Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Biology

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Summary

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

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Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

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Abstract

Caracterização quantitativa das interações proteína é essencial em praticamente qualquer campo das ciências da vida, particularmente a descoberta da droga. A maioria dos métodos actualmente disponíveis de determinação de K D requerem acesso a proteína de interesse, a geração do qual pode ser demorado e caro purificada. Nós desenvolvemos um protocolo que permite a determinação da afinidade de ligação por termoforese microescala (MST) sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O método envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida e a lise das células em condições não desnaturantes. Aplicação do método para a STAT3-GFP expresso transitoriamente em células HEK293 permitem determinar, pela primeira vez que a afinidade do factor de transcrição bem estudado para oligonucleótidos com sequências diferentes. O protocolo é simples e pode ter uma variedade de aplicações para o estudo das interacções de proteínas com moléculas pequenas, péptidos, ADN, ARN, e proteins.

Introduction

Caracterização quantitativa da afinidade de interacções intermoleculares é importante em muitas áreas da investigação biomédica. Binding constante de dissociação (K D) é essencial não só na descoberta de drogas, mas também é um parâmetro importante na caracterização de qualquer interacção binário em qualquer sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para a detecção de interações proteína-proteína, tais como imunoprecipitação e fermento telas de dois híbridos, não nos informar sobre como apertada são essas interações, enquanto a afinidade define se este complexo particular, existe sob determinadas condições in vivo. No processo de descoberta de drogas, o desenvolvimento de ensaio de ligação é uma das mais necessárias e frequentes das etapas mais demoradas. Métodos mais comumente usados ​​de determinação K D incluem polarização de fluorescência, uma ressonância plasmon de superfície tecnologia (SPR), 2 ligação radioligante, 3 de calorimetria de titulação isotérmica, 4 equilibrihum diálise (ED), 5 de ultrafiltração (UF), 5 e ultracentrifugação (UC). 6 Todos eles requerem quantidades significativas de proteína alvo purificada. Termoforese microescala (MST) é um método rápido desenvolvimento que detecta o movimento dirigido de moléculas com um gradiente de temperatura microscópica. Quaisquer alterações da concha de hidratação de biomoléculas em resultado de uma mudança relativa do movimento ao longo do gradiente de temperatura. MST 7 é utilizado para determinar as afinidades de ligação e tem sido aplicado para estudar a ligação de proteínas marcadas com fluorescência ou ligandos fluorescentes ligando a uma proteína-alvo, 8. 9 MST permite a medição de interacções directamente em solução, sem a necessidade de imobilização de uma superfície (imobilização de tecnologia livre). Praticamente, qualquer ligação é acompanhada por uma mudança no sinal de MST, embora a dimensão da alteração varia de sistema para sistema significativamente. Para a detecção da molécula de movimento pelo MST, eles têm que ser fluorescênciant. Esta importante limitação do método pode ser transformado em uma vantagem. Se a proteína é expressa como uma fusão de GFP em qualquer sistema, que será a única molécula fluorescente e, assim, pode ser estudada, sem isolamento a partir do ligado de células ou sistema de expressão isento de células. Geração de lisados ​​de células que permitem a ligação com artefactos condições mínimas é o principal desafio. Aqui, nós descrevemos um protocolo de preparação da célula e ligado de experiência MST que pode ser usado para muitas proteínas solúveis e de membrana.

Proteínas STAT são latentes factores de transcrição activados por citoplasmáticos fosforilação da tirosina em resposta a sinais extracelulares e estão envolvidos em muitos processos biológicos, incluindo imunidade, hematopoiese, inflamação e desenvolvimento. 10 Nos mamíferos, a família STAT STAT consiste de 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B e 6. Todas as estatísticas são activados sabe ligar-se a mesma sequência de DNA, assim chamado padrão GÁS, IFN-gama ativada sequência. No entanto, a transcriptional efeitos de diferentes estatísticas são muito diferentes. 11 Apesar de envolvimento em muitos processos patológicos e estudos extensivos rendendo mais de 17.000 publicações, a K D de STAT interacções com diferentes sequências de ADN que não foram determinadas. Apenas a afinidade relativa dos diferentes estatísticas às variantes do motivo de gás foi caracterizada. 11 Dificuldades na expressão e purificação de proteínas são os principais impedimentos para a caracterização da selectividade de ligação do ADN estatísticas. Embora a maioria dos estudos têm-se centrado sobre o papel dos Stats "ativados", que se tornou sinônimo de fator de transcrição Tyr-fosforilada, o papel da não-fosforilada STATs (U-Stats) na regulação da transcrição está emergindo rapidamente. 12 No entanto, estes mecanismos são mal compreendidos, e não ficou claro se U-STATs realmente se ligar ao DNA ou agir através de interações com outros fatores de transcrição. Demonstrámos recentemente que a L-STAT3 pode ligar ao DNA sequencialmenteces diferentes motivos de gás com ainda maior afinidade 13. A descoberta tem implicações significativas para a nossa compreensão das funções biológicas desta importante proteína. Temos aplicado termoforese microescala para determinar as afinidades relativas de STAT3 ao gás e oligonucleótido rica em AT S 100 (Figura 4). Quase protocolo idêntico foi usado para a determinação de K D para a ligação de um ligando a STAT3 diferente, um inibidor de lipopéptido. 14 N a ligação de um factor de transcrição relacionadas, GFP-STAT1, que foi utilizado como um controlo negativo pode ser detectada confirmando assim a selectividade da interacção. 14

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Protocol

1. Preparação de lisado celular

Este protocolo destina-se a células aderentes que expressam qualquer proteína GFP fundida. O número de células necessário pode variar de tão baixo quanto 6 a 10 até 20 x 10 6 células, dependendo do nível de expressão da proteína. Por exemplo, lisado de células HEK-sobre-expressam GFP STAT3 foi preparado por tratamento de células crescidas em frascos T75 10 a cerca de 70% de confluência com 1 ml de tampão de lise. No entanto, este lisado teve de ser diluída 150 vezes para fornecer um nível óptimo de fluorescência para o experimento de MST. Protocolo de lise celular depende fortemente das propriedades e localização intracelular da proteína em estudo. Se o uso de detergentes é indesejável devido à instabilidade da proteína, sonicação descrito abaixo, pode ser a melhor escolha. Diferentes aditivos podem ser adicionados ao tampão de lise para evitar as reacções de modificação da proteína: EDTA evita a fosforilação, vanadato de sódio inibe a proteína tirosina fosfatases, de modofluoreto de sódio é um inibidor de Ser / Tre fosfatases.

  1. Preparar tampão de lise. For-a-extraem fáceis proteínas citoplasmáticas a composição seguinte funciona bem: 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, mistura de inibidores de protease e diluiu-se 100 vezes (P2714 Sigma-Aldrich, consistindo de AEBSF 2 mM, 0,3 uM de aprotinina, bestatina 130 | iM, EDTA 1 mM, 14 fiM de E-64, 1 mM leupeptina). Alternativamente, as proteínas solúveis menos, pode-se utilizar tampão RIPA comercial, com inibidores de protease e cocktail de detergentes não desnaturantes. Manter o tampão em gelo.
  2. Lave as células brevemente com PBS gelado utilizando 10 ml de tampão por frasco T75. Manter as células em gelo durante 5 minutos, ou até que as células começam a retirar do frasco. Raspe as células com raspador de células para retirar, se necessário.
  3. Ressuspender as células em 10 ml PBS gelado e transferir para um tubo de 14 ml prechilled centrífuga de fundo redondo.
  4. Células por centrifugação a 400-600 xg a 4 ° C durante 5 min. Combine as células de vários frascos, neste ponto if necessário.
  5. Remover PBS sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 ul de tampão de lise arrefecido com gelo, transferindo a suspensão para um pré arrefecida tubo Eppendorf de 1,5 ml.
  6. Manter as células em gelo para minimizar o sobreaquecimento local. Lisar as células com 3x 10 segundos pulsos de sonicação a 30% da amplitude, usando um 2-3 mm ponta pré-refrigerados. Mantenha a ponta abaixo da superfície para minimizar a formação de espuma. Omitir este passo quando se utiliza detergente contendo tampão e incubar em gelo durante 30 min em vez disso.
  7. Corrigir a solução lisado para conter a concentração de sal fisiológica (NaCl 100 mM), se necessário, utilizando-se 5 M de NaCl.
  8. Recolhe lisados ​​por centrifugação a cerca de 26.000 x g a 4 ° C durante 10 min.
  9. Determinar o lisado diluição óptima (tal como descrito na secção 3 a seguir) e da quantidade de lisado necessário para uma titulação (tipicamente cerca de 300 ul de lisado de pré-diluída).
  10. Alíquotas do ligado e armazenar a temperatura adequada para a proteína em estudo (-80 ° C, na maioria dos casos).
  11. </ Ol>

    2. Seleção tampão MST e Preparação

    1. Uma vez que as interacções proteína-ligando são dependentes de condições de tampão, a composição do tampão MST é escolhido com base nas propriedades de um sistema particular. É geralmente vantajoso para testar pelo menos dois buffers diferentes.
    2. Prepare dois buffers MST 5x. Tivemos boas experiências com estas duas composições: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM de NaCl, 0,25% de NP-40) e Tris-HCl (250 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 750 mM, 50 MgCl 2 mM, 0,05% de Tween-20). A adição de BSA (5% na mistura final vinculativa) pode ajudar a prevenir a adesão de proteínas para tubos de plástico e de vidro capilares. NaN 3 (0,5 mM), também podem ser incluídos para evitar o crescimento de microorganismos.

    3. Determinação da diluição óptima Lysate

    1. Seleccione a fonte de excitação de LED com comprimento de onda = 470 nm λ no instrumento MST.
    2. Carregar capilares com o cevai extrair diluído 2 e 10x com tampão MST.
    3. Execute "Encontre Capilares" Operação em software de controle de instrumento MST. A gama óptima de fluorescência em lisado é diluído entre 400 e 1500 unidades de fluorescência.

    4. Determinação da Gama óptima concentração de ligando

    1. A concentração mais elevada do ligando deveria ser pelo menos 20x maior que a constante de dissociação esperado.
    2. A menor concentração de ligando deve ser mais baixa do que a concentração molar da proteína fluorescente.

    Consulte a ferramenta Localizador Concentration Technologies NanoTemper para o ligante estimativa faixa de concentração.

    5. Preparação de lisado celular e as diluições do ligando

    1. Colocar uma armação de tubo com um número necessário (geralmente 10-16) de 0,5 ml em tubos de centrifugação LoBind gelo. Pipetar 25 ul de tampão de MST para a parte inferior de cada tubo. Adicionar 25 ul da solução de estoque de ligando para a primeira cubae (# 1, a concentração de ligando mais elevada) e efectuar a diluição em série de duas vezes do ligando utilizando o resto dos tubos. Mantenha o rack com amostras de ligante no gelo.
    2. Célula Thaw lisado lentamente no gelo.
    3. Diluir o lisado celular com tampão de MST para fornecer o nível óptimo da proteína alvo fluorescente nas reacções de ligação. Concentração final de proteína deve ser perto de esperada K D ou inferior. Deve ser ajustado para se obter o número necessário de contagens de fluorescência na solução final. Para a determinação da concentração de GFP-STAT3 no ligado, o instrumento foi calibrado com uma ajuda de fluoresceína. A concentração molar de GFP no ligado foi determinada utilizando a relação de fluoresceína e rendimentos quânticos de EGFP, 0,85 e 0,61, respectivamente, 15.

    6. Microescala termoforese Estudos Encadernação

    1. Selecione a fonte de excitação LED com λ = 470 nm sobre o instrumento MST.
    2. Colocar 0,5 ml tubos LoBind na tube prateleira em frente tubos com amostras de ligante de diluição em série. Adicionar cuidadosamente 15 mL do lisado de células para a parte inferior de cada tubo. Tente não tocar as paredes do tubo para evitar a perda de amostra.
    3. Adicionam-se 15 ul da amostra do ligando com a maior concentração (# 1) para o tubo correspondente # 1 com o ligado de células. Misture bem e mudar a ponta da pipeta. Repetir este passo com o resto dos tubos, excepto para a última, que deve conter nenhum ligando.
    4. Adicionar 15 ul de tampão de MST para o último tubo e misturar bem.
    5. Encha cerca de 2/3 do primeiro capilar com a mistura de ligação de tubo # 1, incliná-la para mover a solução para o centro, e colocar o tubo capilar sobre a bandeja capilar para a posição # 1 (na posição mais próxima da abertura da bandeja) . Repita este passo com o resto capilares. Extremidades capilares pode ser conectado com cera para experimentos mais longos.
    6. Coloque a bandeja dentro do instrumento MST e fechar a porta do instrumento.
    7. Execute "Encontre Capilares"de comando para permitir que o instrumento encontrar posições exactas dos capilares e medir a fluorescência das amostras.
    8. Com base na intensidade do sinal de fluorescência, ajustar o LED (10-100%) a fim de o intervalo de unidades 400-1,500.
    9. Clique no botão "Iniciar" para executar o experimento termoforese. Mais do que uma fonte de laser de infravermelho podem ser escolhidos para a experiência, a fim de encontrar o gradiente de temperatura óptima para o sistema particular. Recolha de dados 2-3 funcionamentos para o mesmo conjunto de capilares para assegurar a reprodutibilidade das medições. Leva 10-12 min para executar um conjunto de 16 capilares.

    7. Microescala termoforese Análise de Dados

    1. Abra o software de análise.
    2. Coloque a pasta do projeto. Nas Informações apareceu Run Visualizador selecionar coletadas em curvas específicas IR laser do poder thermophoretic. Existe uma opção de abrir todos os vestígios recolhidos thermophoretic sob várias condições, tais como a potência do laser IR, LED power, temperatura, concentração, etc. de uma vez e, em seguida, escolher todas as curvas para análise trocando-os dentro e fora (clique no nome do experimento).
    3. Na janela do gráfico de Pontos de Avaliação, selecione o termoforese ou termoforese com T-jump. Certifique-se de que as linhas azul e vermelha estão posicionados corretamente. Para obter os pontos médios com desvios-padrão, selecione "Usar Média" ou "Distinguir corre" para ensaios separados.
    4. Para traçar um ajuste constante de dissociação, selecione "Usar média", introduza e fixe o valor de concentração molécula marcada (marque a opção "concentração" quadrado em um menu de janela de ajuste) e ajustar a curva. O valor de K D com seu desvio padrão aparece em uma janela de informações pop-up separada. Para traçar um ajuste utilizando o método de Hill, escolha "Média", o método de Hill, e depois ajustar a curva. O valor de CE 50 de afinidade com o seu desvio padrão está representado neste caso. O recurso de K D ou Hill "fronteira" também pode ser utilizado quando a saturaçãonum estado de associação não será atingido.
    5. Salvar os dados médios caber em um arquivo de texto e transferir para o Excel.
    6. Lote F norma (fluorescência normalizado), Af norma (diferença na fluorescência normalizada se experiências diferentes são comparados), ou fracção ligada (ver a fórmula seguinte), como uma função do não marcado (titulada) a concentração molécula.

    Fracção ligada (fracção de moléculas num complexo) = (Therm (C)-desacoplado) / (limite-desacoplado), onde Therm (C) é termoforese medida para a concentração C, é desacoplado termoforese para o estado livre (quando as moléculas são não em um complexo), e é obrigado termoforese para o estado completamente amarrado.

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Representative Results

Medição da afinidade de ligação a oligonucleótidos STAT3 não fosforilada da proteína.

As células HEK293 que expressam STAT3-GFP foram usados ​​como uma fonte de STAT3 marcado por fluorescência para ensaio de ligação de DNA. Os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão RIPA (20x10 6 células / ml). Para estudos de ligação, os lisados ​​foram diluídos 150 vezes com MST tampão de ligação de ADN para fornecer o nível óptimo da proteína fluorescente na reacção de ligação (aproximadamente 20 nM). Não-transfectadas células HEK293 foram usadas para avaliar a fluorescência de fundo, que acabou por ser não-detectáveis ​​mesmo em lisado não diluído. No entanto, a fluorescência de fundo pode ser mais importante em outros sistemas de expressão e, portanto, tem de ser monitorizada. Titulação série que consiste em 11 amostras de misturas de ligação e o ligando ligado sem ter sido preparado. Cada amostra continha 15 ul de ligado celular diluído e 15 ul de soluções de diferentes oligonucleótidos concentratiões. Composição do tampão final incluiu 25 mM de HEPES, pH 7,2, NaCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, e 0,025% de NP-40. As medições foram feitas em capilares tratados padrão em Monolith NT.115 instrumento utilizando 50% de energia IR-laser e fonte de excitação LED com λ = 470 nm à temperatura ambiente. A ligação de oligonucleótidos altamente carregadas resultaram em mudanças significativas na mobilidade STAT3 no gradiente de temperatura (Figura 2). Na Figura 3, o sinal de thermophoretic é traçado como uma função da concentração de oligonucleótido. Cada ponto de dados representa a média de três medições. Software NanoTemper Análise 1.2.20 foi utilizada para ajustar os dados e determinar os valores aparentes K d. As constantes de dissociação aparentes foram de 37,9 ± 1,0 pM e 23,3 ± 0,6 mM para GAS e S 100, respectivamente (Figura 4). A substituição de A para G, resultou numa diminuição drástica na afinidade de mut S 100 # 1 (Figura 4), ​​enquanto mutante S 100 mut º 2 não mostrou detectável ligação confirmando, portanto, vinculativas seqüência seletivo de STAT3 para S 100. Surpreendentemente, as seqüências 100 S exibida um pouco mais apertado do que o gás de ligação em três repetições de medição.

Figura 1
Figura 1. Esquema geral do experimento. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 2
Figura 2. Termoforese dados não processados ​​gerados pela interação de GFP-STAT3 com AT-rich oligonucleotídeo. Célula diluído lysate containi ng 20 nM GFP-STAT3 foi misturado com quantidades crescentes de oligonucleido de cadeia dupla (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) rendendo as concentrações indicadas do ligante. Os dados foram coletados em 50% a potência do laser e 100% LED.

Figura 3
Figura 3. Curva de ligação gerado pelo software NanoTemper Análise 1.2.231. Normalizado fluorescência (fluorescência fluorescência inicial / quente) é representada graficamente como uma função da concentração de oligonucleótido. A proteína revela um aumento na fluorescência no limite em comparação com o estado desacoplado. Os dados são ajustados usando o método de equação de Hill incorporada no software de Análise NanoTemper.

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Figura 4. STAT3 medidas vinculativas para oligonucleotídeos com seqüências diferentes. Microescala termoforese ligação de STAT3-GFP para o gás (Kd = 37,9 ± 1,0 mM), S 100 (K D = 23,3 ± 0,6 mM), S 100 mutante 1 (K = D 740 ± 21 fiM), e S 2 100 mutante (nenhuma ligação). A concentração da STAT3-GFP foi mantido constante em cerca de 20 nM e a concentração de oligonucleótidos variou 666-0,650 uM. A diferença na fluorescência normalizada [‰] é representada graficamente como uma função da concentração de oligonucleótido, e as curvas são ajustados usando o método de Hill, do software de Análise NanoTemper. As barras de erro representam o erro padrão de três medições.

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Discussion

A expressão de proteínas e de purificação é um passo trabalhoso e caro, o que é, no entanto, necessárias para a determinação do K D 'interacções pelo método mais usado actualmente. Aplicação de MST permite evitar a purificação de proteínas, assim, simplificar e acelerar significativamente caracterização quantitativa de interacções. Ele apresenta vantagens particularmente importantes no caso de-a-expressam difíceis e purificar proteínas, tais como proteínas de membrana e os factores de transcrição.

O principal requisito de limitação e de MST é a capacidade de expressar uma proteína como uma fusão com a proteína verde fluorescente. No entanto, as construções para a expressão da maioria das proteínas humanas e de ratinho GFP-fundidos estão disponíveis comercialmente. Proteínas GFP-fundidos também são amplamente utilizados para o tráfico e estudos de degradação e, portanto, pode servir "deveres duplos" em combinação com estudos do MST.

Além disso a ausência de necessidade para a proteína purification, uso muito econômico de todos os reagentes e insensibilidade para com ligeiras variações em composições tampão, MST oferece outras vantagens em relação aos métodos tradicionais de determinações Kd. Ao contrário de ressonância de plasma de superfície, com base em experiências MST levar menos de 2 horas, para permitir a determinação do K D na gama mais ampla e não sofrem de artefactos de superfície de imobilização. Por exemplo, não foi possível determinar K D para STAT3 ligação para oligonucleotídeos por SPR, embora tenhamos investido quantidade significativa de fundos para a compra de STAT3 proteína purificada. K D da interação era muito alto, o que é frequentemente o caso de fatores de transcrição, e caiu fora da faixa de concentração de experiência SPR.

Calorimetria de titulação só funciona para as interações que são acompanhadas por mudanças na entalpia. Esta limitação exclui muitos casos. Enquanto isso, alterações na mobilidade thermophoretic, embora não diferem muito em valores para disistemas fferent, ocorrer por uma grande maioria das interações. Uma das maiores vantagens da MST é que funciona numa variedade de tampões e tolera a presença de detergentes, micelas, e bicelles no sistema. Esta propriedade permite aplicá-lo a proteínas de membrana que são praticamente impossível estudar por outros meios. No entanto, o cuidado deve ser usado para evitar as variações do teor em detergente e composição de micelas e durante a titulação com o ligando.

Deve também ser tido em conta quando se utiliza extractos de células que a proteína em estudo podem existir na sua forma nativa, o que é, frequentemente, um complexo com outras proteínas, ácidos nucleicos, e cofactores. Assim, a afinidade de ligação pode ser diferente do que para uma proteína isolada não envolvidos em quaisquer formações de complexos. Sobreexpressão frequentemente permite titulando os parceiros de interacção deixando a maioria das moléculas de proteína sob estudo no estado não-ligado. Esta é outra razão para tentar, para atingirve muito elevados níveis da proteína GFP fusionado expressão em células de transfecção. O outro parâmetro de difícil controle é modificações pós-tradução que podem também adicionar uma heterogeneidade significativa no sistema. Limitação adicional é estudar a ligação de proteínas e pequenas moléculas que estão presentes em lisados ​​celulares em grandes quantidades ou de moléculas com especificidade larga e baixa afinidade, que pode interagir com várias proteínas presentes no lisado. Wienken, CJ, et ai. descobriram que a K D determinado pelo MST em E. extracto coli foi mais do que uma ordem de grandeza superior em um tampão para a interacção do interferão gama com anticorpos 9. O efeito pode ter sido parcialmente devido à proteólise desde o extracto não tinha inibidores da protease. Pequenas ligação à albumina sérica molécula também foi encontrada para alterar K D em estudos interacções pelo MST 9.

A eficácia de extracção pode também diferir para difereproteínas nt, dependendo da localização intracelular e propriedades físico-químicas. Assim, é útil para experimentar vários lise celular e as condições de extração de proteínas. Para proteínas citoplasmáticas, sem uso de detergentes, apenas ultra-som para rompimento celular freqüentemente produz muito bons rendimentos e dados. Enquanto isso, as proteínas de membrana requerem mais extenso rastreio das condições de extracção, com diferentes concentrações e natureza dos detergentes, micelas lipídicas, ou bicelles. Detergente conteúdo tem que ser mantida no mínimo para evitar influenciar a afinidade de ligação.

Apesar das limitações mencionadas, descobrimos estudos MST de não-purificadas proteínas GFP fundida a ser muito conveniente para a quantificação da afinidade de ligação para proteínas e diversos tipos de ligandos. Não há dúvida de que a maior utilização do método em muitos laboratórios permitirá alargar ainda mais as aplicações de estudos de ligação de proteína à base de MST.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. O conteúdo desta publicação não reflecte necessariamente a posição nem as políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações não implica o endosso pelo governo dos EUA.

Acknowledgments

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Programa de Investigação intramuros do NIH, Instituto Nacional do Câncer, o Centro para Pesquisa do Câncer; Acordo Collaborative Research entre NCI e Calidris Therapeutics; American Cancer Society concessão IRG 97-152-17 de OT, e verbas federais a partir do National Cancer Institute, NIH, sob contrato HHSN26120080001E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

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References

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