Protein Rensing-fri metode for Binding Affinity Fastsettelse av mikroskala Thermophoresis

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mikroskala Thermophoresis (MST) kan bli mye brukt til fastsettelse av bindende affinitet uten rensing av målet protein fra cellelysater. Protokollen omfatter overekspresjon av GFP-sammensmeltet protein, cellelyse i ikke-denaturerende betingelser, og påvisning av MST-signal i nærvær av varierende konsentrasjoner av ligand.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kvantitativ karakterisering av protein interaksjoner er viktig i praktisk talt alle felt av biovitenskap, spesielt drug discovery. Mesteparten av tiden tilgjengelig metoder for K D besluttsomhet krever tilgang til renset protein av interesse, generering av noe som kan være tidkrevende og dyrt. Vi har utviklet en protokoll som gir mulighet for bestemmelse av bindingsaffiniteten av mikroskala Thermophoresis (MST) uten rensning av det aktuelle protein fra cellelysater. Fremgangsmåten omfatter overekspresjon av GFP-sammensmeltet protein og cellelyse i ikke-denaturerende betingelser. Anvendelse av metoden til STAT3-GFP forbigående uttrykt i HEK293-celler tillatt å fastslå for første gang affiniteten til godt studert transkripsjonsfaktor til oligonukleotider med forskjellige sekvenser. Protokollen er enkel og kan ha en rekke program for å studere interaksjoner av proteiner med små molekyler, peptider, DNA, RNA, og proteins.

Introduction

Kvantitativ karakterisering av affinitet av intermolekylære interaksjoner er viktig på mange områder innen biomedisinsk forskning. Binding dissosiasjonskonstant (KD) er viktig, ikke bare i medisiner, men er også en viktig parameter for karakterisering av en hvilken som helst binær interaksjon i ethvert biologisk system. Biokjemiske metoder som brukes for påvisning av protein-protein interaksjoner, for eksempel immunoprecipitation og gjær to-hybrid skjermer, ikke informere oss om hvor tett er de interaksjoner, mens affinitet definerer om dette komplekset finnes under gitte forhold in vivo. I medisiner prosess, er bindingsprøve utvikling en av de nødvendige og som oftest er mest tidkrevende trinn. Mest brukte metodene for K D besluttsomhet inkluderer fluorescens polarisering, en overflate plasmonresonans (SPR)-teknologi, to radioligand bindende, 3 isoterm titrering kalorimetri, 4 equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltrering (UF), 5 og ultrasentrifugering (UC). 6. Alle krever betydelige mengder av renset målprotein. Mikroskala Thermophoresis (MST) er en rask utvikling metode som oppdager rettet bevegelse av molekyler i en mikroskopisk temperatur gradient. Eventuelle endringer av hydrering skallet av biomolekyler resulterer i en forandring av relativ bevegelse langs temperaturgradienten. MST 7 blir brukt til å bestemme bindingsaffiniteter og har blitt anvendt for å studere ligandbinding til fluorescensmerkede fluorescerende proteiner eller ligander til et målprotein, 8. 9 MST tillater måling av interaksjoner direkte i oppløsning uten behov for immobilisering til en overflate (immobilisering-fri-teknologi). Praktisk talt er enhver binding ledsaget av en endring i MST-signal, selv om størrelsen på endringen er forskjellig fra system til system betydelig. For påvisning av molekyl bevegelse av MST, må de være fluorescent. Denne store begrensning av metoden kan gjøres om til en fordel. Hvis et protein er uttrykt som en fusjon GFP i hvilket som helst system, vil det være den eneste fluorescerende molekyl og kan således studeres uten isolering fra cellelysat eller cellefritt ekspresjonssystem. Generasjon av cellelysater som gir mulighet for forpliktende forhold med minimale gjenstander er den store utfordringen. Her beskriver vi en protokoll av cellelysat forberedelse og MST eksperiment som kan brukes for mange oppløselige og membranproteiner.

STAT proteiner er latente cytoplasmatiske transkripsjonsfaktorer som er aktivert av tyrosin-fosforylering som respons på ekstracellulære signaler, og er involvert i mange biologiske prosesser, inkludert immunitet, hematopoiesis, betennelse og utvikling. 10. I pattedyr, består av STAT-familien av en STAT, 2, 3, 4 , 5A, 5B og 6. Alle aktiverte statistikk er kjent for å binde til den samme DNA-sekvensen, såkalte GAS motiv, IFN-y aktivert sekvens. Imidlertid transcriptional effekter av ulike statistikker er svært forskjellige. 11. Til tross for involvering i mange patologiske prosesser og omfattende studier ettergivende over 17.000 publikasjoner, har K D av STAT interaksjoner med ulike DNA-sekvenser ikke fastslått. Bare relative affinitet for ulike Stats til varianter av GAS motiv har vært preget. 11. Vanskeligheter med protein uttrykk og rensing er de store hindringer i karakterisering av Stats 'DNA bindende selektivitet. Selv om de fleste av studiene har fokusert på rollen som "aktivert" statistikk, som ble synonymt med Tyr-fosforylert transkripsjonsfaktor, rollen av ikke-fosforylert Stats (U-stats) i regulering av transkripsjon fremstår raskt. 12. Men disse mekanismene er dårlig forstått, og det var uklart om U-Stats faktisk binder seg til DNA eller handle gjennom interaksjon med andre transkripsjonsfaktorer. Vi har nylig vist at U-STAT3 kan binde seg til DNA SequentialCES forskjellig fra GAS motiver med enda høyere affinitet. 13. Funnene har betydelige implikasjoner for vår forståelse av de biologiske funksjonene i denne viktige protein. Vi har søkt mikroskala Thermophoresis å bestemme relative slektskap STAT3 til GAS og AT-rik oligonucleotide S 100 (figur 4). Nesten identisk protokoll har vært brukt i K D bestemmelse for binding av en forskjellig STAT3 ligand, et lipopeptid-inhibitor. 14. Ingen binding til et beslektet transkripsjonsfaktor, GFP-STAT1 som ble brukt som en negativ kontroll kunne det ikke påvises noe som bekrefter selektivitet for interaksjon. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av Cell Lysate

Denne protokollen er ment for heftende celler uttrykker noe GFP-smeltet protein. Nødvendig celle nummer kan variere fra så lavt som 10 6 til så mange som 20 x 10 6 celler, avhengig av nivået av protein uttrykk. For eksempel ble lysat av HEK-celler overekspresjon GFP-STAT3 fremstilt ved behandling av celler dyrket i 10 T75 kolber til tilnærmet 70% konfluens med 1 ml lysebuffer. Men hadde denne lysatet å bli utvannet 150 ganger for å gi optimalt nivå av fluorescens for MST eksperiment. Cellelyse protokoll avhenger sterkt av egenskapene og intracellulær lokalisering av proteinet som undersøkes. Ved bruk av vaskemidler, er uønsket fordi protein ustabilitet, sonikering beskrevet nedenfor, kan være det beste valg. Forskjellige tilsetningsstoffer kan legges til lysis buffer for å hindre protein modifisering reaksjoner: EDTA hindrer fosforylering, hemmer natrium vanadate tyrosin fosfataser, såmiddels fluor er en hemmer av Tjen / Thr fosfataser.

  1. Forbered lysis buffer. For enkle å trekke cytoplasmatiske proteiner følgende sammensetning fungerer godt: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, og proteasehemmer cocktail fortynnes 100 ganger (Sigma-Aldrich P2714, som består av 2 mM AEBSF, 0,3 mikrometer aprotinin, 130 mikrometer Bestatin, 1 mM EDTA, 14 mM E-64, 1 mikrometer leupeptin). Alternativt, for mindre løselig protein, kan man bruke kommersielle Ripa buffer med proteasehemmere cocktail og ikke-denaturerende vaskemidler. Hold buffer på is.
  2. Vask celler en kort stund med iskald PBS ved anvendelse av 10 ml buffer pr T75 kolbe. Hold cellene på is i 5 min, eller til cellene begynner å løsne fra kolben. Skrap celler med celle skrape til å løsne om nødvendig.
  3. Resuspender cellene i 10 ml iskald PBS og overfør til et prechilled 14 ml rundbunnet sentrifugerør.
  4. Pellet-celler ved sentrifugering ved 400-600 x g ved 4 ° C i 5 min. Kombiner celler fra flere kolber på dette punktet jegf nødvendig.
  5. Fjern PBS supernatanten og resuspender pelleten i 200 pl iskald lyseringsbuffer, overføring av suspensjonen til en pre kjølt 1,5 ml Eppendorf-rør.
  6. Hold cellene på is for å redusere lokal overoppheting. Lyse celler med 3x 10 sek pulser av lydbehandling, på 30% amplitude, ved hjelp av en 2-3 mm pre-kjølt tips. Hold tuppen under overflaten for å redusere skumming. Utelate dette trinnet når du bruker vaskemiddel som inneholder buffer og inkuberes på is i 30 min i stedet.
  7. Korriger lysatet løsning å inneholde fysiologiske saltkonsentrasjon (100 mM NaCl) om nødvendig med 5 M NaCl.
  8. Samle lysater ved sentrifugering ved omtrent 26.000 x g ved 4 ° C i 10 min.
  9. Bestem optimal lysatet fortynning (som beskrevet i pkt. 3 nedenfor) og mengden av lysate nødvendig for en titrering (vanligvis rundt 300 ul av ferdig fortynnet lysatet).
  10. Delmengde lysatet og oppbevares ved temperaturer passende for det protein som undersøkes (-80 ° C, i de fleste tilfeller).
  11. </ Ol>

    2. MST Buffer Utvalg og klargjøring

    1. Siden protein-ligand interaksjoner er avhengig av buffer-betingelser, er MST buffer sammensetning velges basert på egenskapene til et bestemt system. Det er vanligvis en fordel å teste minst to forskjellige buffere.
    2. Forbered to 5x MST buffere. Vi hadde god erfaring med disse to blandinger: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl 2, 500 mM NaCl, 0,25% NP-40) og tris-HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 0,05% Tween-20). Tilsetting av BSA (5% i den endelige bindende blanding) kan bidra til å hindre vedheft av proteiner til plastrør og glass kapillærer. NaN 3 (0,5 mM), kan også være inkludert for å hindre vekst av mikroorganismer.

    3. Fastsettelse av Optimal Lysate fortynning

    1. Velg LED eksitasjon kilde med bølgelengde λ = 470 nm på MST instrument.
    2. Laste kapillærer med cell trekke utvannet 2 og 10x med MST buffer.
    3. Utfør "Finn Kapillærer" operasjon på Control Software for MST instrument. Den optimale fluorescens varierer i fortynnet lysat er fra 400 til 1500 fluorescensenheter.

    4. Fastsettelse av Optimal ligandkonsentrasjonen Range

    1. Den høyeste konsentrasjon av ligand bør være minst 20 ganger høyere enn den forventede dissosiasjonskonstant.
    2. Den laveste ligandkonsentrasjonen bør være lavere enn molare konsentrasjon av fluorescerende protein.

    Se i NanoTemper Technologies Konsentrasjon Finder verktøy for ligandkonsentrasjonen range estimering.

    5. Utarbeidelse av Cell Lysate og ligand Fortynninger

    1. Plasser en tube stativ med et nødvendig antall (vanligvis 10-16) på 0,5 ml LoBind sentrifugerør på is. Pipetter 25 pl av MST-buffer til bunnen av hvert rør. Tilsett 25 pl av liganden stamoppløsning til det første kare (# 1, ligand høyeste konsentrasjon) og utføre seriell to-ganger fortynning av liganden ved hjelp av resten av rørene. Hold stativet med ligand prøvene på is.
    2. Tine cellelysat sakte på is.
    3. Fortynn cellelysat med MST-buffer for å gi det optimale nivået av det fluorescerende målprotein i bindingen reaksjoner. Proteinsluttkonsentrasjon bør være nær forventet K D eller lavere. Det bør bli justert for å skaffe nødvendige antall fluorescens tellinger i den endelige løsningen. For bestemmelse av GFP-STAT3 konsentrasjon i lysatet ble instrumentet kalibreres med en hjelp av fluorescein. Den molare konsentrasjonen av GFP i lysatet ble bestemt ved hjelp av forholdet mellom fluorescein og EGFP quantum yield, 0,85 og 0,61 kroner. 15.

    6. Mikroskala Thermophoresis Binding Studies

    1. Velg LED eksitasjon kilde med λ = 470 nm på MST instrument.
    2. Plasser 0,5 ml LoBind rør i tube stativ over fra rør med ligand seriefortynning prøver. Tilsett forsiktig 15 pl av cellelysat til bunnen av hvert rør. Prøv å ikke berøre rørvegger å unngå prøven tap.
    3. Tilsett 15 pl av liganden prøven med den høyeste konsentrasjonen (1) til det tilsvarende rør 1 med den cellelysat. Bland godt og endre en pipette tips. Gjenta dette trinnet med resten av rørene med unntak av den siste, som bør inneholde ingen ligand.
    4. Tilsett 15 mL av MST buffer til det siste røret og bland godt.
    5. Fyll ca 2/3 av den første kapillært med binding blandingen fra tube # 1, vippe det å flytte løsningen mot sentrum, og plasser kapillær på kapillær skuffen til posisjonen nr. 1 (det nærmeste punktet til skuffen åpning) . Gjenta dette trinnet med resten kapillærer. Kapillære endene kan plugges med voks for lengre eksperimenter.
    6. Plasser skuffen inne i MST instrument og lukk instrumentets døren.
    7. Utfør "Finn Kapillærer"Kommandoen for å la apparatet finne nøyaktige posisjoner av kapillærene, og måle fluorescensen av prøvene.
    8. Basert på fluorescens signal intensitet, justere LED-effekt (10-100%) for å bringe det inn 400-1,500 enheter intervall.
    9. Klikk på "Start"-knappen for å utføre Thermophoresis eksperimentet. Mer enn en IR-laser-kraft kan velges for eksperimentet for å finne den optimale temperatur gradienten for det bestemte systemet. Samle inn data 2-3 løper for samme sett av kapillærer for å sikre reproduserbarhet av målingene. Det tar 10-12 minutter for å kjøre ett sett med 16 kapillarer.

    7. Mikroskala Thermophoresis Data Analysis

    1. Åpne analyse programvare.
    2. Laste prosjektet mappen. I dukket Information Run Viewer velge samles på et bestemt IR laser makt thermophoretic kurver. Det er en mulighet for å åpne alle thermophoretic spor samlet under ulike forhold, for eksempel IR laser makt, LED power, temperatur, konsentrasjon, etc. på en gang og deretter velge noen kurver for analyse ved å bytte dem av og på (klikk på forsøket navn).
    3. I Evaluering Points graf-vinduet velger du Thermophoresis eller Thermophoresis med T-hopp. Sørg for at blå og røde linjer er riktig plassert. Å oppnå gjennomsnittlig poeng med standardavvik, velg "Bruk Gjennomsnittlig" eller "Skille går" for separate serier.
    4. Å plotte en dissosiasjonskonstant passform, velg "Bruk Gjennomsnittlig", gå inn og fikse den merkede molekylet konsentrasjon verdi (sjekk "konsentrasjon" firkant i et anfall vindu-menyen), og passer kurven. K D-verdi med sin standardavvik vises i en egen informasjon pop-up vindu. For å plotte et anfall ved hjelp Hill metoden, velg "Average", Hill-metoden, og deretter passe kurven. EF 50 affinitet verdi med sin standardavvik er vist i denne saken. Funksjonen av K D eller Hill "grensen" kan også benyttes når metningi en bundet tilstand er ikke nådd.
    5. Lagre gjennomsnittlig fit data i en tekstfil og overføre til Excel.
    6. Plot F norm (normalisert fluorescens), Af norm (normalisert forskjell i fluorescens hvis forskjellige eksperimenter blir sammenlignet), eller bundet fraksjon (se formel nedenfor) som en funksjon av den umerkede (titrert) molekyl konsentrasjon.

    Fraksjon bundet (fraksjon av molekyler i en kompleks) = (Therm (C)-ubundet) / (bundet-ubundet), hvor Therm (C) er Thermophoresis målt for konsentrasjonen C, er ubundet Thermophoresis for ubundet tilstand (når molekylene ikke i en kompleks), og er bundet Thermophoresis for den totalt bundet tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling av affinitet av ikke-fosforylert STAT3 proteinbinding til oligonukleotider.

HEK293 celler uttrykker STAT3-GFP ble brukt som en kilde til fluorescensmerkede STAT3 for DNA bindende analysen. Cellelysater ble fremstilt ved hjelp av RIPA-buffer (20x10 6 celler / ml). For binding undersøkelsene ble lysater fortynnet 150x med MST DNA-bindingsbuffer for å gi det optimale nivået av det fluorescerende protein i bindingsreaksjon (ca. 20 nM). Ikke-transfekterte HEK293 celler har blitt brukt til å evaluere bakgrunnsfluorescens, som viste seg å være ikke-påvisbar selv i ikke-fortynnet lysat. Imidlertid kan bakgrunnsfluorescens være av større betydning i andre ekspresjonssystemer og således må overvåkes. Titrering serie bestående av 11 bindende blandinger og lysatet prøven uten ligand er utarbeidet. Hver prøve inneholdt 15 pl av fortynnede celle-lysat og 15 pl av oligonukleotider oppløsninger av varierende concentrationer. Endelig buffer sammensetning bestod av 25 mM HEPES, pH 7,2, 50 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, og 0,025% NP-40. Målingene ble tatt i standard behandlet kapillarer på Monolitten NT.115 instrument under anvendelse av 50% IR-laser-kraft og LED-kilde med λ eksitasjon = 470 nm ved omgivelsestemperatur. Binding av høyt ladede oligonukleotider medført betydelige endringer i STAT3 mobilitet i temperaturgradient (figur 2). I figur 3, er thermophoretic signal plottet som en funksjon av oligonukleotid konsentrasjon. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av tre målinger. NanoTemper Analyse 1.2.20 programmet ble brukt for å tilpasse dataene og for å bestemme den tilsynelatende K D verdier. De tilsynelatende dissosiasjonskonstanter var 37,9 ± 1,0 mikrometer og 23,3 ± 0,6 mikrometer for gass og S 100, henholdsvis (figur 4). Substitusjon av A-til G-ført dramatisk reduksjon i affinitet for S 100 mut # 1 (figur 4), mens muTant S 100 mut # 2 viste ingen påviselig binding noe som bekrefter sekvens-selektiv binding av STAT3 til S 100. Overraskende, S 100 sekvenser vises litt strammere binding enn GAS i tre måling repetisjoner.

Figur 1
Figur 1. Generelle ordningen med forsøket. Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Ubearbeidede Thermophoresis data generert for samspillet av GFP-STAT3 med AT-rik oligonukleotid. Utvannet cellelysat containi ng 20 nM GFP-STAT3 ble blandet med økende mengder av dobbelt-trådet oligonukleotid (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) og ga de angitte konsentrasjoner av ligand. Dataene ble oppsamlet ved 50% lasereffekten og 100% LED.

Figur 3
Figur 3. Binding kurve generert av NanoTemper Analyse 1.2.231 programvare. Normalisert fluorescens (fluorescens varm / initial fluorescens) er plottet som en funksjon av oligonukleotid konsentrasjon. Proteinet viser en økning i fluorescens i det bundne sammenlignet med ubundet tilstand. Dataene er montert ved hjelp av Hill ligningen metode innlemmet i NanoTemper Analysis programvare.

0541fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>
Figur 4. STAT3 binding til oligonukleotidene med ulike sekvenser. Mikroskala Thermophoresis bindende målinger av STAT3-GFP til GAS (K D = 37,9 ± 1,0 mm), S 100 (K D = 23,3 ± 0,6 mm), 100 S mutant 1 (K D = 740 ± 21 mm), og S 100 mutant 2 (ingen binding). Den STAT3-GFP-konsentrasjonen ble holdt konstant ved omtrent 20 nm, og konsentrasjonen av oligonukleotider varierte 666 til 0,650 uM. Forskjellen i normaliserte fluorescens [‰] er plottet som en funksjon av oligonukleotid konsentrasjon, og kurvene er montert ved hjelp av Hill-metoden av den NanoTemper Analysis programvare. Feilfelt representerer standard feil av tre målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Proteinekspresjon og rensing er en arbeidskrevende og kostbar steg, som er imidlertid nødvendig for bestemmelse av interaksjoner 'K D ved de for tiden brukte metode. Anvendelsen av MST tillater unngå protein rensing dermed vesentlig forenkling og akselererende kvantitativ karakterisering av interaksjoner. Den presenterer spesielt betydelige fordeler når det gjelder vanskelige å uttrykke og rense proteiner, slik som membranproteiner og transkripsjonsfaktorer.

Den største begrensningen og kravet om MST er evnen til å uttrykke et protein som en fusjon med grønt fluorescerende protein. Imidlertid konstruksjoner for ekspresjon av flertallet av GFP-smeltet humane og mus proteiner er kommersielt tilgjengelige. GFP-smeltet proteiner er også mye brukt for menneskehandel og degradering studier, og dermed kan tjene "dobbel plikter" i kombinasjon med MST studiene.

I tillegg til manglende behov for protein purification, veldig økonomisk bruk av alle reagenser og ufølsomhet for små variasjoner i buffer komposisjoner, tilbyr MST andre fordeler i forhold til tradisjonelle metoder for K D bestemmelser. I motsetning til overflaten plasmonresonans, MST-baserte forsøk ta mindre enn to timer, gir mulighet for bestemmelse av K D i bredere spekter, og ikke lider av overflaten immobilisering gjenstander. For eksempel kunne vi ikke fastslå K D for STAT3 binding til oligonukleotidene av SPR, selv om vi har investert betydelig mengde av midler til innkjøp av renset STAT3 protein. K D av interaksjonen var for høyt, noe som ofte er tilfelle for transkripsjonsfaktorer, og falt ut fra SPR eksperimentet konsentrasjonsområde.

Titrering kalorimetri fungerer bare for interaksjoner som er ledsaget av endringer i entalpi. Denne begrensning utelukker mange tilfeller. I mellomtiden, endringer i thermophoretic mobilitet, selv om ikke variere mye i verdier for different systemer, skje for et stort flertall av interaksjoner. En av de største fordelene med MST er at den fungerer i en rekke buffere som tåler nærværet av vaskemidler, miceller, og bicelles i systemet. Denne egenskapen gjør det mulig å anvende det til membranproteiner som er praktisk talt umulig å studere på annen måte. Imidlertid må det utvises forsiktighet for å unngå variasjoner i vaskemiddel og miceller innhold og sammensetning under titrering med liganden.

Det bør også tas i betraktning ved bruk av celle-ekstrakter som proteinet som studeres kan eksistere i sin opprinnelige form, som ofte er et kompleks med andre proteiner, nukleinsyrer og kofaktorer. Således kan bindingsaffinitet være forskjellig fra det for en isolert protein som ikke er involvert i noen komplekse formasjoner. Overuttrykte tillater hyppig titrere ut interaksjonspartnere slik at det meste av molekylene av proteinet som studeres i ikke-bundet tilstand. Dette er en annen grunn til å prøve å achieve svært høye uttrykk nivåer av GFP-smeltet protein på cellene transfeksjon. Den andre er vanskelig å kontroll parameter er posttranslational modifikasjoner som også kan gi en betydelig økning heterogenitet til systemet. Ytterligere begrensninger er å studere bindingen til proteiner og små molekyler som er tilstede i cellelysater i store mengder eller molekyler med bred spesifisitet og lav affinitet som kan samvirke med flere proteiner i lysatet. Wienken, CJ, et al. har funnet at K D bestemmes av MST i E. coli ekstrakt var mer enn en størrelsesorden høyere enn i en buffer for interaksjonen av interferon gamma antistoffer med ni. Effekten kan ha vært delvis på grunn av proteolyse siden ekstraktet hadde ingen protease-inhibitorer. Lite molekyl binding til serum albumin ble også funnet å endre K D i samspill studier av MST ni.

Effekten av utvinning kan også variere for different proteiner avhengig av intracellulær lokalisering og fysisk-kjemiske egenskaper. Således, er det nyttig å prøve flere cellelyse og protein ekstraksjonsbetingelser. For cytoplasma proteiner, uten bruk av vaskemidler, produserer bare ultralyd for celle avbrudd ofte veldig gode avlinger og data. I mellomtiden, membran proteiner krever mer omfattende screening av ekstraksjon forhold med varierende konsentrasjoner og natur av vaskemidler, lipid miceller, eller bicelles. Vaskemiddel innhold må holdes til et minimum for å unngå å påvirke bindende affinitet.

På tross av de nevnte begrensninger, har vi funnet MST-studier av ikke-renset GFP-sammensmeltede proteiner å være meget praktisk for kvantifisering av bindingsaffiniteter for mange proteiner og liganden typer. Det er ingen tvil om at økt bruk av metoden i mange laboratorier vil tillate ytterligere utvidelse anvendelser av MST-baserte proteinbindende studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser. Innholdet i denne publikasjonen representerer ikke nødvendigvis gjenspeiler synspunktene eller politikken til Department of Health and Human Services, heller ikke omtale av varemerker, kommersielle produkter eller organisasjoner innebærer godkjennelse av den amerikanske regjeringen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av egenutført Research Program av NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research, Collaborative Research Avtale mellom NCI og Calidris Therapeutics, American Cancer Society stipend IRG 97-152-17 til OT, og føderale midler fra National Cancer Institute, NIH, under kontrakt HHSN26120080001E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
  4. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  5. Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398-3953 (2010).
  6. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  7. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
  8. Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
  9. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
  10. Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
  11. Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
  12. Yang, J., Stark, G. R. Roles of unphosphorylated STATs in signaling. Cell Res. 18, 443-451 (2008).
  13. Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
  14. Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013).
  15. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics