladie.

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Protocol

1. Souris Nez Préparation

Nous avons utilisé des souris C57BL / 6 de fond adultes dans cette étude. Tous les soins et les procédures animaux sont approuvés par le soin des animaux et les Comités d'utilisation (IACUC) de l'Université du Maryland, Baltimore County.

1.1 L'acquisition du nez de souris paraformaldahyde-fixes

Figure 1
Figure 1. Os d'un crâne de souris. A: vue dorsale du crâne B: vue ventrale. Du crâne avec la mandibule retiré. Le crâne a été préparé à partir d'une vieille souris de 40 jours. Os individuels sont colorés pour une meilleure visualisation. Cliquez ici pour agrandir la figure .

  1. Perfuser transcardiaque de fixer souris individuelles suite èmee protocole de Lin, et al., (2008) 16. Brièvement, les souris ont été profondément anesthésiés avec tribromoéthanol (Avertin 250 pg / g de poids corporel), perfusé transcardiaque avec tampon phosphate 0,1 M (PB, 30-50 ml), suivi par un tampon phosphate fixateur contenant du paraformaldéhyde 3%, 19 mM de L-lysine monohydrochloride, et 0,23% de sodium m-periodate (environ 35-50 ml). On peut également suivre les étapes dans l'article JoVE pour perfusion animale 35.
  2. Utilisez une paire de ciseaux pour couper la mandibule (ou la mâchoire inférieure) et enlever la peau sur la tête.
  3. Séparer la totalité de la tête du reste du corps.
  4. Retirez le palais. Aussi, nettoyer et enlever le tissu conjonctif et les muscles restant sur ​​la surface du crâne pour obtenir l'échantillon représenté dans les figures 1A et 1B.
  5. Sous un microscope de dissection, retirer l'os du crâne recouvrant le cerveau et le bulbe olfactif. Coupez le tissu et d'os en excès. Nonte, pour la préparation de tissu étendue dans laquelle le cerveau et les nez restent connectés, seuls les os du crâne sont enlevés. Pour les expériences d'immunohistochimie, le tissu a été post-fixé pendant 1,5 heure et transféré à 0,1 M tampon phosphate salin (PBS) avec 25% de saccharose pendant la nuit. Tissu nasal doit être maintenue tout au long de la dissection humidifié en le plongeant dans la solution de saccharose tamponné à plusieurs reprises.

1.2 L'acquisition du nez de souris fraîchement euthanasiés

  1. Souris individuelles ont été transférés dans une cage propre et exposés à des gaz CO 2, qui a été suivie par dislocation cervicale 5 min après le dernier souffle. Pour réduire le sang dans les tissus du nez, utiliser une paire de ciseaux pour ouvrir le coffre et coupez le cœur pour permettre au sang de s'écouler.
  2. Répéter les étapes 1.1.2 à 1.1.5, à l'exception de la post-fixation et cryoprotection avec 25% de saccharose. Le spécimen devrait être maintenu humidifié et maintenue avec une solution saline contenant de Tyrode (en mm): 140 NaCl, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 pyruvate de Na, le 10 D-glucose, et de 10 N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique acide tampon (HEPES, ajusté à pH 7,4). Sinon, pliez un morceau de Kimwipes, tremper avec la solution, et le lieu de Tyrode sous le spécimen tout disséquer et parfois plonger l'échantillon dans une solution de Tyrode ou déposez une solution sur le tissu pour le maintenir humidifiée pour maintenir la viabilité des cellules et des tissus .

2. Incisive, antérieure Vomer et renvoi os maxillaire

  1. Partir d'un point de vue ventrale. Localisez le vomer et de briser l'os vomer sur toute sa longueur à l'aide d'une gouge ou une pince à dents pour briser la majeure partie ventrale de l'os.
  2. En utilisant des pinces dentelées, retirez les segments brisés de l'os vomer par sillonnent doucement les fragments d'os loin de l'organe voméronasal (VNO). Remarque, pour les souris moins d'un mois, ou si seulement intéressés par la MOE, ces deux steps peut être ignorée.
  3. Tenez fermement la tête avec une pince. Utilisez le rongeur de briser la partie avant des deux incisives et de la région d'articulation du maxillaire antérieur entre les deux incisives et le vomer.
  4. Casser la partie ventrale de la droite maxillaire à la région juste en avant de l'arcade zygomatique jusqu'au niveau de la plaque dorsale zygomatique.
  5. Retournez sur le nez d'un point de vue dorsale. Utilisez le rongeur de briser le maxillaire droit antérieur de la plaque dorsale zygomatique. L'ensemble du maxillaire droit antérieur de la plaque zygomatique doit être lâche. Utilisez les pinces fines pour séparer doucement tout tissu nasal qui sous-tend le maxillaire supérieur, puis soulevez doucement le fragment d'os.
  6. Répétez les étapes 2.4 et 2.5 pour desserrer l'incisive gauche et maxillaire antérieur gauche et les supprimer après l'os nasal a été supprimé.

3. Os nasal et retrait de la plaque dorsale zygomatique

  1. Utilisez la pince ou dentelée, le rongeur à nouveaupasser le reste de l'os frontal juste caudal des os du nez. Après avoir enlevé ce morceau d'os, la partie caudale de l'os nasal peut être saisie avec une pince.
  2. Utilisation de la pince-gouge pour rompre la portion antérieure de l'arcade zygomatique, qui est reliée à la plaque zygomatique.
  3. Prenez les pince fine au bord latéral de l'extrémité postérieure de la plaque zygomatique et retournez délicatement l'os et le retirer. Si l'os n'est pas lâche, utilisez le rongeur pour serrer doucement pour le desserrer pour l'enlèvement.
  4. Utilisez les pince fine ou d'une lame de rasoir pour desserrer la suture médiane entre les os du nez droit et gauche.
  5. Utilisez la pince crantée pour saisir l'extrémité caudale de l'os nasal droit. Déplacez doucement l'os d'un côté à l'autre de la séparer de tissus sous-jacents. Il est utile pour déplacer la pince le long du troisième caudale de l'os nasal destiné à déplacer le côté de l'os à l'autre. Comme l'os nasal sépare, soulever lentement l'os à partir de l'extrémité caudale.
  6. Alors til os nasal est légèrement levé, inclinez l'os latéralement pour révéler un affleurement latérales de l'os qui est bordée mince tissu épithélial respiratoire. Utilisez une pince fine pour libérer doucement ce tissu de l'os nasal. Continuer à soulever l'os nasal. Lorsque l'os est complètement séparé du tissu sous-jacent, utiliser des ciseaux pour couper l'os nasal à la fin rostral.
  7. Répétez les étapes 3.1, 3.5 et 3.6 pour le retrait de l'os nasal gauche.
  8. Répétez les étapes 3.2 et 3.3 pour le côté gauche du nez.

4. Retrait de la plaque latérale zygomatique

  1. Retirer la plaque zygomatique d'un côté à la fois. Soit plaque zygomatique peut être retiré en premier.
  2. D'un point de vue ventrale, briser la mâchoire inférieure à l'arcade zygomatique jusqu'au break atteint l'arcade zygomatique.
  3. D'un point de vue dorsale, prenez doucement l'arcade zygomatique et soulever l'avant et latérale. Si la plaque zygomatique est encore attaché à n'importe quel tissu, prendre l'amendepinces et couper délicatement les connexions entre le tissu et l'os.
  4. Répéter la plaque zygomatique de l'autre côté du nez.

5. Retrait des os de l'orbite

  1. D'un point de vue ventrale, briser l'os palantine entre les molaires du nez.
  2. Utilisation de la pince-gouge pour briser les trois molaires du maxillaire supérieur et de chaque côté du nez.
  3. Casser et enlever les gros morceaux restants de la moelle ventrale et postérieure aux cornets de chaque côté du nez.

6. Enlèvement d'os ethmoïde

  1. Casser une partie de l'os ethmoïde saillie caudale pour les cornets. Cela est nécessaire pour éviter la perte de tissu cornet lors de la suppression de minces morceaux de l'os ethmoïde couvrant les cornets.
  2. Pour le côté droit du nez, de placer les pince fine sur le bord antérieur de l'os ethmoïde et retirez-le délicatement. Si une partie de l'os reste, répétez cette procédure jusqu'à ce que tousl'os mince recouvrant les cornets a été éliminée. Les cornets n'ont pas besoin d'être enlevé dans la plupart des préparations. Chez les souris âgées, la lame criblée devient cassant. Si cryosectioning du tissu nasal est nécessaire, retirer des petits morceaux de la plaque avec des pinces fines pour réduire les dommages potentiels causés par l'os.
  3. Répéter l'étape 6.2) pour le côté gauche du nez.
  4. Retirez tous les fragments d'os restants avant la coupe. Note: les animaux de plus de un ans, la région postérodorsale de l'os de la cloison est un peu épais et dur. On peut supprimer cette partie à l'aide de pinces fines. Insérer la pointe de la pince dans les deux côtés de l'os pour séparer la partie dorsale de la cloison os et le tissu épithélial de revêtement. Utilisez une paire de pinces pour attraper l'os et maintenez le spécimen. Utilisez une autre paire de pinces pour briser la partie supérieure osseuse de la partie cartilagineuse inférieure du septum et retirez-le délicatement.

  1. Mettre en place la pompe à vide de la trompe.
  2. Placer le nez dans un moule d'enrobage. Plonger le nez dans les médias octobre
  3. Utilisez un aspirateur pour éliminer les bulles d'air emprisonnées dans les tissus du nez. Ce processus peut prendre jusqu'à 5 min.
  4. Après avoir enlevé les bulles d'air, régler le tissu dans l'orientation désirée.
  5. Geler les PTOM et les tissus dans le moule avec de la glace sèche. Le tissu peut ensuite être intégré cryosectioned immédiatement ou stocké à -80 ° C pour une utilisation future.

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Representative Results

En utilisant cette méthode, nous pouvons obtenir de manière fiable tissu nasal presque entièrement intact. Figure 2A montre une image du spécimen nasal adulte à partir d'une tête paraformaldéhyde fixe. Dans ce modèle, tous les organes sensoriels olfactifs sous-quatre, y compris le ministère de l'Environnement, organe septal, le ganglion Gruneberg et VNO, sont intacts. En outre, l'épithélium respiratoire et des tissus sous-épithéliaux, tels que les glandes et les vaisseaux, sont conservés. Nous avons utilisé cette méthode avec succès dans un certain nombre d'études dans lesquelles nous avons étudié la morphologie, la distribution, l'innervation du nerf, et l'expression du marqueur de cellules dans différentes populations de cellules sensorielles spécialisées 16,17,36-38.

La figure 2B montre un spécimen avec le cerveau, bulbes olfactifs, et le nez ensemble. Cette préparation étendu est particulièrement utile dans les études qui requièrent une connexion nerveuse entre les systèmes olfactifs périphériques et centraux. Nous avons préparé ce spécimen en enlevant le crâne os surrounding le cerveau avant l'enlèvement des os faciaux. Notre méthode élargie permet aux chercheurs de mener des expériences sur le système olfactif périphérique et central dans une seule préparation.

Le tissu nasal montre la figure 2 peut être utilisé pour l'observation ensemble de montage, ainsi que pour la préparation des coupes de tissus. Figure 3A montrent une réduction de section horizontale à travers les régions de Moe et respiratoire. Figure 3B représente une coupe coronale couper par le milieu de la MOE. Nous avons coloré les sections au rouge neutre pour une meilleure vue des différents types de structures épithéliales et sous-muqueux à différents emplacements anatomiques. Ces résultats démontrent que notre technique conserve encore la structure délicate ME cornet et de l'organisation anatomique du nez, qui permettent enquête approfondie et comparative de l'évolution morphologique et fonctionnelle du nez dans des conditions normales et pathologiques.

Figure 2
Figure 2. Isolé nasal et le tissu cérébral A:.. Vue dorsale du tissu nez intact disséqué en utilisant notre méthode de désossage B:. Vue dorsale d'un nez et le cerveau avec des connexions neuronales entre les systèmes olfactifs centraux et périphériques intactes Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. Les sections de tissus nasaux A:.. Une section horizontale montrant l'épithélium olfactif et respiratoire ainsi que d'autres structures nasales B: Coupe coronale à travers le cornets of la MOE dans la partie postérieure du nez. Les deux sections étaient de 14 um d'épaisseur et colorées avec du rouge neutre MOE:. Épithélium olfactif principal de RE:.. Épithélium respiratoire Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Ici, nous avons démontré une procédure étape par étape pour isoler le tissu olfactif et respiratoire intact du nez de la souris en enlevant successivement les os environnants tout en épargnant les tissus ci-dessous. Nous montrons que la suppression de l'os attentif peut conserver même les tissus les plus délicats dans leur intégralité. Nous partageons également un aperçu des modifications possibles de cette technique, dans lequel on isole à la fois le cerveau et les tissus du nez ensemble pour préserver la connexion nerveuse. Cette nouvelle méthode fournit un moyen pour isoler l'ensemble des tissus olfactive et respiratoire dans un seul échantillon pour un traitement ultérieur en immunohistochimie, hybridation in situ d'ARN, et les expériences physiologiques.

Avantages de déplacement d'os

Avant notre méthode, des produits détartrants étaient généralement utilisés pour adoucir les os pour la coupe des tissus et immunohistochimie. Toutefois, en fonction de la taille de l'os et de l'âge des animaux, décalcificationpeut être un long processus qui exige incubation de tissu dans détartrants os pendant des heures ou même plusieurs jours 29,30. Les agents couramment utilisés contiennent également des acides qui peuvent avoir des effets sur le tissu qui peuvent altérer ou entraver immunomarquage 29,30. Pour lutter contre cela, certains chercheurs utilisent de l'acide éthylène diamine (EDTA) solution pour séquestrer les ions calcium de l'os 24,26-28. Cette méthode de décalcification nécessite aussi des jours. La dissection montré ici peut être effectuée dans environ 20-30 minutes et ne nécessite pas l'application de toutes les solutions chimiques qui peuvent altérer la tachabilité de tissu.

Notre méthode peut également être utilisée pour obtenir le tissu nasal intact de nez fraîchement disséqués, fournissant un avantage pour l'obtention de tissus vivants pour les enregistrements physiologiques. Par exemple, des tranches de nez sont couramment utilisés pour l'imagerie Ca 2 + des ARS et des cellules de soutien dans l'épithélium olfactif 31,32. Ces tranches doivent êtrepréparé à partir de souris néonatales avant que les os qui entourent les tissus durcis. Cependant, les échantillons néonatals ne sont pas identiques aux adultes parce que l'épithélium olfactif continue le développement et la maturation postnatale. Grâce à notre méthode, les chercheurs peuvent obtenir des tissus intacts olfactif de souris plus âgées que les âges nouveau-nés. Cela présente un avantage significatif, en particulier dans l'étude des changements dépendant de l'âge.

Modifications et dépannage

Nous avons montré une séquence efficace pour enlever les os environnants. Cependant, il ya d'autres séquences d'élimination os pour obtenir des tissus nasaux intacts, et la procédure étape par étape peuvent être modifiées en fonction des besoins individuels du chercheur et les tissus les plus intéressants. Par exemple, si l'organe voméronasal est nécessaire, le vomer doit être retiré au début de la procédure, car il ya des zones plus d'os recouvert de saisir à maintenir le tissu à l'endroit souhaité lors de l'enlèvement. Par adaptationTing la procédure à chaque application, tissus d'intérêt sont plus susceptibles de rester intacts pour un traitement ultérieur. Les os du nez ont également tendance à être difficiles à enlever, comme le tissu en dessous s'accroche aux os et souvent se déchirer comme les os sont levées loin. En plus de se remuer les os du nez comme le montre la vidéo, petites pinces peuvent être insérées doucement entre l'os nasal et le tissu sous-jacent pour aider à déplacer le tissu vers le bas et loin des os lors de l'enlèvement.

La dissection varie aussi légèrement selon l'âge des souris. Chez les jeunes souris, les os ont tendance à être plus doux, tandis que les os des souris plus âgées sont plus fragiles et fortement soudées aux os voisins dans certaines régions. Os mou est plus facile de séparer et d'éliminer en petits morceaux que l'os dur. Cette différence peut être facilement résolu en utilisant une pince à marquer ou une égratignure au niveau des connexions entre les os pour faciliter leur séparation et l'élimination propre. Chez les animaux plus âgés, la postérodorsale region du septum est un peu épaisse et dure et doit être enlevée avant cryosectioning. La partie osseuse de la cloison peut être éliminé comme décrit dans la procédure 6.4. Bien qu'il existe de petites différences dans la dissection des souris plus âgées et les plus jeunes, l'âge n'est pas un facteur limitant. Dans nos études, nous avons préparé avec succès tissus nasaux intactes de souris allant de 14 jours à deux ans.

Il n'y a pas de différence significative entre les étapes de dissection utilisé pour le nez fixateur fixe et pour le nez frais, bien que le tissu frais est plus doux et nécessite une manipulation plus prudent. Dans les deux préparations, en gardant le tissu humidifié lors de la dissection est important. Il n'est pas nécessaire d'effectuer la dissection de tissu frais dans une solution saline tamponnée, cependant, plongeant régulièrement le tissu dans une solution de Tyrode ou gouttes de la solution sur le tissu tout en disséquant est essentielle, car elle permet de conserver le tissu humidifié et en éléments nutritifs fournis pour maintenir sa vESPONSABILITE.

La procédure présentée ici peut encore être modifié pour inclure l'enlèvement des os qui laisse à la fois le cerveau et le nez intact dans un seul spécimen (figure 2B). Cette modification évite les connexions nerveuses entre le cerveau et le nez qui passent à travers la lame criblée. Plus d'habileté et de temps technique sont requises pour cette dissection que le nez seul. Toutefois, en préservant les connexions à partir de la périphérie vers le cerveau permet des applications plus diversifiées de ce procédé.

Limitations

Nous avons utilisé cette méthode pour préparer les tissus nasaux pour un certain nombre d'études, y compris marquage immunohistochimique et de l'ARNm dans l'analyse d'hybridation in situ, et avons appelé avec succès de nombreuses protéines dans les voies de signalisation, des marqueurs de cellules colorées dans différentes populations cellulaires, et a examiné les caractéristiques morphologiques et la distribution de cellules à travers la cavité nasale 16,17,36-39. Nous n'avons pas explimitations erience dans cryosectioning et immunomarquage. Pour les études qui nécessitent cryosectioning de la préparation prolongée qui empêche le cerveau et le tissu nasal relié en un seul exemplaire, nous recommandons d'utiliser la souris de moins de 4 mois que chez les souris âgées la lame criblée fragile peut créer des dommages aux tissus pendant la coupe. Toutefois, pour les tissus frais destinés aux enregistrements électrophysiologiques, les tissus médial entre cornets sont pas facilement accessibles dans la préparation de la monture ensemble. Enlèvement des petits morceaux de tissu ou de fractionnement dans des régions discrètes peut résoudre le problème. Parce électro-olfactogrammes classique se fait sur ​​la face médiale de l'endo-cornets 25,33,34, notre préparation de tissu peut permettre des enregistrements provenant d'autres régions avec peu de manipulation.

Applications au-delà immunohistochimie

De nombreuses applications de la procédure existent pour ceux qui ont maîtrisé la technique. Applicat possibleions comprennent des études de zone sur les tissus olfactive et respiratoire qui, à l'aide d'autres méthodes, ont été difficiles à obtenir intact et dans leur configuration anatomique originale. Applications existent également pour l'électrophysiologie en permettant simultanées multiples enregistrements sur entiers, des tissus frais. Certaines de ces applications, qui étaient difficiles à réaliser en utilisant des techniques existantes, sont rendues possibles par notre méthode de désossage. En outre, ce protocole peut également être adapté pour les études biochimiques, génomique, protéomique et qui nécessitent le prélèvement d'échantillons conformes à différentes régions pour la comparaison critique.

En résumé, nous avons développé une procédure rapide et fiable pour accéder tissus olfactive et respiratoire dans le nez de la souris en enlevant les os environnants. Cette méthode présente des avantages significatifs par rapport aux techniques couramment utilisées telles que la décalcification. En outre, notre méthode ne nécessite aucun traitement chimique, par conséquent, les tissus ne sont pas limités à une utilisation dans immunohistochemistexpériences Ry, mais aussi peut être applicable pour l'hybridation in situ et des études physiologiques. Ainsi, notre méthode est un moyen plus rapide, plus direct pour préparer le nez de la souris pour un traitement ultérieur. Nous prévoyons que notre méthode facilitera les études olfactives et respiratoires dans les régions nasales.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par des subventions de recherche (NIH / NIDCD 009269, 012831 et ARRA administratives supplément subventions des NIH) à Weihong Lin. Nous remercions tout particulièrement M. Tim Ford à UMBC pour son assistance technique dans l'enregistrement vidéo et le traitement. Nous tenons également à remercier le Dr Daphne Blumberg, Mme Chere Petty à UMBC et M. Nicholas McCollum d'Olympus America Inc. pour leur soutien matériel à l'enregistrement vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width World Precision Instruments (WPI) 501333
Fine forceps, Dumont 3 WPI 503235
Fine forceps, Dumont 55 WPI 14099
Fine forceps, Dumont AA Fine Science Tools (FST) 11210-20
Specimen forceps, Serrated VWR 82027-440
Operating scissors WPI 501753
Iris scissors, Straight Miltex V95-304
Dissection microscope Olympus SZ40
Name Company Catalog Number Comments
Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound Sakura Finetek 4583
Plastic embedding mold VWR 15160-215
Aspirator vacuum pump Fisher Scientific 09-960-2
Name Company Catalog Number Comments
Section staining
Neutral red ACROS Organic CAS 553-24-2 Nuclei staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
  2. Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
  3. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  4. Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. 2nd, Wiley-Liss. (2000).
  5. Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
  6. Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
  7. Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
  8. Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
  9. Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
  10. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
  11. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
  12. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
  13. Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
  14. Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
  15. Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
  16. Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
  17. Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
  18. Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
  19. Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
  20. Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
  21. Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
  22. Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
  23. Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
  24. Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
  25. Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
  26. Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
  27. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
  28. Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
  29. Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
  30. Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
  31. Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
  32. Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
  33. Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
  34. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
  35. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  36. Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
  37. Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
  38. Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
  39. Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).

Comments

1 Comment

  1. dear David dunston,
    I would appreciate to be able to visualize your dissection method.Thanking you by advance, best regards, Patricia Duchamp-Viret

    Reply
    Posted by: Patricia D.
    February 4, 2014 - 5:31 AM

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