Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Микромасштабные термофореза (MST) могут быть широко использованы для определения аффинности связывания без очистки целевого белка из клеточных лизатов. Протокол включает сверхэкспрессии GFP-слитый белок, лизис клеток в неденатурирующих условиях, и обнаружение MST сигнала в присутствии различных концентраций лиганда.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Количественная характеристика белковых взаимодействий необходимо практически в любой области наук о жизни, в частности лекарственных препаратов. Большинство доступных в настоящее время методы определения K D необходим доступ к очищенного белка, представляющего интерес, генерация которого может быть трудоемким и дорогим. Мы разработали протокол, который позволяет для определения аффинности связывания по микромасштабной термофореза (MST) без очистки целевого белка из клеточных лизатов. Способ включает гиперэкспрессией GFP-слитого белка и лизиса клеток в неденатурирующих условиях. Применение метода к STAT3-GFP временно экспрессированного в клетках НЕК293, позволил определить впервые сродство хорошо изученных фактора транскрипции олигонуклеотиды с различными последовательностями. Протокол является простым и может иметь различные применения для исследования взаимодействия белков с небольшой молекулы, пептиды, ДНК, РНК и рroteins.

Introduction

Количественная характеристика сродства межмолекулярных взаимодействий важно во многих областях биомедицинских исследований. Связывание константа диссоциации (K D) имеет важное значение не только в лекарственных препаратах, но также является важным параметром в характеристике любого парного взаимодействия в любой биологической системы. Биохимические методы, используемые для выявления белок-белковых взаимодействий, таких как дрожжи и иммунопреципитацией двугибридная экраны, не сообщите нам о том, как плотно те ​​взаимодействия, в то время как близость определяет, что данный комплекс существует в данных условиях в естественных условиях. В процессе лекарственных средств, обязательного анализа развития является одним из необходимых и часто наиболее трудоемких шагов. Наиболее часто используемые методы определения Уб включают поляризации флуоресценции, 1 поверхностного плазмонного резонанса (SPR) технологии, 2 связывания радиоактивного, 3 изотермических калориметрии титрования, 4 равновесиигм диализа (ЭД), 5 ультрафильтрации (UF), 5 и ультрацентрифугирования (UC). 6 Все они требуют значительных количеств очищенного белка-мишени. Микромасштабные термофореза (MST) является быстро развивающийся метод, обнаруживающий направленное движение молекул в микроскопической градиента температуры. Любые изменения гидратной оболочки биомолекул приводит к относительному изменению движение вдоль градиента температуры. 7 MST используется для определения аффинности связывания и был применен для исследования связывания лиганда с флуоресцентно меченых белков или флуоресцентных лигандов с белком-мишенью. 8, 9 MST позволяет измерять взаимодействие непосредственно в растворе без необходимости иммобилизации на поверхности (иммобилизации без технологии). Практически любое связывание сопровождается изменением MST сигнал, хотя размер изменение отличается от системы к системе значительно. Для обнаружения движения молекул по MST, они должны быть флуоресцируютNT. Это главное ограничение метода можно превратить в преимущество. Если белок экспрессируется как GFP синтеза в любой системе, это будет только флуоресцентные молекулы и, следовательно, могут быть изучены без выделения из клеточного лизата или бесклеточной системе экспрессии. Генерация клеточных лизатов, которые позволяют условия связывания с минимальными артефактами является серьезной проблемой. Здесь мы опишем протокол клеточного лизата подготовки и MST эксперимент, который может быть использован для различных растворимых и мембранных белков.

STAT белки скрыты цитоплазматическими факторами транскрипции активируется фосфорилирование тирозина в ответ на внеклеточные сигналы и участвуют во многих биологических процессах, включая иммунитет, кроветворение, воспаление и развитие. 10 У млекопитающих, STAT семья состоит из STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B и 6. Все активированные статы известно, связывается с той же самой последовательности ДНК, так называемого газового мотив, IFN-гамма активирован последовательности. Тем не менее, transcriptional последствия различные статистические данные очень разные. +11 несмотря на участие во многих патологических процессов и обширные исследования получая более 17000 изданий, Уб STAT взаимодействий с различными последовательностями ДНК не были определены. Только относительной близости различных статистику, чтобы варианты ГАЗ Мотив был охарактеризован. 11 Трудности в выражении и очистки белков являются основными препятствиями в характеристике ДНК STATs 'селективности связывания. Хотя большинство исследований были сосредоточены на роли "активированный" статистику, которая стала синонимом Тир-фосфорилированному транскрипционный фактор, роль нефосфорилированные STATs (U-STATs) в регуляции транскрипции быстро развивается. 12 Тем не менее, эти механизмы изучены плохо, и неясно, является ли U-STATs фактически связываются с ДНК или действовать через взаимодействие с другими факторами транскрипции. Недавно мы показали, что U-STAT3 может связываться с ДНК последовательномCES отличается от ГАЗ мотивы с еще более высоким сродством. +13 открытие имеет большое значение для нашего понимания биологических функций этого важного белка. Мы применили микромасштабной термофореза для определения относительного сродства STAT3 на газ и АТ-богатых олигонуклеотидных S +100 (рис. 4). Почти одинаковый протокол не был использован для определения K D для связывания различных STAT3 лиганд, липопептидный ингибитора. 14 Нет связывания связанных фактора транскрипции, GFP-STAT1, который был использован в качестве отрицательного контроля могут быть обнаружены таким образом подтверждая селективность взаимодействия. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление клеточных лизата

Этот протокол предназначен для прилипшие клетки, экспрессирующие GFP-любое слитого белка. Необходимое количество клеток может варьироваться от самого низкого показателя 10 6 до целых 20 х 10 6 клеток, в зависимости от уровня экспрессии белка. Например, лизат клеток НЕК гиперэкспрессией GFP-STAT3 получали обработкой клетки, выращенные в 10 колбах Т75 до около 70% слияния с 1 мл лизирующего буфера. Однако этот лизат был быть разбавлен в 150 раз, чтобы обеспечить оптимальный уровень флуоресценции для эксперимента MST. Протокол Лизис клеток сильно зависит от свойств и внутриклеточной локализации белка под следствием. При использовании моющих средств нежелательно, поскольку нестабильность белка, обработка ультразвуком, описанных ниже, может быть лучшим выбором. Различные добавки могут быть добавлены в буфере для лизиса, чтобы предотвратить реакции модификации белков: ЭДТА предотвращает фосфорилирование, ванадат натрия ингибирует тирозин-фосфатазы белка, таксреде фтора является ингибитором Ser / Thr фосфатазы.

  1. Подготовка буфера для лизиса. Для простого в извлекать цитоплазматических белков следующий состав хорошо работает: 25 мМ Трис-HCl, рН 8,0, и коктейль ингибитора протеазы разводили в 100 раз (Sigma-Aldrich P2714, состоящий из 2 мМ AEBSF, 0,3 мкМ апротинина, 130 мкМ бестатин, 1 мМ ЭДТА, 14 мкМ Е-64, 1 мкМ лейпептина). Кроме того, в менее растворимые белки, можно использовать коммерческие буфере RIPA с ингибиторами протеазы коктейль и неденатурирующем моющих средств. Держите буфера на льду.
  2. Вымойте клетки кратко ледяным PBS с использованием 10 мл буфера на T75 колбу. Хранить клетки на льду в течение 5 минут, или пока клетки начинают отделения от колбы. Очистите клеток с клеточным скребком, чтобы отделить в случае необходимости.
  3. Ресуспендируют клеток в 10 мл ледяной PBS и переносят в охлажденный 14 мл круглой трубы центрифуги дно.
  4. Гранул клетки центрифугированием при 400-600 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Объединение ячеек нескольких колб В этот момент яF необходимости.
  5. Удалить PBS супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл ледяного буфера для лизиса, передача подвески на предварительно охлажденным 1,5 мл пробирок Эппендорф.
  6. Держите клетки на льду, чтобы минимизировать локального перегрева. Клетки лизируют с 3-кратным 10 импульсов сек обработки ультразвуком при 30% амплитуды, используя 2-3 мм, предварительно охлажденный наконечник. Держите кончик ниже поверхности, чтобы минимизировать пенообразования. Пропустить этот шаг при использовании моющих средств содержащих буфера и инкубируют на льду в течение 30 мин вместо.
  7. Исправьте лизатом решения содержат физиологическую концентрацию соли (100 мМ NaCl), при необходимости с использованием 5 М NaCl.
  8. Сбор лизаты путем центрифугирования при 26000 об мкг при 4 ° С в течение 10 мин.
  9. Определение оптимального разведения лизата (как описано в разделе 3 ниже), и количество лизата необходимое для одного титрования (обычно около 300 мкл предварительно разбавленного лизата).
  10. Алиготе лизата и хранить при температуре, необходимой для белка под следствием (-80 ° С, в большинстве случаев).
  11. </ OL>

    2. MST Выбор буфера и подготовка

    1. Так как белок-лиганд, зависит от условий буфер, буфер МСТ композиция выбирается в зависимости от свойств конкретной системы. Обычно целесообразно проверить по крайней мере двух различных буферах.
    2. Подготовьте 2 5x буферов MST. У нас был хороший опыт работы с этими двумя композициями: HEPES (250 мМ HEPES, рН 7,4, 25 мМ MgCl 2, 500 мМ NaCl, 0,25% NP-40) и Трис-HCl (250 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 750 мм NaCl; 50 мМ MgCl2, 0,05% Твин-20). Добавление BSA (5% в конечной смеси для связывания) может помочь предотвратить адгезию белков в пластиковые пробирки и стеклянных капилляров. NaN 3 (0,5 мМ) также могут быть включены для предотвращения роста микроорганизмов.

    3. Определение оптимальных разбавления Lysate

    1. Выберите светодиодного источника возбуждения с длиной волны λ = 470 нм на приборе MST.
    2. Загрузите капилляров с СЕбудете извлекать разбавляют в 2 и 10 раз буфером MST.
    3. Выполните "Найти капилляры" операция на управление компьютерами инструмента MST. Оптимальный диапазон флуоресценции в разбавленном лизатом составляет от 400 до 1500 единиц флуоресценции.

    4. Определение оптимального диапазона концентраций лиганда

    1. Самые высокие концентрации лиганда должно быть не менее 20 раз выше, чем ожидаемое Константу диссоциации.
    2. Самые низкие концентрации лиганда должна быть ниже, чем молярная концентрация флуоресцентного белка.

    Обратитесь к концентрации NanoTemper технологий Finder инструмент для оценки диапазона концентрации лиганда.

    5. Подготовка клеточного лизата и разведения лиганда

    1. Положите трубку стойка с необходимого количества (обычно 10-16) 0,5 мл пробирок LoBind центрифуги на льду. Пипеткой 25 мкл буфера для MST в нижней части каждой трубы. Добавить 25 мкл раствора лиганда с первой ваннее (# 1, лиганд высокая концентрация) и выполнять серию двукратных разведений лиганда использованием остальной части трубы. Держите стойки с лиганда образцы на льду.
    2. Оттепели клеточного лизата медленно на льду.
    3. Развести клеточного лизата с буфером MST чтобы обеспечить оптимальный уровень флуоресцентного белка-мишени в реакции связывания. Конечной концентрации белка должно быть близким к ожидаемому Уб или ниже. Следует регулироваться для получения необходимого количества флуоресценции рассчитывает в конечном растворе. Для определения GFP-STAT3 концентрации в лизате, прибор был откалиброван с помощью флуоресцеина. Молярная концентрация GFP в лизате определяли, используя соотношение количества флуоресцеин и EGFP квантовые выходы, 0,85 и 0,61 соответственно. 15

    6. Микромасштабные Термофорез Исследования связывания

    1. Выберите светодиодного источника возбуждения с λ = 470 нм на приборе MST.
    2. Место 0,5 мл LoBind труб в тВБО стойку напротив труб с лиганда серийных образцов разбавления. Осторожно добавляют 15 мкл клеточного лизата в нижней части каждой трубы. Старайтесь не дотрагиваться до стенок трубы, чтобы избежать потери образцов.
    3. Добавьте 15 мкл образца лиганд с высокой концентрацией (№ 1) к соответствующей трубе № 1 с клеточного лизата. Хорошо перемешайте и изменить пипетки. Повторите этот шаг с остальной частью трубки, за исключением последнего, который не должен содержать лиганд.
    4. Добавьте 15 мкл буфера MST до последней трубки и хорошо перемешать.
    5. Заполните примерно 2/3 от первой капиллярной со связыванием смеси из трубы № 1, наклонить его для перемещения решение по направлению к центру, и поместить капиллярной на капиллярной лотка в положение № 1 (самое близкое положение к открытию лотка) . Повторите этот шаг с остальными капилляров. Концами капилляра можно подключить с воском для длительного эксперимента.
    6. Поместите лоток внутри прибора MST и закройте дверь прибора.
    7. Выполните "Найти капилляры"команды, чтобы прибор найти точное положение капилляров и измерение флуоресценции образцов.
    8. На основе интенсивности флуоресценции сигнале, отрегулируйте питание светодиодов (от 10-100%), чтобы привести его в 400-1,500 интервал единиц.
    9. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы выполнить термофореза эксперимента. Более ИК-мощность лазера может быть выбран для эксперимента, чтобы найти оптимальный температурный градиент для конкретной системы. Сбор данных от 2-3 работает по тому же набору капилляров чтобы обеспечить воспроизводимость результатов измерений. Это занимает 10-12 минут, чтобы выполнить один из 16 капилляров.

    7. Микромасштабные Термофорез Анализ данных

    1. Откройте программное обеспечение для анализа.
    2. Загрузите папку проекта. В появившемся просмотра выберите Run информация собрана в определенном ИК мощности лазера термофоретическая кривых. Существует возможность открытия всех термофоретическая следы собранные в различных условиях, таких как мощность ИК-лазер, светодиодный PАуэр, температура, концентрация и т.д.. сразу, а затем выбрать любой кривые для анализа их включения и выключения (нажмите на название эксперимента).
    3. В окне графика оценки точек, выберите ТФ или ТФ с Т-прыжок. Убедитесь, что синие и красные линии расположены правильно. Чтобы получить усредненные точки со стандартными отклонениями, выберите "Использовать Средний» или «Различают работает" для отдельных трасс.
    4. Для построения константа диссоциации нужным, выберите "Использовать Средний", введите и исправить меченого значения концентрации молекул (проверить "концентрации" квадрат в припадке меню окна), и установите кривую. Величина К D с его стандартного отклонения появляется в отдельном информации всплывающем окне. Для построения установите ее с помощью гнездовым способом, выберите "Средний", гнездовым способом, а затем строите кривую. EC 50 сродства с его значением стандартного отклонения показано в этом случае. Особенностью Уб или Хилл "Граница" также может быть использован при насыщениив связанном состоянии не достигнут.
    5. Сохраняем среднюю Подобрать данные в текстовый файл и передать в Excel.
    6. Участок F нормы (нормированной флуоресценции) настройки f нормы (разность нормированного флуоресценции при различных экспериментах, по сравнению) или фракцию связан (см. формулу ниже) в зависимости от немеченого (титрование) концентрации молекул.

    Фракцию Связанный (доля молекул в комплексе) = (Therm-(С) несвязанный) / (связанного несвязанного), где Therm (С) термофореза измерена концентрация С, несвязанный является ТФ в свободном состоянии (когда молекулы Не в комплексе), а граница термофореза для полностью связанном состоянии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Измерение сродства нефосфорилированные STAT3 связывание белка с олигонуклеотидов.

НЕК293 клетках, экспрессирующих STAT3-GFP были использованы в качестве источника флуоресцентно меченных STAT3 для связывания ДНК анализа. Клеточные лизаты получали с использованием RIPA буфере (20х10 6 клеток / мл). Для исследования связывания, лизаты разводили 150x MST с ДНК-связывающим буфером для обеспечения оптимального уровня флуоресцентного белка в реакции связывания (около 20 нМ). Нетрансфицированными HEK293 клетки были использованы для оценки фоновой флуоресценции, которая оказалась не поддающихся обнаружению даже в неразбавленном лизата. Однако фоновой флуоресценции может быть более значительным в других системах экспрессии и, таким образом, чтобы контролировать. Титрование серии состоящий из 11 связывания смеси и лизата образца без лиганда были подготовлены. Каждый образец содержал 15 мкл разбавленного лизата клеток и 15 мкл олигонуклеотидов растворы различных Концентратионами. Окончательный состав буфера включены 25 мМ HEPES, рН 7,2, 50 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl 2 и 0,025% NP-40. Измерения проводились в стандартных рассматриваться на капилляры Монолит NT.115 инструмента с использованием 50% ИК-мощность лазера и светодиодного источника возбуждения с λ = 470 нм при комнатной температуре. Связывание весьма напряженной олигонуклеотидов привело к существенным изменениям в STAT3 мобильности в градиент температуры (рис. 2). На фиг.3 термофоретическая сигнал график как функцию концентрации олигонуклеотидов. Каждая точка данных представляет собой среднее из трех измерений. Анализ NanoTemper 1.2.20 программное обеспечение было использовано в соответствии с данными, а также определить очевидной Уб значений. Кажущиеся константы диссоциации были 37,9 ± 1,0 мкм и 23,3 ± 0,6 мкм на газ и S +100, соответственно (рис. 4). Замена к G привели к резкому снижению сродства S +100 MUT № 1 (рис. 4), в то время как му+100 MUT важную S # 2 не показало заметных связывания тем самым подтвердив последовательность-селективном связывании STAT3 в S +100. Удивительно, S +100 последовательности выглядеть немного жесткие обязательные, чем газ в трех повторений измерений.

Рисунок 1
Рисунок 1. Общая схема эксперимента. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Необработанные данные термофореза создается для взаимодействия GFP-STAT3 с АТ-богатой олигонуклеотида. Разбавленный клеточного лизата containi нг 20 нМ GFP-STAT3 смешивали с увеличением количества двухцепочечной олигонуклеотида (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA), получая указанное концентрации лиганда. Данные были собраны на 50% мощности лазерного излучения и 100% светодиода.

Рисунок 3
Рисунок 3. Связывание кривой, полученной путем анализа NanoTemper 1.2.231 программного обеспечения. Нормализованной флуоресценции (горячая флуоресценция / начальный флуоресценции) представлено как функция концентрации олигонуклеотидов. Белок показывает увеличение флуоресценции в связанном сравнению с несвязанном состоянии. Данные установлены методом уравнения Хилла включено в программное обеспечение анализа NanoTemper.

0541fig4highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>
Рисунок 4. STAT3 связывания олигонуклеотидов с различными последовательностями. Микромасштабные термофореза обязательного измерения STAT3-GFP на газ (K D = 37,9 ± 1,0 мкм), S +100 (K D = 23,3 ± 0,6 мкм), S +100 мутант 1 (K = D 740 ± 21 мкм), а S +100 мутанта 2 (не обязательный). STAT3-GFP концентрацию поддерживали на уровне примерно 20 нМ, а концентрация олигонуклеотида варьировалась от 666 до 0,650 мкМ. Разница в нормированной флуоресценции [‰] отложено в виде функции концентрации олигонуклеотидов, а кривые установлены использованием метода Хилла программного обеспечения анализа NanoTemper. Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку измерений 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выражение и очистка белка является трудоемким и дорогостоящим шагом, который, однако, необходимы для определения K взаимодействий "D большинство используемых в настоящее время способом. Применение MST позволяет избежать очистки белка таким образом, значительно упрощая и ускоряя количественной характеристики взаимодействий. Она представляет особенно значительные преимущества в случае трудных для выразить и очистить белки, такие как мембранные белки и факторы транскрипции.

Основное ограничение и требования MST является возможность для экспрессии белка в виде слитого с зеленым флуоресцентным белком. Однако конструкции для выражения большинства GFP-слиты человека и мыши белков являются коммерчески доступными. GFP-слитые белки также широко используются для торговли и деградации исследования, и, следовательно, может служить "двойные обязанности" в сочетании с исследованиями MST.

В дополнение к отсутствие необходимости белок рurification, очень экономичным использованием всех реагентов и нечувствительность к небольшие изменения в буфере композиции, MST предлагает другие преимущества по сравнению с традиционными методами K D определений. В отличие от поверхностного плазмонного резонанса, MST основе экспериментов происходит менее чем за 2 часа, позволяет для определения Уб в широком диапазоне и не страдает от артефактов поверхности иммобилизации. Например, мы не смогли определить, Уб STAT3 для связывания олигонуклеотидов SPR, хотя мы вложили значительный объем средств на приобретение очищенной STAT3 белка. Уб взаимодействия была слишком высокой, что это часто бывает для транскрипционных факторов, и выпал из диапазона концентраций SPR эксперимента.

Калориметрии титрования работает только для взаимодействий, которые сопровождаются изменением энтальпии. Это ограничение исключает многих случаях. Между тем, изменения в термофоретическая мобильность, хотя действительно сильно отличаются от значений для диразличны х систем, происходят для подавляющего большинства взаимодействий. Одно из самых больших преимуществ MST, что он работает в различных буферов и допускает присутствие моющих средств, мицеллы, и бицелл в системе. Это свойство позволяет применять его для мембранных белков, которые практически невозможно исследовать с помощью других средств. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать вариаций в моющих и мицеллы содержания и состава во время титрования с лиганда.

Следует также иметь в виду при использовании клеточных экстрактов, что белок под исследования могут существовать в своем первоначальном виде, который часто комплексе с другими белками, нуклеиновыми кислотами и кофакторов. Таким образом, сродство связывания может отличаться от такового для выделенного белка не участвует в каких-либо сложных образований. Избыточная экспрессия часто позволяет титрование из взаимодействия партнеров оставляя большую часть молекулы белка в исследовании в не связанном состоянии. Это еще одна причина для попытки достижимве очень высокие уровни экспрессии GFP-слитый белок при трансфекции клеток. Других труднодоступных управляющего параметра посттрансляционные модификации, которые также могут добавить значительную неоднородность в систему. Дополнительное ограничение изучает связывания белков и малых молекул, которые присутствуют в клеточных лизатов в больших количествах или молекулы с широкой специфичностью и низкой аффинностью, которая может взаимодействовать с несколькими белками, присутствующими в лизате. Wienken, CJ и соавт. обнаружили, что Уб определяется MST в E. кишечной экстракт был более чем на порядок выше, чем в буфере для взаимодействия гамма-интерферона с антителами 9. Эффект, возможно, были частично за счет протеолиза с экстрактом не было ингибиторы протеазы. Малые молекулы связывания с сывороточным альбумином было также обнаружено изменение K D при взаимодействии исследований MST 9.

Эффективность добычи также может различаться для Differeнт белков в зависимости от внутриклеточной локализации и физико-химических свойств. Таким образом, было бы полезно попробовать несколько лизис клеток и условия экстракции белков. Для цитоплазматических белков, используя не моющие средства, просто ультразвука для разрушения клеток часто дает хорошие урожаи и данных. Между тем, мембранные белки требуют более обширной проверки условий экстракции с различными концентрациями и характера моющих средств, липидные мицеллы или бицеллы. Моющее средство содержание должно быть сведено к минимуму, чтобы избежать влияющих сродство.

Несмотря на перечисленные недостатки, мы обнаружили, MST исследований неочищенный GFP-слитые белки, очень удобно для количественного определения аффинности связывания для многих белков и лиганд типов. Существует никаких сомнений, что более широкое использование метода во многих лабораториях позволит дальнейшее расширение применения MST основе связывания с белками исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Содержание этой публикации, не обязательно отражают взгляды или политику Департамента здравоохранения и социальных служб, а также не упоминание о фирменных наименований, коммерческих продуктов или организаций не означает одобрения со стороны правительства США.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана Внутренние программы исследований NIH, Национальный институт рака, Центра по исследованию рака, соглашение о сотрудничестве между NCI исследований и Calidris терапии; Американского онкологического общества грант IRG 97-152-17 к а, и федеральные средства из Национальный институт рака, NIH, по контракту HHSN26120080001E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
  4. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  5. Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398-3953 (2010).
  6. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  7. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
  8. Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
  9. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
  10. Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
  11. Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
  12. Yang, J., Stark, G. R. Roles of unphosphorylated STATs in signaling. Cell Res. 18, 443-451 (2008).
  13. Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
  14. Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013).
  15. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics