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Summary

A aterosclerose é um processo inflamatório crônico. Este manuscrito ilustra um fácil de usar modelo ex vivo para investigar carótida fresco ou placas nas artérias coronárias. O modelo ex vivo permite a investigação de substâncias potenciais sobre o meio inflamatório nas lesões ateroscleróticas humanas e os resultados podem ser analisados ​​através de vários métodos.

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Erbel, C., Okuyucu, D., Akhavanpoor, M., Zhao, L., Wangler, S., Hakimi, M., Doesch, A., Dengler, T. J., Katus, H. A., Gleissner, C. A. A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology. J. Vis. Exp. (87), e50542, doi:10.3791/50542 (2014).

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Abstract

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica da vasculatura. Existem vários métodos para estudar o composto inflamatório nas lesões ateroscleróticas. Modelos de rato são um instrumento importante para investigar os processos inflamatórios na aterogénese, mas estes modelos sofrem das diferenças fenotípicas e funcionais entre o murino e sistema imunológico humano. Em experiências in vitro de células são usadas para avaliar especificamente células alterações dependentes do tipo causada por uma substância de interesse, mas variações dependentes de cultura e a incapacidade para analisar a influência de moléculas específicas no contexto do composto inflamatório nas lesões ateroscleróticas limitar o impacto dos resultados. Além disso, os níveis de uma molécula de interesse, em sangue humano medição ajuda a continuar a investigar a sua relevância clínica, mas isto representa a inflamação sistémica e não local. Portanto, temos aqui descrever um modelo de cultura de placa para estudar a biologia da lesão aterosclerótica humanaex vivo. Em suma, placas novas são obtidos de pacientes submetidos a endarterectomia ou revascularização do miocárdio e armazenados em meio RPMI no gelo até o uso. As amostras foram cortadas em pedaços pequenos, seguido por distribuição aleatória em uma placa de 48 poços, contendo meio RPMI em adição a uma substância de interesse, tais como citocinas ou quimiocinas, isoladamente ou em combinação, por períodos de tempo definidos. Após a incubação, as peças da placa pode ser congelado de choque para o isolamento de mRNA, embebidos em parafina ou outubro para coloração imuno-histoquímica ou esmagado e lisadas por western blotting. Além disso, as células podem ser isoladas a partir da placa por análise de citometria de fluxo. Além disso, os sobrenadantes podem ser recolhidas para a medição da proteína por meio de ELISA. Em conclusão, o modelo ex vivo apresentado abre a possibilidade de estudar ainda a biologia lesional inflamatória, o que pode resultar na identificação de novos mecanismos de doença e alvos terapêuticos.

Introduction

A aterosclerose como uma doença inflamatória crônica é uma das principais causas de morte nos países industrializados 1-2. As complicações da aterosclerose, síndromes coronárias agudas, especialmente, têm sido associados a ruptura das lesões vulneráveis, causando aterotrombose e oclusão do vaso 3. A imunidade inata e adaptativa parecem estar envolvidos em todas as etapas da aterogênese 2,4-5. Embora o progresso significativo foi feito no tratamento do infarto agudo do miocárdio, a prevenção eficaz da aterosclerose e eventos cardiovasculares adversos ainda estão por resolver. Assim, estudando biologia lesional é essencial para aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiopatologia da aterosclerose e para permitir a identificação de novos alvos terapêuticos e desenvolvimento de novas terapias.

Em muitos casos, os modelos de murino são utilizados para investigar a patofisiologia de doenças específicas. No entanto, o estudo aterogênese utilizando modelos de ratos é acomodaçãompanied por várias limitações: (1) Normalmente, os ratos ateroscleróticas receber uma dieta rica em colesterol. Os níveis de colesterol nesses modelos não podem ser comparadas com as de pacientes com níveis elevados de colesterol no soro 6. (2) Existem diferenças substanciais entre a murino e sistema imunológico humano; assim Foxp3 é um marcador específico de células T reguladoras de murino, enquanto que a expressão de Foxp3 humana em células T humanas não necessariamente conferir um fenótipo de regulação 7. Além disso, o paradigma Th1/Th2 como definido em seres humanos não é inteiramente transferida para as células T de murino. (3) Um número de marcadores que são utilizados para identificar os monócitos e macrófagos de murino, tais como F4/80 e marcadores de clássica (M1) vs alternativa (M2) Os padrões de activação não existe nas células mielóides humanas 8. (4) A expressão dos genes de monócitos do sangue periférico de murídeo e humanos foi encontrado para ser substancialmente diferente 9.

Assim, a fim de aumentar a compreensão dasprocessos inflamatórios crônicos na aterosclerose humana, precisamos fazer uso de modelos que trabalham com tecidos humanos, sangue ou células. Aqui, descrevemos um modelo de cultura de tecidos placa humano, o que permite a investigação de substâncias novas potenciais no conceito de biologia lesional inflamatório humano.

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Protocol

1. Preparar meio da seguinte

  1. Meio de Cultura: meio RPMI.
  2. Adicionar 10% de soro fetal de vitelo (FCS).
  3. Adicionam-se 100 U / ml de penicilina G, e 100 g / ml de estreptomicina.

2. Armazenamento de cilindros de placa fresco até o uso

  1. A operação de endarterectomia de carótida de pacientes com ou sem sintomas isquêmicos (derrame cerebral, ataque isquêmico transitório), com estenose importante da artéria carótida será feito por cirurgiões vasculares e endarterectomia da artéria coronária durante a revascularização do miocárdio por cirurgiões cardíacos. / Placas coronárias carótidas precisam de ser removidos em bloco para preservar a estrutura da placa, tal como descrito anteriormente 5.
  2. Após placa lugar extirpação do espécime em um tubo de meio cheio e armazená-lo no gelo (placa precisa ser completamente coberto com meio) até o uso.

3. Processamento Plaque

  1. Use uma célula prato de cultura adequado (por exemplo, 60 mm)e adicionar 5 ml de meio RPMI.
  2. Coloque o tecido de placa na placa de cultura (placa deve ser completamente coberto com o meio).
  3. Segurar o tecido da placa cuidadosamente nas bordas do tecido, utilizando fórceps estéreis.
  4. Cortar as bordas da amostra da placa utilizando um bisturi esterilizado.
  5. Divida tecido placa ao meio.
  6. Avaliar a morfologia da lesão macroscopicamente (calcificada, lipídico rico, rompido, trombos, fibrose).
  7. Analisar a morfologia exata de placa após o experimento vivo ex por imuno-histoquímica. Use a classificação AHA 10.
  8. Descarte placas com intensa calcificação ou fibrose.
  9. Cortar o tecido em pequenos pedaços placa homólogos (3 x 3 x 3 mm).
  10. Choque congelar dois pedaços de placa e armazená-los em nitrogênio líquido para os valores básicos da lesão até o uso.
  11. Prepare uma placa de 48 poços.
  12. Adicionar 500 ul de meio RPMI a cada poço utilizado para a experiência.
  13. Por favor, use umt menos duas peças de placa para cada grupo.
  14. Adicionar a substância de interesse (por exemplo, citocinas e quimiocinas específicas).
  15. Use peças de placa não estimuladas como controles.
  16. Aleatoriamente plantar o número apropriado de peças de placa para os poços.
  17. Cultura as peças de placa para os tempos indicados.
  18. Para a placa tecido experimento estimulação com lipopolissacarídeo (LPS)
    1. Utilize os seguintes momentos: 3 horas, 8 horas e 24 horas.
    2. Usar dois pedaços de placas para o LPS e dois para o grupo não estimulado para cada ponto de tempo, respectivamente.
    3. Adicionar 1 ug / ml de lipopolissacárido.
  19. Durante a incubação, a manter a placa de 48 poços a 37 ° C em ar humidificado contendo 5% de CO 2.

4. Colheita tempo pedaços de tecido placa Depois indicados

  1. Choque congelar os pedaços de placas para isolamento do mRNA e síntese de cDNA (para informações detalhadas, ver protocol seção 5).
  2. Recolhe-se o sobrenadante e armazenou-se a -20 ° C para análise de ELISA.
  3. Para western blotting, esmagar e lisar tecido placa. Filtrar o ligado através de uma mM 0,65 e 0,1 um dispositivo de filtro centrífugo.
  4. Tecido placa Incorporar em tecido-tec ou parafina para colorações imuno-histoquímica.

5. Extração de RNA a partir de pedaços de placas de cultura

  1. Use um TissueLyser para homogeneização.
  2. Isolar o RNA, usando o kit (ver tabela materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Determinar a quantidade de ARN e a qualidade das amostras com espectrofotómetro.
  4. Usar o kit da Boehringer cDNA para a transcrição inversa de acordo com as instruções do fabricante.
  5. Para a PCR quantitativa, utilizar por exemplo, o tempo real Roche kit de PCR com SYBR Green.

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Representative Results

Aqui nós apresentamos uma série de figuras que demonstram resultados da ex vivo placa de cultura. Para avaliar as mudanças no ambiente inflamatório em resposta ao agente de interesse no modelo ex vivo experimento, medimos moléculas diferentes que são conhecidos por serem primariamente envolvidos na aterogênese. Como citocinas pró-aterogênico representativos escolhemos TNFa, IL6 e IFNg 2,11. Além disso, usamos o fator de von Willebrand e fator tecidual para avaliar as mudanças pró-trombóticos. Além disso, para tratar o desenvolvimento de instabilidade de placas induzidas por um agente de interesse, matriz metalopeptidase 9 (MMP9), os níveis serão analisadas. Chemoattractance é também um passo importante na progressão e regressão da placa 11, assim, nós investigamos os níveis de CCL2, também referida como a proteína quimiotáctica de monócitos-1 (MCP-1), o princípio quimioatraente para monócitos / macrófagos. Depois de atração de células de rolamento e adesão celular são os passos seguintes.Por causa disso, escolher a ICAM-1. Ao analisar mais as vias de sinalização influenciados pela substância de interesse usamos-regulada por sinal extracelular quinases (ERK1 / 2), amplamente expressa e ativado por muitos estímulos diferentes, tais como citocinas, apoptose, diferenciação, infecção e ligantes para proteína G heterotrimeric vírus receptores acoplados 12.

Primeiro, vamos mostrar as mudanças de tempo dependentes do composto inflamatório de lesões ateroscleróticas em cultura não estimuladas, analisados ​​por reação quantitativa em tempo real em cadeia da polimerase (qRT-PCR) (Figura 1). Durante a cultura em placas, um aumento da actividade do meio lesional inflamatória pode ser observada. Nenhuma diferença foi encontrada após 3 hr contra nenhuma cultura (dados não mostrados). Depois de 8 horas de cultura em placas, encontramos apenas um ligeiro aumento da expressão de algumas moléculas, tais como IL6, mas não de TNF e um IFN g, que, após 24 horas, houve uma regulação positivade várias moléculas, tais como o TNF a, IL-6 e IFN g. Notavelmente, quanto maior o tempo de cultura da placa quanto maior a variação da expressão da molécula são.

Em segundo lugar, para demonstrar a viabilidade de influenciar o meio inflamatório nas lesões ateroscleróticas, apresentamos resultados de pedaços de placas incubadas com 1 ug / ml de LPS durante 3 horas, medido por qRT-PCR (Figura 2). Peças de placa não estimuladas serviram como um controlo negativo . Descobrimos que LPS induziu um aumento significativo do grau de ativação do composto inflamatório nas lesões ateroscleróticas. Várias citocinas (IL-6, TNF uma etc, Figura 2A-B), quimiocinas (CCL2, etc, não representados), adesão (ICAM1, não mostrado), desestabilização da placa (Matrix metalopeptidase 9 (MMP9), não mostrado) e pró- moléculas trombóticos (fator de von Willebrand, a Figura 2C,

Em terceiro lugar, para avaliar a abundância de proteínas, sobrenadantes de lesões cultivadas foram analisados ​​por ELISA e esmagou tecidos placa por western blot (Figura 3D). Na Figura 3A-C, que mostram a análise de ELISA de IFN-g, MCP-1 e TNF-a no sobrenadante das amostras de cultura foram incubadas com LPS ou o controlo, durante 8 h. Além disso, a análise de Western blot para (fosforilada) de ERK 1/2 de tecidos de placas esmagados e lisados, quer estimuladas com LPS ou o controlo, é demonstrado na Figura 3D.

Figura 1
Figura 1. Efeito da cultura placa do composto lesional inflamatória ao longo do tempo. Pedaços de placas ateroscleróticas foram chocar imediatamente congelados ou cultivados por 8ou 24 horas e a expressão de citocinas indicadas IL6 (A), IFN g (B) e TNF-A (C) foi analisada por qRT-PCR. Os resultados apresentados representam a média de cinco experiências independentes. Foram utilizadas cinco peças lesões ateroscleróticas para cada grupo de ponto no tempo indicado. Os valores são normalizados para b-actina e expressa em cópias de cDNA / 1.000 cópias b-actina. Os resultados são apresentados como gráficos de caixas exibindo média e 25 º e 75 º percentis como caixas e 10 º e 90 º percentis como bigodes. *: P <0,01.

Figura 2
Estimulação por LPS de peças de placas de cultura induziram um aumento de várias moléculas inflamatórias Figura 2.. Pedaços de placas foram incubadas com 1 ug / ml de LPSou não estimuladas durante 3 horas e analisadas por qRT-PCR. Os resultados apresentados representam a média de cinco experiências independentes. Foram utilizadas duas peças para cada grupo. Os valores são normalizados para b-actina e expressa em cópias de cDNA / 1.000 cópias b-actina. Os resultados são apresentados como gráficos de caixas exibindo média e 25 º e 75 º percentis como caixas e 10 º e 90 º percentis como bigodes. *: P <0,01.

Figura 3
A expressão de proteínas a Figura 3. No sobrenadante da placa de cultura. Medições representativas de ELISA de citoquinas IFN-g (a), o TNF-a (B) e MCP-1 (C) no sobrenadante de pedaços de placas tratadas com LPS ou não estimuladas durante 8 hr são mostrados. Os resultados apresentados representam a média de cinco experimental independentests. Os resultados são apresentados como gráficos de caixas exibindo média e 25 º e 75 º percentis como caixas e 10 º e 90 º percentis como bigodes. Além disso, a transferência western representativo para (fosforilada) de ERK 1/2 estimulados por LPS ou controlar lesões ateroscleróticas em cultura após 3 horas é demonstrado na Figura 3D. Os gráficos de barras coluna exibindo média + SEM como bigodes representam a média de cinco experimentos independentes. *: P <0,01.

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Discussion

Aqui apresentamos um modelo de cultura ex vivo placa para investigar a influência de substâncias potencialmente relevantes sobre a biologia da lesão aterosclerótica. A principal vantagem deste método ex vivo é a capacidade de avaliar a influência das substâncias indicadas nas células inflamatórias e a sua interacção celular, bem como vias inflamatórias e cascatas em lesões ateroscleróticas humanas. Vários métodos utilizáveis ​​(por exemplo, RT-PCR, Western blot, imuno-histoquímica, citometria de fluxo, ELISA) ajudam a fornecer uma análise abrangente do impacto da substância de interesse sobre a inflamação da lesão aterosclerótica.

Os processos inflamatórios na aterosclerose murino são bem compreendidos, também graças a modelos de mouse over-expressar ou falta certos genes de interesse 11. Contudo, os resultados nem sempre correspondem intimamente aos seres humanos 6-9,13. Camundongos ateroscleróticos normalmente recebem um alto chol patológicaesterol dieta 6. Além disso, é sabido que os sistemas imunitários entre humanos e ratinhos demonstraram diferenças substanciais 7-9. Aqui, apresentamos um modelo de cultura ex vivo placa, que permite estudar a influência de uma substância de interesse no composto inflamatório nas lesões ateroscleróticas humanas, como mostrado por 14 Niessner et al.. Além disso, vários outros métodos podem ser utilizados para analisar os resultados de uma experiência de cultura da placa, comparável com os estudos de murinos. Portanto, o modelo ex vivo abre a possibilidade de substituir murino em estudos in vivo em alguns casos, e podem representar um método excelente em ponte entre um putativo promovendo aterosclerose molécula no sistema murino e de tradução para a biologia humana.

O modelo humano vivo ex para a aterosclerose não é comparável com experimentos em células in vitro. As linhas celulares que podem ser facilmente armazenados e cultivados, mas são fenotipicamente e functionally não idênticas às células primárias. Células frescas podem ser obtidos por de sangue regulares chama, mas eles é por vezes muito difícil de cultura e a cultura é sujeita a diversos factores. Além disso, através da utilização, em experiências in vitro de cultura de células, não é possível investigar a influência de moléculas específicas no composto inflamatório nas lesões ateroscleróticas. Assim, as experiências in vitro são importantes para (translação) passo inicial para investigações de biologia humana, mas não a analisar ainda mais o papel da molécula de interesse no conceito de aterosclerose humana, especialmente interacção celular e influência sobre as cascatas inflamatórias e via dentro lesões ateroscleróticas .

Monaco et al. Estabelecido um importante sistema de cultura de curto prazo de células isoladas a partir de tecido humano aterosclerótica 15. Eles usaram uma mistura enzimática da colagenase, elastase e DNase. Este método permite a investigação de lesiexperimentos célula-célula onal, sinalização análise de caminho e os estudos de transferência de gene com vetores adenovirais. Mas continua a ser desconhecida a forma como a mistura enzimática influencia as células, isto é, formando de activação, expressão do marcador de superfície, etc Além disso, ele pode ser questionado se os resultados destas experiências reflectem os processos reais dentro lesões ateroscleróticas. Além disso, o local de origem das células será destruída pela mistura enzimática e o sistema de cultura de curto prazo tem as mesmas limitações que os em experiências com células in vitro.

Por célula ou população de células de estudos específicos dentro de uma lesão aterosclerótica, é possível utilizar o método de micro-dissecção de captura a laser. A célula ou composto de interesse vai ser cortada para fora do tecido, utilizando uma ligação por infravermelhos ou UV-laser e de RNA, DNA ou análise de proteínas pode ser realizada. O micro-dissecção de captura laser não parecem danificar as células, o receptor da superfície da célula expression etc A vantagem do método é a análise de uma célula ou de um local de interesse no interior de uma lesão aterosclerótica. Mas não é possível avaliar ainda as células, tais como os estudos in vitro.

O modelo ex vivo implica uma ampla gama de possíveis métodos para medir e analisar os resultados. Tempo real da reacção em cadeia da polimerase pode ser realizada após o isolamento do ARN e a síntese de cDNA a investigar o nível de expressão do gene, como mostrado por 14 Niessner et al.. A imunohistoquímica é uma ferramenta criada para avaliar o nível de proteína, a fim de provar a expressão da proteína ea origem celular dentro de lesões ateroscleróticas. Western blotting pode ser utilizado para analisar as vias de sinalização. Além disso, o isolamento de células por digestão em uma solução de enzima abre a oportunidade de realizar a análise de citometria de fluxo para analisar ainda mais para o tipo de célula de exemplo, os subtipos celulares e grau de activação. Além disso, após o isolamento das célulasspectratyping representam um bom método para analisar melhor a variabilidade receptor de células T. Além disso, após o isolamento digestão célula magnética é um método comprovado de alta qualidade de separação de células de subtipos celulares específicos para mais estudos in vitro ou análise de microarray. Enfim, sobrenadantes podem ser coletadas para medição de proteínas por ELISA. Em conclusão, o modelo ex vivo é uma valiosa ferramenta para investigar as alterações exactas do meio inflamatório nas lesões ateroscleróticas humanas.

O modelo ex vivo é baseada em amostras de endarterectomia. Usando placas ateroscleróticas obtidos de indivíduos diferentes podem resultar em um grau maior de composição celular diferencial e, assim, maior a variação dos níveis de genes / proteínas de interesse. Assim, é importante o uso de amostras de lípidos ricos ou complicadas da placa em vez de lesões fibrosclerótica 10, porque a resposta inflamatória é acentuadamente menor no Lesio fibroscleróticans. Portanto, é de grande interesse para avaliar a morfologia das placas, antes de analisar os resultados das experiências de cultura de placas.

Além disso, cada amostra de exemplo inclui diferentes fases do desenvolvimento da lesão aterosclerótica / progressão, da disfunção endotelial inicial e acumulação de lípidos passo, no sentido do desenvolvimento de estrias e necrótica para placas rotas gordos. Assim, a fim de minimizar a heterogeneidade do tecido da placa, é necessário cortar as bordas, que geralmente representam os passos precoces de aterogénese.

Não pode ser excluído que o corte induz respostas de lesão de tecidos. Mas nossos experimentos de cultura de tecido de placa apresentaram níveis de expressão de genes semelhantes de tecidos placa de cultura para os tecidos de placa não-cultivadas. Assim, este sublinha que o método atual é uma boa ferramenta para investigar o ambiente inflamatório nas lesões ateroscleróticas.

A cultura depeças de chapa é limitada a um período de tempo de até um dia. Se o tecido da placa é cultivada mais do que um dia, a variação dos resultados aumenta drasticamente. Além disso, depois de 3 dias a composição e morfologia de placas colapsa.

Há limitações que precisam ser mantidos em mente quando se aplica este modelo. O modelo ex vivo é um bom método para estudar o meio inflamatório nas lesões ateroscleróticas. No entanto, os principais componentes estão faltando neste contexto. Não há características hemodinâmicas são aplicáveis ​​e as influências sistêmicas são totalmente ausente. Além disso, com este método só é possível para investigar as mudanças de curto prazo, mas carece de uma análise de longo prazo por causa do colapso da morfologia da placa.

Em conclusão, apresentamos aqui um método que será útil para pesquisadores que estão interessados ​​na investigação de possíveis moléculas novas sobre a inflamação da lesão aterosclerótica humana. O ex vivo placa cmodelo ulture faz sofrer de diferenças entre o murino e sistema imunológico humano, mas nos dá a capacidade de analisar a interação celular no contexto das lesões ateroscleróticas e representam a oportunidade de investigar cascatas inflamatórias lesionais locais e caminhos. O ex vivo método de cultura de placa aqui descrito é fácil de usar e é reprodutível e pode ajudar a identificar e validar mecanismos da doença e novos alvos terapêuticos.

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Disclosures

Os autores não têm qualquer conflito de divulgar.

Acknowledgements

Agradecemos Nadine Wambsganss pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) ER 682/2-1 e uma bolsa de pesquisa da Sociedade Alemã de Cardiologia para C. Erbel bem como uma bolsa de pesquisa do Serviço Acadêmico Alemão Heidelberg para L. Zhao.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium Gibco 21875-091
FCS Gibco 10270-106
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
15 ml Tube Sarstedt 62,554,502
Culture dish (60 mm) Orange Scientific 5550200
LPS Sigma L4516
Cell culture plates 48-well Greiner 677102
Scalpel - single use Feather FEA200130011
TissueLyser Precellys 24 Dual Cat. No. EQ03119.200.RD010.0
RNeasy (Mini) Kit  Qiagen Cat. No. 74104
Boehringer cDNA kit  Roche Diagnostics Cat. No. 11483188001
Nanodrop spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific

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References

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