Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Microscale thermophoresis (MST) kan ofta används för bestämning av bindningsaffinitet utan rening av målproteinet från cellysat. Protokollet involverar överuttryck av GFP-fuserade proteinet, cellys i icke-denaturerande betingelser, och detektion av MST-signal i närvaro av varierande koncentrationer av liganden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kvantitativ karakterisering av protein interaktioner är viktigt i nästan alla områden för biovetenskap, särskilt läkemedelsutveckling. De flesta närvarande tillgängliga metoder för Kd beslutsamhet kräver tillgång till renat protein av intresse, generation som kan vara tidskrävande och dyrt. Vi har utvecklat ett protokoll som möjliggör bestämning av bindningsaffinitet genom mikroskala thermophoresis (MST) utan rening av målproteinet från cellysat. Metoden involverar överuttryck av GFP-fusionsproteinet och cellys i icke-denaturerande betingelser. Tillämpning av metoden för att STAT3-GFP uttryckt transient i HEK293-celler tillåts att bestämma för första gången affiniteten för väl studerade transkriptionsfaktor till oligonukleotider med olika sekvenser. Protokollet är enkelt och kan ha en mängd av ansökan för att studera interaktioner mellan proteiner med små molekyler, peptider, DNA, RNA, och proteins.

Introduction

Kvantitativ bedömning av affinitet av intermolekylära interaktioner är viktigt inom många områden av biomedicinsk forskning. Bindande dissociationskonstant (Kd) är viktigt inte bara för läkemedelsutveckling, men är också en viktig parameter i karakterisering av alla binära interaktion i någon biologiskt system. Biokemiska metoder som används för detektion av protein-protein-interaktioner, såsom immunprecipitation och jäst två-hybrid skärmar, inte informerar oss om hur hårt är dessa interaktioner, medan samhörighet definierar om detta komplex existerar under givna betingelser in vivo. I forskningsprocessen är bindande analys utveckling en av de nödvändiga och ofta de mest tidskrävande steg. Vanligaste metoderna för Kd bestämning inkluderar fluorescenspolarisering, 1 ytplasmonresonans (SPR), 2 radioligandbindning, 3 isotermiska titrering kalorimetri, 4 jämviktsarbetslösheum dialys (ED), 5 ultrafiltrering (UF), 5 och ultracentrifiigering (UC). 6 Alla av dem kräver stora mängder renat målprotein. Mikroskala thermophoresis (MST) är en snabbt växande metod som detekterar riktad rörelse av molekyler i en mikroskopisk temperaturgradient. Eventuella förändringar av hydratiseringen skal av biomolekyler resulterar i en relativ förändring av rörelse längs temperaturgradienten. 7 MST används för att bestämma bindningsaffiniteter och har tillämpats för att studera ligandbindning till fluorescensmärkta proteiner eller fluorescerande ligander till ett målprotein. Åtta, 9 MST medger mätning av interaktioner direkt i lösning utan behov av immobilisering till en yta (immobilisering-fri teknik). Praktiskt, är någon bindande åtföljs av en förändring i MST-signal, även om storleken på förändringen skiljer sig från system till system betydligt. För detektering av molekylen rörelse av MST, måste de fluorescerarnt. Denna betydande begränsning av metoden kan vändas till en fördel. Om ett protein uttrycks som en GFP fusion i alla system, kommer det att vara den enda fluorescerande molekyl och sålunda kan studeras utan isolering från cellysatet eller cellfria expressionssystem. Generering av cellysater som möjliggör bindande villkor med minimala artefakter är den stora utmaningen. Här beskriver vi ett protokoll för cellysat förberedelse och MST experiment som kan användas för många lösliga proteiner och membranproteiner.

STAT-proteiner är latenta cytoplasmatiska transkriptionsfaktorer aktiveras av tyrosinfosforylering som svar på extracellulära signaler och är inblandade i många biologiska processer inklusive immunitet, blodbildningen, inflammation, och utveckling. 10 Hos däggdjur består STAT familjen STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B och 6. Alla aktiverade statistik är kända för att binda till samma DNA-sekvens, så kallade GAS motiv, IFN-gamma aktiverad sekvens. Men den transcririvilligt effekter av olika statistik är mycket olika. 11 Trots medverkan i många patologiska processer och omfattande undersökningar som ger över 17.000 publikationer, har K D i STAT interaktioner med olika DNA-sekvenser inte fastställts. Endast relativ affinitet för olika statistik på varianter av gas motiv har karakteriserats. 11 Svårigheter i protein expression och rening är de största hindren för karakterisering av statistik 'DNA-bindande selektivitet. Även om majoriteten av studier har fokuserat på rollen som "aktiverade" statistik, som blev synonymt med Tyr-fosforylerad transkriptionsfaktor, den roll som icke-fosforylerade Stats (U-statistik) i regleringen av transkription växer fram snabbt. 12 dock dessa mekanismer är dåligt kända, och det var oklart om U-Stats faktiskt binda till DNA eller agera genom interaktioner med andra transkriptionsfaktorer. Vi har nyligen visat att U-STAT3 kan binda till DNA SekvensenCES annorlunda GAS motiv med ännu högre affinitet. 13 Konstaterandet har viktiga implikationer för vår förståelse av de biologiska funktionerna hos denna viktiga protein. Vi har tillämpat mikroskala thermophoresis för att bestämma relativa affiniteterna hos STAT3 till GAS och AT-rik oligonukleotid S 100 (figur 4). Nästan identiska protokoll har använts för Kd bestämning för bindning av en annan STAT3 ligand, en lipopeptid inhibitor. 14 Ingen bindning till en närstående transkriptionsfaktor, GFP-STAT1 som användes som en negativ kontroll kunde detekteras vilket bekräftar selektivitet interaktion. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Framställning av Cell Lysate

Detta protokoll är avsedd för vidhäftande celler som uttrycker en GFP-fusionsprotein. Behövs cellantalet kan variera från så lite som 10 6 till så många som 20 x 10 6 celler, beroende på nivån av proteinuttryck. Till exempel var lysat av HEK-celler som överuttrycker GFP-STAT3 framställas genom behandling av celler odlade i 10 T75-kolvar till nära 70% konfluens med 1 ml lysbuffert. Detta hade dock lysat att spädas 150 gånger för att ge optimal nivå av fluorescens för MST experiment. Cellslys protokoll är starkt beroende av de egenskaper och intracellulär lokalisering av proteinet under utredning. Vid användning av detergenter är oönskade på grund av protein instabilitet, sonikering beskrivs nedan, skulle vara det bästa valet. Olika tillsatsmedel kan sättas till lysbuffert för att förhindra reaktioner proteinmodifiering: EDTA förhindrar fosforylering, inhiberar natriumvanadat tyrosin proteinfosfataser, såmedium fluor är en hämmare av Ser / Thr fosfataser.

  1. Förbered lysbuffert. För enkla att extrahera cytoplasmaproteiner följande sammansättning fungerar bra: 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, och proteasinhibitorcocktail spädas 100 gånger (Sigma-Aldrich P2714, bestående av 2 mM AEBSF, 0,3 ^ aprotinin, 130 iM bestatin, 1 mM EDTA, 14 | iM E-64, 1 | iM leupeptin). Alternativt, för mindre lösliga proteiner, kan man använda kommersiella RIPA-buffert med proteashämmare cocktail och icke-denaturerande detergenter. Hålla bufferten på is.
  2. Tvätta celler hastigt med iskall PBS med användning av 10 ml buffert per T75-flaska. Behåll cellerna på is i 5 min, eller till dess att cellerna börjar lossnar från kolven. Skrapa celler med cellskrapa att lossa om det behövs.
  3. Återsuspendera cellerna i 10 ml iskall PBS och överför till en förkyld 14 ml rundbottnad centrifugrör.
  4. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 400-600 x g vid 4 ° C under 5 min. Kombinera celler från flera kolvar på denna punkt if behövs.
  5. Avlägsna PBS supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 | il iskall lysbuffert, överför suspensionen till en i förväg kyld 1,5 ml Eppendorf-rör.
  6. Håll celler på is för att minimera lokal överhettning. Lyse celler med 3x 10 sek pulser av ultraljudsbehandling vid 30% amplitud, med en 2-3 mm pre-kylda dricks. Håll spetsen under ytan för att minimera skumning. Hoppa över detta steg när du använder detergentinnehållande buffert och inkubera på is i 30 minuter istället.
  7. Korrigera lysatlösningen att innehålla fysiologisk saltkoncentration (100 mM NaCl) vid behov med användning av 5 M NaCl.
  8. Samla lysaten genom centrifugering vid ca 26.000 x g vid 4 ° C under 10 min.
  9. Bestäm optimal lysate utspädning (enligt beskrivningen i avsnitt 3 nedan) och mängden av lysat behövs för en titrering (vanligtvis runt 300 pl förspädd lysat).
  10. Alikvotera lysatet och förvara vid temperatur som är lämplig för proteinet som analyseras (-80 ° C, i de flesta fall).
  11. </ Ol>

    2. MST Buffer Urval och beredning

    1. Eftersom protein-ligand-interaktioner är beroende av buffertbetingelser, är MST buffertkomposition valt baserat på egenskaperna hos ett visst system. Det är i allmänhet fördelaktigt att testa åtminstone två olika buffertar.
    2. Förbered 2 5x MST buffertar. Vi hade goda erfarenheter med dessa två sammansättningar: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM NaCl; 0,25% NP-40) och Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 0,05% Tween-20). Tillsats av BSA (5% i den slutliga bindande blandning) kan hjälpa till att förhindra adhesion av proteiner till plaströr och glas kapillärer. NaN3 (0,5 mM) kan också inkluderas för att förhindra tillväxt av mikroorganismer.

    Tre. Bestämning av Optimal Lysate Spädning

    1. Välj LED exciteringskällan med våglängden λ = 470 nm på MST instrumentet.
    2. Ladda kapillärer med cell extrahera spädas 2 och 10x med MST-buffert.
    3. Utför "Hitta kapillärer" operation på Control Software för MST instrument. Den optimala fluorescens utbud i utspätt lysat är från 400 till 1.500 fluorescensenheter.

    4. Fastställande av Optimal ligandkoncentration Range

    1. Den högsta koncentrationen av liganden bör vara minst 20x högre än den förväntade dissociationskonstanten.
    2. Den lägsta ligandkoncentration ska vara lägre än molära koncentrationen av det fluorescerande proteinet.

    Se till NanoTemper Technologies Koncentration Finder verktyg för ligandkoncentrationen avståndsbedömning.

    Fem. Framställning av Cell Lysate och utspädningar ligand

    1. Placera ett rör rack med en välbehövlig antal (vanligen 10-16) med 0,5 ml rör LoBind centrifugrör på is. Pipettera 25 | il av MST buffert till botten av varje rör. Tillsätt 25 | il av liganden stamlösning till den första tube (# 1, ligand högsta koncentrationen) och utför seriell två-faldig utspädning av liganden med hjälp av resten av rören. Håll rack med ligand prover på is.
    2. Tina cellysatet långsamt på is.
    3. Späd cellysat med MST-buffert för att ge den optimala nivån för det fluorescerande målprotein i bindningsreaktionerna. Slutlig protein koncentrationen bör ligga nära förväntade K D eller lägre. Det bör justeras för att erhålla erforderligt antal fluorescens räknas i den slutliga lösningen. För bestämning av GFP-STAT3 koncentration i lysatet, var instrumentet kalibreras med en hjälp av fluorescein. Den molära koncentrationen av GFP i lysatet bestämdes med användning av förhållandet av fluorescein och EGFP kvantumutbyten, 0,85 och 0,61 respektive. 15

    6. Mikroskala Thermophoresis bindningsstudier

    1. Välj LED exciteringskällan med λ = 470 nm på MST instrumentet.
    2. Placera 0,5 ml LoBind rören i tube rack mittemot tuber med ligand serieutspädning prover. Tillsätt försiktigt 15 ul av cellysatet till botten av varje rör. Försök att inte röra rörväggar att undvika provförlust.
    3. Tillsätt 15 | il av liganden provet med den högsta koncentrationen (# 1) till motsvarande rör nr 1 med cellysatet. Blanda väl och ändra en pipettspets. Upprepa detta steg med resten av rören utom den sista, som bör innehålla någon ligand.
    4. Tillsätt 15 pl av MST buffert till det sista röret och blanda väl.
    5. Fyll ca 2/3 av den första kapillären med den bindande blandningen från tuben # 1, luta den för att flytta lösningen mot centrum, och placera kapillären på kapillära magasinet till positionen # 1 (den närmaste positionen till facket öppning) . Upprepa detta steg med resten kapillärerna. Kapillära ändar kan pluggas med vax för längre experiment.
    6. Placera facket inuti MST instrumentet och stäng instrumentets dörren.
    7. Utför "Hitta kapillärer"kommando för att låta instrumentet hitta exakta positioner kapillärerna och mäta fluorescens av proverna.
    8. Baserat på den fluorescens signalen intensitet, justera LED-ström (från 10-100%) för att anpassa den till 400-1,500 enheter intervall.
    9. Klicka på "Start"-knappen för att utföra thermophoresis experimentet. Mer än en IR-lasereffekten kan väljas för experimentet för att finna den optimala temperaturgradienten för det särskilda systemet. Samla in data 2-3 körningar för samma uppsättning av kapillärer för att säkerställa reproducerbarhet mätningar. Det tar 10-12 minuter för att köra en uppsättning av 16 kapillärer.

    7. Microscale Thermophoresis Dataanalys

    1. Öppna analysprogram.
    2. Ladda projektet mappen. I den dök Information Run Viewer välja samlas vid en specifik IR laser power thermophoretic kurvor. Det finns en möjlighet att öppna alla thermophoretic spår som samlats in under olika förhållanden såsom IR laser makt, LED power, temperatur, koncentration etc. på en gång och sedan välja några kurvor för analys genom att byta på och av dem (klicka på experimentets namn).
    3. I utvärderingen pekas grafen fönstret väljer thermophoresis eller thermophoresis med T-jump. Se till att blå och röda linjer är korrekt placerade. För att få de genomsnittliga poäng med standardavvikelser, välj "Använd Average" eller "Skilj kör" för separata körningar.
    4. För att rita en dissociationskonstant passform, välj "Använd Average", skriv in och fixa det märkta värdet molekylen koncentration (kolla "koncentration" fyrkant i ett anfall fönster meny), och montera kurvan. K D-värde med dess standardavvikelse visas i en separat information som pop-up fönster. För att rita en passning med Hill metod, välj "Average", Hill metoden, och sedan montera kurvan. EG 50 affinitet värde med dess standardavvikelse visas i det här fallet. Utmärkande för Kd eller Hill "border" kan också användas vid mättnadi ett bundet tillstånd inte uppnås.
    5. Spara den genomsnittliga passform data i en textfil och överföra till Excel.
    6. Plot F norm (normaliserad fluorescens), AF norm (skillnad i normaliserad fluorescens om olika experiment jämförs), eller fraktion bunden (se formel nedan) som en funktion av den omärkta (titreras) molekyl koncentration.

    Fraktion Bound (fraktion av molekyler i en komplex) = (Therm (C)-obundet) / (bunden-obundet), där Therm (C) är thermophoresis uppmättes för koncentrationen C, är obunden thermophoresis för den obundna tillståndet (när molekylerna är inte i en komplex), och bundna är thermophoresis för helt bundna tillståndet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mätning av affiniteten av icke-fosforylerat STAT3 protein bindning till oligonukleotider.

HEK293-celler som uttrycker STAT3-GFP användes som en källa för fluorescensmärkt STAT3 för DNA-bindningsanalysen. Cellysat framställdes med användning av RIPA-buffert (20x10 6 celler / ml). För bindningsstudier, lysaten späddes 150x med MST DNA-bindningsbuffert för att ge den optimala nivån för det fluorescerande proteinet i bindningsreaktionen (ca 20 nM). Icke-transfekterade HEK293-celler har använts för att utvärdera bakgrundsfluorescens, som visade sig vara icke-detekterbar även i icke-utspätt lysat. Däremot kan bakgrundsfluorescens vara mer betydelse i andra expressionssystem och måste därför övervakas. Titrering serie bestående av 11 bindande blandningar och lysat prov utan liganden har upprättats. Varje prov innehöll 15 pl av utspätt cellysat och 15 | il av oligonukleotider lösningar av varierande koncentreratjoner. Slutlig buffert Kompositionen inkluderade 25 mM HEPES, pH 7,2, 50 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, och 0,025% NP-40. Mätningarna utfördes i standarden behandlas kapillärer på Monolith NT.115 instrumentet med 50% IR-laser makt och LED exciteringskälla med λ = 470 nm vid rumstemperatur. Bindning av starkt laddade oligonukleotider resulterade i betydande förändringar i STAT3 rörlighet i temperaturgradient (Figur 2). I figur 3, är thermophoretic signalen plottad som en funktion av oligonukleotid koncentration. Varje datapunkt representerar medelvärdet av tre mätningar. NanoTemper Analys 1.2.20 mjukvara användes för att passa data och att bestämma de uppenbart Kd-värden. De skenbara dissociationskonstanter var 37,9 ± 1,0 nM och 23,3 ± 0,6 um för gas och S 100, respektive (Figur 4). Substitution av A-till-G resulterade i dramatisk minskning av affiniteten av S 100 mut # 1 (figur 4), medan mutigt S +100 mut # 2 visade ingen detekterbar bindning vilket bekräftar sekvens-selektiv bindning av STAT3 till S 100. Överraskande, S 100 sekvenser visas något hårdare bindning än gas i tre mätningar upprepningar.

Figur 1
Figur 1. Övergripande system av försöket. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Obearbetade thermophoresis data som genereras för interaktionen av GFP-STAT3 med AT-rika oligonukleotiden. Utspädd cellysat containi ng 20 nM GFP-STAT3 blandades med ökande mängder av dubbelsträngad oligonukleotid (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) vilket gav de angivna koncentrationerna av liganden. Uppgifterna samlades in vid 50% laser makt och 100% LED.

Figur 3
Figur 3. Bindning kurva som genereras av NanoTemper Analys 1.2.231 programvara. Normaliserad fluorescens (varm fluorescens / initial fluorescens) plottas som en funktion av oligonukleotid koncentration. Proteinet visar en ökning i fluorescens i den bundna jämfört med det obundna tillståndet. Uppgifterna är utrustade med Hill ekvationen metoden införlivas i NanoTemper analysprogram.

0541fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>
Figur 4. STAT3 bindning till oligonukleotider med olika sekvenser. Mikroskala thermophoresis bindande mätningar av STAT3-GFP till gas (K D = 37,9 ± 1,0 nM), S 100 (K D = 23,3 ± 0,6 um), S 100 mutant 1 (K D = 740 ± 21 pM), och S 100 mutant 2 (ingen bindning). Den STAT3-GFP koncentrationen hölls konstant vid ca 20 nM, och koncentrationen av oligonukleotider varierade från 666 till 0,650 | iM. Skillnaden i normaliserade fluorescens [‰] plottas som en funktion av oligonukleotid koncentration och kurvor är monterade med hjälp av Hill metoden enligt NanoTemper analysprogram. Felstaplar representerar standardavvikelsen för 3 mätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Proteinexpression och rening är ett mödosamt och dyrt steg, vilket är dock nödvändigt för fastställande av interaktioner "K D av mest använda metoden. Tillämpning av MST tillåter undvika proteinupprening därmed väsentligt förenkla och påskynda kvantitativ karaktärisering av interaktioner. Den presenterar särskilt betydande fördelar när det gäller svåra att uttrycka och rena proteiner såsom membranproteiner och transkriptionsfaktorer.

Den största begränsningen och krav på MST är förmågan att uttrycka ett protein som en fusion med grönt fluorescerande protein. Emellertid konstruktionerna för uttryck av majoriteten av GFP smält-humana och mus-proteiner är kommersiellt tillgängliga. GFP-fusionerade proteiner är också allmänt används för människohandel och studier nedbrytning, och därmed kan tjäna "dubbla uppdrag" i kombination med MST studier.

Förutom bristande behov av protein purification, mycket sparsam användning av alla reagenser och okänslighet för små variationer i buffert kompositioner, erbjuder MST andra fördelar jämfört med traditionella metoder för Kd bestämningar. Till skillnad ytplasmonresonans, MST-baserade experiment tar mindre än 2 tim, möjliggöra bestämning av Kd i bredare sortiment och inte lider av artefakter ytan immobilisering. Till exempel kan vi inte avgöra K D för STAT3 bindning till oligonukleotider genom SPR, även om vi har investerat betydande belopp för inköp av renat STAT3 protein. K D i interaktionen var för hög, vilket ofta är fallet för transkriptionsfaktorer, och föll ut ur SPR experiment koncentration sortiment.

Titrering kalorimetri fungerar endast för interaktioner som åtföljs av förändringar i entalpi. Denna begränsning utesluter många fall. Samtidigt förändringar i thermophoretic rörlighet, men skiljer sig en hel del i värden för different system förekommer för en stor majoritet av interaktioner. En av de största fördelarna med MST är att det fungerar i en mängd olika buffertar och tolererar närvaro av detergenter, miceller, och bicelles i systemet. Denna egenskap gör det möjligt att tillämpa den på membranproteiner som är praktiskt taget omöjligt att studera på annat sätt. Emellertid måste försiktighet iakttas för att undvika variationer i detergent och miceller innehåll och kompositionen under titrering med liganden.

Det bör också hållas i åtanke när du använder cellextrakt att proteinet som studeras kan existera i sin naturliga form, vilket ofta är ett komplex med andra proteiner, nukleinsyror och kofaktörer. Sålunda kan bindningsaffinitet skilja sig från den för ett isolerat protein inte involverad i någon komplexa formationer. Överuttryck tillåter ofta titrera ut interaktionspartner som lämnar de flesta av molekylerna av proteinet som skall studeras i icke-bundet tillstånd. Detta är ytterligare ett skäl för att försöka till achieve mycket höga uttryck nivåer av GFP-fusionsproteinet på celler transfektion. Den andra svåra att styrparametern är posttranslationella modifieringar som också kan tillföra väsentligt heterogenitet till systemet. Ytterligare begränsning studerar bindning till proteiner och små molekyler som är närvarande i cellysat i stora mängder eller molekyler med bred specificitet och låg affinitet som kan interagera med flera proteiner närvarande i lysatet. Wienken, CJ, et al. har funnit att K D bestäms av MST i E. coli extrakt var mer än en storleksordning högre än i en buffert för interaktionen av interferon-gamma med antikroppar 9. Effekten kan ha varit delvis beror på proteolys eftersom extraktet hade inga proteasinhibitorer. Liten molekyl bindning till serumalbumin konstaterades också att ändra K D i samspel studier av MST 9.

Effekten av extraktion kan också vara olika för different proteiner beroende på intracellulär lokalisering och fysikalisk-kemiska egenskaper. Därför är det bra att prova flera cellysering och protein villkor extraktion. För cytoplasmaproteiner, använder inga rengöringsmedel, producerar bara ultraljud för cell störningar ofta mycket goda utbyten och data. Samtidigt membranproteiner kräver mer omfattande screening av extraktionsbetingelser med varierande koncentrationer och natur av tvättmedel, miceller lipid eller bicelles. Tvättmedel innehåll måste hållas till ett minimum för att undvika att påverka bindningsaffinitet.

Trots de angivna begränsningarna, har vi funnit MST studier av icke-renade GFP-fuserade proteiner för att vara mycket bekvämt för kvantifiering av bindningsaffiniteter för många proteiner och typer ligand. Det råder ingen tvekan om att en bredare användning av metoden i många laboratorier kommer att möjliggöra ytterligare bredda tillämpningarna av MST-baserade proteinbindningsstudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis de åsikter eller politik Department of Health och Human Services, inte heller nämner handelsnamn, kommersiella produkter, eller organisationer antyder stöd av den amerikanska regeringen.

Acknowledgments

Detta arbete har delvis stöd av Interna forskningsprogram av NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research, Collaborative Research Avtal mellan NCI och Calidris Therapeutics, American Cancer Society bidrag IRG 97-152-17 till OT, och federala medel från National Cancer Institute, NIH, enligt avtal HHSN26120080001E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
  4. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  5. Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398-3953 (2010).
  6. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  7. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
  8. Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
  9. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
  10. Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
  11. Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
  12. Yang, J., Stark, G. R. Roles of unphosphorylated STATs in signaling. Cell Res. 18, 443-451 (2008).
  13. Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
  14. Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013).
  15. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics