Microscale Thermophoresis द्वारा बंधन आत्मीयता निर्धारण के प्रोटीन शुद्धीकरण मुक्त विधि

Biology

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Summary

Microscale thermophoresis (MST) व्यापक रूप से सेल lysates से लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि के बिना बंधन आत्मीयता के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल GFP-जुड़े प्रोटीन, गैर denaturing परिस्थितियों में सेल, और ligand के अलग सांद्रता की उपस्थिति में MST संकेत का पता लगाने की overexpression शामिल है.

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Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

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Abstract

प्रोटीन बातचीत के मात्रात्मक लक्षण वर्णन विशेष रूप से जीवन विज्ञान, दवाओं की खोज की व्यावहारिक रूप से किसी भी क्षेत्र में आवश्यक है. कश्मीर डी दृढ़ संकल्प के वर्तमान में उपलब्ध तरीकों का सबसे अधिक समय लेने वाली और महंगा हो सकता पीढ़ी जिनमें से ब्याज की प्रोटीन, शुद्ध करने के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है. हम सेल lysates से लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि के बिना microscale thermophoresis (MST) द्वारा बंधन आत्मीयता के निर्धारण के लिए अनुमति देता है एक प्रोटोकॉल विकसित किया है. विधि गैर denaturing परिस्थितियों में GFP जुड़े प्रोटीन और सेल की overexpression शामिल है. STAT3-GFP के लिए विधि के आवेदन क्षणिक पहली बार विभिन्न दृश्यों के साथ oligonucleotides के लिए अच्छी तरह से अध्ययन प्रतिलेखन कारक के आकर्षण के लिए निर्धारित करने के लिए अनुमति दी HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त किया. प्रोटोकॉल सरल है और छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, डीएनए, आरएनए के साथ प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवेदन की एक किस्म है सकते हैं, और पीroteins.

Introduction

Intermolecular बातचीत की आत्मीयता के मात्रात्मक लक्षण वर्णन जैव चिकित्सा अनुसंधान के कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है. बाइंडिंग लगातार कश्मीर (डी) हदबंदी न केवल दवाओं की खोज में आवश्यक है, लेकिन यह भी किसी भी जैविक प्रणाली में किसी भी बाइनरी बातचीत के लक्षण वर्णन में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. ऐसे immunoprecipitation और खमीर दो संकर स्क्रीन के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल जैव रासायनिक विधियों, आत्मीयता यह विशेष रूप से जटिल विवो में दी गई शर्तों के तहत मौजूद है परिभाषित करता है, जबकि तंग कैसे वे बातचीत कर रहे हैं, हम पर सूचित नहीं करते. दवा की खोज की प्रक्रिया में, बंधन परख विकास जरूरी है और अक्सर सबसे अधिक समय लेने वाली कदमों में से एक है. कश्मीर डी दृढ़ संकल्प का सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण, 1 सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) प्रौद्योगिकी, 2 radioligand बंधन, 3 इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति, 4 equilibri शामिलउम डायलिसिस (ईडी), 5 ultrafiltration (यूएफ), 5 और ultracentrifugation (यूसी). 6 उनमें से सभी लक्ष्य प्रोटीन शुद्ध के महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है. Microscale thermophoresis (MST) एक सूक्ष्म तापमान ढाल में अणुओं का निर्देशन किया आंदोलन का पता लगाता है कि एक तेजी से विकसित विधि है. तापमान ढाल के साथ आंदोलन के एक रिश्तेदार परिवर्तन में biomolecules के परिणाम की जलयोजन खोल के किसी भी बदल जाता है. 7 MST बाध्यकारी समानताएं निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और एक लक्ष्य प्रोटीन को fluorescently लेबल प्रोटीन या फ्लोरोसेंट ligands के लिए बाध्य ligand के अध्ययन के लिए लागू किया गया है. 8, 9 MST एक सतह को स्थिरीकरण की जरूरत है (स्थिरीकरण मुक्त प्रौद्योगिकी) के बिना सीधे समाधान में बातचीत की माप की अनुमति देता है. परिवर्तन का आकार काफी प्रणाली से व्यवस्था करने के लिए अलग है, हालांकि व्यावहारिक रूप से, किसी भी बंधन, MST संकेत में एक परिवर्तन के साथ है. MST द्वारा अणु गति का पता लगाने के लिए, वे प्रतिदीप्ति होना हैNT के. विधि का यह प्रमुख सीमा एक लाभ में तब्दील किया जा सकता है. एक प्रोटीन किसी भी प्रणाली में एक GFP संलयन के रूप में व्यक्त किया जाता है, यह केवल फ्लोरोसेंट अणु हो सकता है और इस प्रकार सेल lysate या सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली से अलगाव के बिना अध्ययन किया जा सकता है. न्यूनतम कलाकृतियों के साथ बंधन स्थितियों के लिए अनुमति देते हैं कि सेल lysates की पीढ़ी बड़ी चुनौती है. यहाँ हम कई घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सेल lysate तैयारी और टिकट प्रयोग के एक प्रोटोकॉल का वर्णन है.

स्टेट प्रोटीन कोशिकी संकेतों के जवाब में टाइरोसीन फास्फोरिलीकरण से सक्रिय साइटोप्लाज्मिक प्रतिलेखन कारक अव्यक्त रहे हैं और प्रतिरक्षा, hematopoiesis, सूजन, और विकास. स्तनधारियों में 10 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं में शामिल हैं, स्टेट परिवार स्टेट 1, 2, 3, 4 के होते हैं , 5A, 5 ब, और 6. सभी सक्रिय आँकड़े ही डीएनए अनुक्रम करने के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता है, ताकि गैस मूल भाव कहा जाता है, IFN-गामा अनुक्रम सक्रिय. हालांकि, transcriअलग आँकड़े के वैकल्पिक प्रभाव बहुत अलग हैं. 11 कई रोग प्रक्रियाओं और 17,000 प्रकाशनों से अधिक उपज व्यापक अध्ययन में शामिल होने के बावजूद, अलग डीएनए दृश्यों के साथ स्टेट बातचीत से कश्मीर डी निर्धारित नहीं किया गया है. गैस आकृति की वेरिएंट के लिए अलग आँकड़े के ही रिश्तेदार समानता होती है. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शोधन में 11 कठिनाइयाँ आँकड़े 'डीएनए बाध्यकारी चयनात्मकता के लक्षण वर्णन में प्रमुख बाधाओं रहे हैं. पढ़ाई के बहुमत Tyr-phosphorylated प्रतिलेखन कारक के पर्याय बन गया है जो "सक्रिय" आँकड़े,, प्रतिलेखन के नियमन में गैर phosphorylated आँकड़े (यू आँकड़े) की भूमिका की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है हालांकि तेजी से उभर रहा है. 12 हालांकि, इन तंत्र खराब समझ, और इसे यू आँकड़े वास्तव में डीएनए के लिए बाध्य या अन्य प्रतिलेखन कारकों के साथ बातचीत के माध्यम से कार्य स्पष्ट नहीं था कि कर रहे हैं. हमने हाल ही में यू STAT3 डीएनए sequen करने के लिए बाध्य कर सकते हैं कि पता चला हैयहां तक कि उच्च आत्मीयता के साथ गैस रूपांकनों से अलग CES. 13 निष्कर्ष इस महत्वपूर्ण प्रोटीन की जैविक कार्यों के बारे में हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. हम गैस STAT3 के रिश्तेदार समानताएं निर्धारित करने के लिए microscale thermophoresis लागू है और एटी युक्त oligonucleotide एस 100 (चित्रा 4) है. लगभग समान प्रोटोकॉल एक अलग STAT3 ligand, एक lipopeptide अवरोध के बंधन के लिए कश्मीर डी निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया है. 14 एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था कि एक संबंधित प्रतिलेखन कारक, GFP-STAT1 के लिए बाध्य नहीं है इस तरह की बातचीत के चयनात्मकता की पुष्टि का पता लगाया जा सकता है. 14

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Protocol

1. सेल lysate की तैयारी

इस प्रोटोकॉल किसी भी GFP-जुड़े प्रोटीन व्यक्त पक्षपाती कोशिकाओं के लिए करना है. जरूरत सेल नंबर प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है, के रूप में कम के रूप में कई के रूप में 20 x 10 6 कोशिकाओं से 6 के रूप में 10 से भिन्न हो सकती हैं. उदाहरण के लिए, HEK कोशिकाओं overexpressing GFP-STAT3 की lysate 1 मिलीलीटर lysis बफर के साथ 70% के पास confluency से 10 T75 बोतल में विकसित कोशिकाओं के इलाज से तैयार किया गया था. हालांकि, इस lysate MST प्रयोग के लिए प्रतिदीप्ति का इष्टतम स्तर प्रदान करने के लिए 150 गुना पतला किया जा सकता था. सेल प्रोटोकॉल जांच के तहत गुण और प्रोटीन के intracellular स्थानीयकरण पर दृढ़ता से निर्भर करता है. डिटर्जेंट का उपयोग कर रहा है, क्योंकि प्रोटीन अस्थिरता की अवांछनीय है, तो sonication के नीचे वर्णित है, सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है. विभिन्न additives के प्रोटीन संशोधन प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए lysis बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है: ईडीटीए फास्फोरिलीकरण रोकता है, सोडियम वैनेडेट इसलिए, टाइरोसीन प्रोटीन फास्फेटेजों रोकताdium फ्लोराइड सर्विसेज / Thr फास्फेटेजों के एक अवरोध करनेवाला है.

  1. Lysis बफर तैयार. आसान करने के लिए निकालने साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के लिए निम्नलिखित संरचना अच्छी तरह से काम करता है: 25 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, और protease अवरोध कॉकटेल 2 मिमी AEBSF, 0.3 माइक्रोन aprotinin, 130 माइक्रोन bestatin से मिलकर 100 गुना (सिग्मा Aldrich P2714, पतला 1 मिमी EDTA, 14 माइक्रोन ई 64, 1 माइक्रोन leupeptin). वैकल्पिक रूप से, कम घुलनशील प्रोटीन के लिए, एक protease inhibitors के कॉकटेल और गैर denaturing डिटर्जेंट के साथ वाणिज्यिक RIPA बफर का उपयोग कर सकते हैं. बर्फ पर बफर रखें.
  2. ठंडा पीबीएस T75 फ्लास्क प्रति बफर के 10 मिलीलीटर का उपयोग करने के साथ संक्षिप्त कोशिकाओं को धो लें. 5 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें, या जब तक कोशिकाओं कुप्पी से detaching शुरू. यदि आवश्यक हो तो अलग करने के लिए सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं परिमार्जन.
  3. 10 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस और एक prechilled 14 मिलीलीटर दौर नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण में कोशिकाओं Resuspend.
  4. 4 में 400-600 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं ° 5 मिनट के लिए सी. मैं इस बिंदु पर कई बोतल से कोशिकाओं का मिश्रणच की जरूरत है.
  5. बहुत ठंडा lysis बफर के 200 μl में पीबीएस सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें, एक पूर्व निलंबन के हस्तांतरण 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब ठंडा.
  6. स्थानीय overheating से कम करने के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें. पूर्व ठंडा टिप एक 2-3 मिमी का उपयोग कर 30% आयाम पर sonication के 3x 10 सेकंड दालों, साथ कोशिकाओं lyse. सतह के नीचे टिप झाग को कम से कम रखें. के बजाय 30 मिनट के लिए बर्फ पर डिटर्जेंट युक्त बफर और सेते का उपयोग करते समय यह कदम न आना.
  7. शारीरिक नमक एकाग्रता (100 मिमी NaCl) 5 एम NaCl का उपयोग कर यदि आवश्यक शामिल करने के लिए lysate समाधान सुधारें.
  8. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 26,000 के बारे में XG पर centrifugation द्वारा lysates लीजिए.
  9. इष्टतम lysate कमजोर पड़ने (नीचे के रूप में धारा 3 में वर्णित है) और एक अनुमापन (पूर्व पतला lysate के आम तौर पर लगभग 300 μl) के लिए आवश्यक lysate के राशि का निर्धारण करते हैं.
  10. जांच के तहत प्रोटीन (-80 डिग्री सेल्सियस, ज्यादातर मामलों में) के लिए उचित तापमान पर अशेष lysate और दुकान.
  11. </ राजभाषा>

    2. MST बफर चयन और तैयारी

    1. प्रोटीन ligand के बातचीत बफर की स्थिति पर निर्भर कर रहे हैं, MST बफर रचना एक विशेष प्रणाली के गुणों के आधार पर चुना जाता है. यह कम से कम दो अलग बफ़र्स परीक्षण करने के लिए आम तौर पर फायदेमंद है.
    2. 2 5x MST बफ़र्स तैयार. और Tris एचसीएल (250 मिमी Tris एचसीएल, 7.4 पीएच, 750 मिमी NaCl, 50 HEPES (; 25 मिमी 2 MgCl, 500 मिमी NaCl 0.25% एनपी 40 250 मिमी HEPES, 7.4 पीएच): हम इन दो रचनाओं के साथ अच्छा अनुभव था मिमी 2 MgCl, 0.05% बीच 20). बीएसए के जोड़ (अंतिम बाध्यकारी मिश्रण में 5%) प्लास्टिक की ट्यूब और कांच capillaries के लिए प्रोटीन की आसंजन को रोकने में मदद कर सकते हैं. नेन 3 (0.5 मिमी) भी सूक्ष्मजीवों के विकास को रोकने के लिए शामिल किया जा सकता है.

    3. इष्टतम Lysate कमजोर पड़ने का निर्धारण

    1. तरंग दैर्ध्य के साथ एलईडी उत्तेजना स्रोत का चयन λ MST साधन पर = 470 एनएम.
    2. CE के साथ केशिकाओं लोड2 पतला और टिकट बफर के साथ 10x निकालने देंगे.
    3. MST साधन का नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर "केशिकाओं खोजें" कार्रवाई करते हैं. पतला lysate में इष्टतम प्रतिदीप्ति रेंज 400 से 1,500 प्रतिदीप्ति इकाइयों से है.

    4. इष्टतम Ligand एकाग्रता सीमा का निर्धारण

    1. ligand के सर्वोच्च एकाग्रता उम्मीद लगातार पृथक्करण की तुलना में कम से कम 20x अधिक होना चाहिए.
    2. सबसे कम ligand एकाग्रता फ्लोरोसेंट प्रोटीन की दाढ़ एकाग्रता से कम होना चाहिए.

    Ligand एकाग्रता रेंज आकलन के लिए NanoTemper टेक्नोलॉजीज एकाग्रता खोजक उपकरण का संदर्भ लें.

    5. सेल lysate और Ligand Dilutions की तैयारी

    1. बर्फ पर 0.5 मिलीलीटर LoBind अपकेंद्रित्र ट्यूब की एक आवश्यक संख्या (आमतौर पर 10-16) के साथ एक ट्यूब रैक रखें. प्रत्येक ट्यूब के नीचे MST बफर के पिपेट 25 μl. पहला टब को ligand के शेयर समाधान के 25 μl जोड़ेंई (# 1, ligand के सर्वोच्च एकाग्रता) और ट्यूब के बाकी का उपयोग कर ligand के धारावाहिक दो गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं. बर्फ पर ligand के नमूनों के साथ रैक रखें.
    2. पिघलना सेल बर्फ पर धीरे lysate.
    3. बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन लक्ष्य का इष्टतम स्तर प्रदान करने के लिए MST बफर के साथ सेल lysate पतला. अंतिम प्रोटीन एकाग्रता उम्मीद कश्मीर डी या कम करने के लिए बंद हो जाना चाहिए. यह अंतिम समाधान में प्रतिदीप्ति गिनती की आवश्यक संख्या प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. Lysate में GFP STAT3 एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, साधन fluorescein की मदद से calibrated किया गया था. lysate में GFP की दाढ़ एकाग्रता क्रमशः fluorescein और EGFP क्वांटम पैदावार, 0.85 और 0.61 के अनुपात का उपयोग निर्धारित किया गया था. 15

    6. Microscale Thermophoresis बंधन अध्ययन

    1. MST साधन पर λ = 470 एनएम के साथ एलईडी उत्तेजना स्रोत का चयन करें.
    2. टी में जगह 0.5 मिलीलीटर LoBind ट्यूबोंligand के धारावाहिक कमजोर पड़ने के नमूनों के साथ ट्यूब से भर यूबे रैक. ध्यान से प्रत्येक ट्यूब के नीचे करने के लिए सेल lysate के 15 μl जोड़ें. नमूना नुकसान से बचने के लिए ट्यूब दीवारों को छूने की कोशिश नहीं की.
    3. सेल lysate साथ इसी ट्यूब को सर्वोच्च एकाग्रता (# 1) # 1 के साथ ligand के नमूने के 15 μl जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं और एक विंदुक टिप बदल जाते हैं. कोई ligand के शामिल करना चाहिए जो पिछले एक को छोड़कर ट्यूबों के आराम के साथ इस चरण को दोहराएँ.
    4. पिछले ट्यूब MST बफर के 15 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
    5. ट्यूब # 1 से बाध्यकारी मिश्रण के साथ लगभग 2/3 पहली केशिका से भरें, यह केंद्र की ओर समाधान स्थानांतरित करने के लिए झुकाव, और (ट्रे खोलने के लिए निकटतम स्थान) स्थिति # 1 से केशिका ट्रे पर केशिका जगह . बाकी केशिकाओं के साथ इस चरण को दोहराएँ. केशिका सिरों अब प्रयोगों के लिए मोम के साथ खामियों को दूर किया जा सकता है.
    6. MST साधन अंदर ट्रे प्लेस और साधन के दरवाजे बंद कर दें.
    7. "केशिकाओं खोजें" प्रदर्शन करनाआदेश साधन केशिकाओं की सटीक स्थिति पाते हैं और नमूने के प्रतिदीप्ति उपाय बताने के लिए.
    8. प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के आधार पर, 400-1,500 इकाइयों अंतराल में लाने के लिए एलईडी शक्ति (10-100% से) समायोजित करें.
    9. Thermophoresis प्रयोग करने के लिए "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करें. एक से अधिक आईआर लेजर शक्ति विशेष प्रणाली के लिए अधिकतम तापमान ढाल क्रम में प्रयोग के लिए चुना जा सकता है. माप के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए केशिकाओं का एक ही सेट के लिए 2-3 रन से डेटा ले लीजिए. यह 16 केशिकाओं का एक सेट चलाने के लिए 10-12 मिनट लगते हैं.

    7. Microscale Thermophoresis डेटा विश्लेषण

    1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें.
    2. परियोजना फ़ोल्डर लोड. छपी सूचना भागो व्यूअर में चयन के लिए एक विशिष्ट आईआर लेजर शक्ति thermophoretic घटता पर एकत्र. ऐसे आईआर लेजर शक्ति के रूप में विभिन्न परिस्थितियों में एकत्र सभी thermophoretic निशान खोलने का एक विकल्प है, पी एलईडीower है, तापमान, एकाग्रता, आदि. पर एक बार और फिर उन पर और बंद द्वारा विश्लेषण के लिए किसी भी घटता चुनने (प्रयोग के नाम पर क्लिक करें).
    3. मूल्यांकन अंक ग्राफ खिड़की में, टी छलांग के साथ thermophoresis या thermophoresis का चयन करें. नीले और लाल लाइनों को सही ढंग से तैनात हैं सुनिश्चित करें. मानक विचलन के साथ औसत अंक प्राप्त करने के लिए, चयन "औसत का उपयोग करें" या अलग रन के लिए "भेद चलता है".
    4. एक हदबंदी निरंतर फिट की साजिश करने के लिए, लेबल अणु एकाग्रता मूल्य (एक फिट खिड़की मेनू में "एकाग्रता" वर्ग की जांच) दर्ज करें और तय, "औसत का उपयोग करें" का चयन करें, और वक्र फिट. इसके मानक विचलन के साथ कश्मीर डी मूल्य एक अलग जानकारी पॉप अप विंडो में दिखाई देता है. हिल विधि का उपयोग कर एक फिट की साजिश करने के लिए, हिल विधि "औसत" का चयन करें, और तब वक्र फिट. इसके मानक विचलन के साथ चुनाव आयोग 50 आत्मीयता मूल्य इस मामले में दिखाया गया है. जब संतृप्ति कश्मीर डी या हिल "सीमा" की सुविधा का भी उपयोग किया जा सकता हैएक ही राज्य में पूरा नहीं हुआ है.
    5. एक पाठ फ़ाइल में औसत फिट डेटा सहेजें और एक्सेल के लिए स्थानांतरण.
    6. प्लॉट एफ आदर्श (सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति), ΔF आदर्श (विभिन्न प्रयोगों तुलना की जाती है तो सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति में अंतर), या अंश unlabeled (titrated) अणु एकाग्रता के एक समारोह के रूप में (नीचे सूत्र देखें) बंधे.

    अंश (एक परिसर में अणुओं का अंश) = (थेर्म (सी) अनबाउंड) / (बाध्य-अबाध), थेर्म (सी) एकाग्रता के लिए सी मापा thermophoresis है जहां बन्धे, अबाध (अणु होते हैं जब अबाध राज्य के लिए thermophoresis है नहीं एक जटिल में), और बाध्य पूरी तरह से बाध्य राज्य के लिए thermophoresis है.

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Representative Results

Oligonucleotides के लिए बाध्य गैर phosphorylated STAT3 प्रोटीन की आत्मीयता मापने.

STAT3-GFP व्यक्त HEK293 कोशिकाओं के डीएनए बाध्यकारी परख के लिए fluorescently लेबल STAT3 के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया. सेल lysates RIPA बफर (20x10 6 कोशिकाओं / एमएल) का उपयोग कर तैयार कर रहे थे. बंधन पढ़ाई के लिए, lysates बाध्यकारी प्रतिक्रिया (लगभग 20 एनएम) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इष्टतम स्तर प्रदान करने के लिए MST डीएनए बाध्यकारी बफर के साथ 150x पतला थे. गैर ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं भी गैर पतला lysate में गैर detectable हो जो निकला पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति अन्य अभिव्यक्ति प्रणाली में और अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है और इस प्रकार निरीक्षण किया जा रहा है. Ligand के बिना 11 बाध्यकारी मिश्रण और lysate नमूना से मिलकर अनुमापन श्रृंखला तैयार की गई है. प्रत्येक नमूना पतला सेल lysate के 15 μl और concentrat बदलती के oligonucleotides के समाधान के 15 μl निहितआयनों. 50 मिमी NaCl, 2.5 मिमी 2 MgCl, और 0.025% एनपी 40 अंतिम बफर रचना 25 मिमी HEPES, 7.2 पीएच शामिल थे. माप के परिवेश के तापमान पर λ = 470 एनएम के साथ आईआर लेजर शक्ति और एलईडी उत्तेजना स्रोत 50% का उपयोग केवल पत्थर का खंभा NT.115 साधन पर मानक इलाज केशिकाओं में ले जाया गया. उच्च आरोप oligonucleotides के बंधन तापमान ढाल में STAT3 गतिशीलता में महत्वपूर्ण परिवर्तन (चित्रा 2) में हुई. चित्रा 3 में, thermophoretic संकेत oligonucleotide एकाग्रता के एक समारोह के रूप में साजिश रची है. प्रत्येक डेटा बिंदु तीन माप का मतलब का प्रतिनिधित्व करता है. NanoTemper विश्लेषण 1.2.20 सॉफ्टवेयर डेटा फिट करने के लिए और स्पष्ट कश्मीर डी मूल्यों को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. स्पष्ट पृथक्करण स्थिरांक 37.9 थे ± 1.0 माइक्रोन और 23.3 ± क्रमशः गैस और एस 100, के लिए 0.6 माइक्रोन (चित्रा 4). एक करने वाली जी का प्रतिस्थापन, एस 100 mut # 1 (चित्रा 4) के संबंध में नाटकीय कमी के परिणामस्वरूप जबकि म्यूउग्रवादी एस 100 mut # 2 एस 100 को STAT3 का कोई detectable बाध्यकारी इस प्रकार की पुष्टि अनुक्रम चयनात्मक बंधन दिखाया. हैरानी की बात है, एस 100 दृश्यों तीन माप पुनरावृत्ति गैस की तुलना में थोड़ा तंग बंधन प्रदर्शित किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रयोग की समग्र योजना. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. एटी युक्त oligonucleotide साथ GFP-STAT3 की बातचीत के लिए उत्पन्न unprocessed thermophoresis डेटा. पतला सेल lysate containi एनजी 20 एनएम GFP-STAT3 ligand की निर्दिष्ट सांद्रता उपज डबल असहाय oligonucleotide की बढ़ती मात्रा (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) के साथ मिलाया गया था. डेटा 50% लेजर सत्ता में एकत्र की है और 100% का नेतृत्व कर रहे थे.

चित्रा 3
चित्रा 3. बंधन वक्र NanoTemper विश्लेषण 1.2.231 सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न की. प्रतिदीप्ति सामान्यीकृत (गर्म प्रारंभिक / प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्ति) oligonucleotide एकाग्रता के एक समारोह के रूप में साजिश रची है. प्रोटीन अनबाउंड राज्य की तुलना में समयबद्ध में प्रतिदीप्ति में वृद्धि का पता चलता है. डेटा NanoTemper विश्लेषण सॉफ्टवेयर में शामिल हिल समीकरण विधि का उपयोग करने लगे हैं.

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4 चित्रा. गैस STAT3-GFP के STAT3 विभिन्न दृश्यों के साथ oligonucleotides के लिए बाध्य. Microscale thermophoresis बाध्यकारी माप (कश्मीर डी = 37.9 ± 1.0 माइक्रोन), एस 100 (कश्मीर डी = 23.3 ± 0.6 माइक्रोन), एस 100 उत्परिवर्ती 1 (कश्मीर डी = 740 ± 21 माइक्रोन), और एस 100 उत्परिवर्ती 2 (कोई बंधन). STAT3-GFP एकाग्रता के बारे में 20 एनएम पर स्थिर रखा, और oligonucleotides के एकाग्रता 666 से 0.650 माइक्रोन से अलग किया गया था. सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति में अंतर [‰] oligonucleotide एकाग्रता के एक समारोह के रूप में साजिश रची है, और घटता NanoTemper विश्लेषण सॉफ्टवेयर के हिल विधि का उपयोग करने लगे हैं. त्रुटि सलाखों 3 माप की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं.

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Discussion

प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि, तथापि, सबसे वर्तमान में प्रयोग विधि से बातचीत 'कश्मीर डी के निर्धारण के लिए आवश्यक है जो एक कठिन और महंगा कदम है. टिकट के आवेदन काफी बातचीत की मात्रात्मक लक्षण वर्णन सरल बनाने और तेज कर इस प्रकार प्रोटीन शुद्धि से बचने की अनुमति देता है. यह ऐसी झिल्ली प्रोटीन और प्रतिलेखन कारक के रूप में मुश्किल को व्यक्त करने और शुद्ध प्रोटीन, के मामले में विशेष रूप से महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है.

टिकट की प्रमुख सीमा और आवश्यकता हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक संलयन के रूप में एक प्रोटीन व्यक्त करने की क्षमता है. हालांकि, GFP-जुड़े हुए मानव और माउस प्रोटीन का बहुमत की अभिव्यक्ति के लिए निर्माणों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. GFP-जुड़े प्रोटीन भी व्यापक रूप से तस्करी और गिरावट के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, और इस प्रकार MST अध्ययन के साथ संयोजन में 'डबल कर्तव्यों "सेवा कर सकते हैं.

प्रोटीन पी के लिए जरूरत की कमी के अलावाकश्मीर डी निर्धारण के पारंपरिक तरीकों की तुलना में जब सभी अभिकर्मकों और बफर रचनाओं में मामूली बदलाव करने की असंवेदनशीलता के urification, बहुत किफायती उपयोग, MST अन्य लाभ प्रदान करता है. सतह plasmon अनुनाद के विपरीत, MST आधारित प्रयोगों, कम से कम 2 घंटे ले व्यापक रेंज में कश्मीर डी के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं और सतह स्थिरीकरण कलाकृतियों से ग्रस्त नहीं है. हम STAT3 प्रोटीन शुद्ध की खरीद के लिए धन की महत्वपूर्ण राशि का निवेश किया है, हालांकि उदाहरण के लिए, हम, एसपीआर द्वारा oligonucleotides के लिए STAT3 बाइंडिंग के लिए कश्मीर डी निर्धारित नहीं कर सका. बातचीत से कश्मीर डी अक्सर प्रतिलेखन कारक के लिए मामला है, जो बहुत अधिक था, और एसपीआर प्रयोग की एकाग्रता सीमा से बाहर गिर गया.

अनुमापन उष्मामिति तापीय धारिता में परिवर्तन के साथ कर रहे हैं कि बातचीत के लिए ही काम करता है. इस कमी को कई मामलों शामिल नहीं है. इस बीच, thermophoretic गतिशीलता में परिवर्तन, डी के लिए मूल्यों में एक बहुत अलग है, हालांकिfferent प्रणाली, बातचीत का एक विशाल बहुमत के लिए होते हैं. MST का सबसे बड़ा लाभ यह है कि यह बफ़र्स की एक किस्म में काम करता है और डिटर्जेंट, मिसेलस, और इस प्रणाली में bicelles की मौजूदगी बर्दाश्त है. इस संपत्ति के अन्य तरीकों से अध्ययन करने के लिए व्यावहारिक रूप से असंभव है कि झिल्ली प्रोटीन के लिए इसे लागू करने की अनुमति देता है. हालांकि, सतर्कता ligand के साथ अनुमापन दौरान डिटर्जेंट और मिसेलस सामग्री और संरचना में बदलाव से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

अध्ययन के तहत प्रोटीन अक्सर अन्य प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, और सहकारकों साथ एक जटिल है, जो अपने मूल रूप में मौजूद हो सकता है कि सेल के अर्क का उपयोग करते समय यह भी ध्यान में रखा जाना चाहिए. इस प्रकार, बंधन संबंध किसी भी जटिल संरचनाओं में शामिल नहीं एक अलग प्रोटीन के लिए उस से अलग हो सकता है. Overexpression अक्सर गैर बाध्य राज्य में अध्ययन के तहत प्रोटीन के अणुओं की सबसे छोड़ने बातचीत भागीदारों बाहर titrating की अनुमति देता है. इस achie करने की कोशिश कर के लिए एक और कारण हैकोशिकाओं अभिकर्मक पर GFP-जुड़े प्रोटीन का बहुत ही उच्च स्तर अभिव्यक्ति लिया. अन्य मुश्किल से नियंत्रण पैरामीटर भी व्यवस्था करने के लिए महत्वपूर्ण विविधता जोड़ सकते हैं कि posttranslational संशोधनों है. अतिरिक्त सीमा प्रोटीन और व्यापक विशिष्टता और lysate में मौजूद कई प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकते हैं कि कम आत्मीयता के साथ बड़ी मात्रा में या अणुओं में सेल lysates में मौजूद हैं कि छोटे अणुओं के लिए बाध्य अध्ययन कर रहा है. Wienken, मुख्य न्यायाधीश, एट अल. कश्मीर डी ई. में MST द्वारा निर्धारित किया जाता है कि मिल गया है कोली निकालने एंटीबॉडी 9 के साथ इंटरफेरॉन गामा की बातचीत के लिए एक बफर की तुलना में अधिक परिमाण के एक आदेश से अधिक था. निकालने कोई inhibitors बुलाया था प्रभाव proteolysis के लिए आंशिक रूप से कारण हो सकता है. सीरम albumin के लिए बाध्य छोटे अणु भी MST 9 से बातचीत पढ़ाई में कश्मीर डी बदलने के लिए पाया गया था.

निकासी की प्रभावकारिता भी विभिन्न के लिए अलग कर सकते हैंइंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण और भौतिक रासायनिक गुणों के आधार पर NT के प्रोटीन. इस प्रकार, यह कई सेल और प्रोटीन निष्कर्षण शर्तों के प्रयास करने के लिए उपयोगी है. साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के लिए, कोई डिटर्जेंट का उपयोग कर, सेल विघटन के लिए सिर्फ अल्ट्रासाउंड अक्सर बहुत अच्छी पैदावार और डेटा उत्पादन करता है. इस बीच, झिल्ली प्रोटीन अलग सांद्रता और डिटर्जेंट, लिपिड मिसेलस, या bicelles की प्रकृति के साथ निकासी स्थितियों के और अधिक व्यापक प्रदर्शन की आवश्यकता होती है. डिटर्जेंट सामग्री बंधन संबंध को प्रभावित करने से बचने के लिए कम से कम रखा जाना है.

सूचीबद्ध सीमाओं के बावजूद, हम गैर शुद्ध GFP-जुड़े प्रोटीन का टिकट पढ़ाई कई प्रोटीन और ligand प्रकार के लिए बाध्यकारी समानताएं के quantitation के लिए बहुत सुविधाजनक हो पाया है. कई प्रयोगशालाओं में विधि का व्यापक उपयोग आगे MST आधारित प्रोटीन बाध्यकारी अध्ययन के आवेदन को विस्तृत बनाने की अनुमति होगी कि इसमें कोई शक नहीं है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित. इस प्रकाशन की सामग्री को जरूरी स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग के विचारों या नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और न ही व्यापार के नाम, वाणिज्यिक उत्पादों या संगठनों का जिक्र अमेरिकी सरकार द्वारा अनुमोदित है.

Acknowledgments

से तथा संघीय कोष, NCI और Calidris चिकित्सा विज्ञान के बीच सहयोगात्मक अनुसंधान समझौते, ओ.टी. के लिए अमेरिकन कैंसर सोसायटी अनुदान IRG 97-152-17 इस काम आंशिक रूप एनआईएच, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, कैंसर रिसर्च के लिए केंद्र के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया अनुबंध HHSN26120080001E तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, एनआईएच,.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

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