Bir İnsan * These authors contributed equally

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ateroskleroz kronik inflamatuar bir süreçtir. Bu el yazması, taze karotid veya koroner arter plaklar araştırmak için ex vivo modeli kullanımı kolay bir göstermektedir. Ex vivo model çeşitli yöntemlerle analiz edilebilir, insan aterosklerotik lezyonlarda ve sonuçları inflamatuar ortam potansiyel maddelerin araştırılması için izin verir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erbel, C., Okuyucu, D., Akhavanpoor, M., Zhao, L., Wangler, S., Hakimi, M., Doesch, A., Dengler, T. J., Katus, H. A., Gleissner, C. A. A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology. J. Vis. Exp. (87), e50542, doi:10.3791/50542 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ateroskleroz damar kronik enflamatuar bir hastalığıdır. Aterosklerotik lezyonlarda enflamatuar bileşiği incelemek için çeşitli yöntemler vardır. Fare model aterogenezde enflamatuar süreçleri araştırmak için önemli bir araçtır, ancak bu modeller Kemirgen ve insan bağışıklık sistemi arasında bir fenotipik ve fonksiyonel farklılıklar muzdarip. In vitro deneyler, hücre özel olarak bir maddenin neden olduğu hücre tipine bağlı değişiklikleri değerlendirmek için kullanılır İlgi, ancak kültür bağımlı değişiklikler ve aterosklerotik lezyonlarda inflamatuar bileşik bağlamında özel moleküllerin etkisini analiz etmek için yetersizlik sonuçların etkilerini sınırlar. Buna ek olarak, insan kanı içinde ilgi konusu bir molekülün seviyelerinin ölçülmesi daha da klinik önemini araştırmak için yardımcı olur, ancak bu lokal ve sistemik olmayan iltihap temsil eder. Bu nedenle, biz burada insan aterosklerotik lezyon biyolojisi okumak için bir plak kültür modeli açıklamakex vivo. Kısacası, taze plaklar endarterektomi ya da koroner arter bypass hastalarında elde edilir ve kullanıma kadar buz üzerinde RPMI ortamında saklanır. Örnekler Bu tür sitokinler ya da kemokinler, tek başına ya da belirlenmiş zaman dönemleri için kombinasyon halinde ilgi konusu bir maddeye ek olarak RPMI ortamı ihtiva eden bir 48-çukurlu plaka içine rasgele dağılımı ile, ardından küçük parçalar halinde kesilir. İnkübasyondan sonra, plak parçalar şok, mRNA izolasyonu için dondurulabilir immünohistokimyasal boyanması için parafin ya da OCT içinde gömülü ya da ezilmiş ve western blot için lize edildi. Ayrıca hücreler, akış sitometrisi analizi için plaktan izole edilebilir. Buna ek olarak, yüzer maddeleri ELİSA ile protein ölçümleri için toplanabilir. Sonuç olarak, sunulan ex vivo model ayrıca yeni hastalık mekanizmaları ve terapötik hedeflerin tanımlanması neden olabilir enflamatuar lezyonlu biyoloji, çalışma imkanı açar.

Introduction

Kronik inflamatuar hastalık gibi Atherosclerosis sanayileşmiş ülkelerde 1-2 ölüm ana nedenlerinden biridir. Ateroskleroz, özellikle akut koroner sendromlar komplikasyonları, Aterotrombozu ve damar tıkanıklığı 3 neden, savunmasız lezyonlar yırtılması bağlantılı olmuştur. Doğal ve adaptif bağışıklık aterojenez 2,4-5 her aşamasında yer gibi görünüyor. Önemli bir ilerleme miyokard enfarktüsü tedavi, aterosklerozun önlenmesinde etkilidir ve olumsuz kardiyovasküler olaylar yapılmış olmasına rağmen hala çözülmemiş. Böylece, lezyonal biyoloji okuyan ateroskleroz patofizyolojisi üzerine bilgimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavi hedefleri ve yeni tedavilerin geliştirilmesi tanımlanmasına olanak sağlayacak.

Birçok durumda, kemirgen modelleri, belirli hastalıkların patofizyolojisi araştırmak için kullanılır. Ancak, fare modelleri kullanarak ateropatogenezi okuyan acco olduğunuçeşitli sınırlamalar tarafından mpanied: (1) Genellikle, aterosklerotik fareler yüksek kolesterol diyeti alırsınız. Bu modellerde kolesterol seviyelerinin yüksek kolesterol serum seviyeleri olan hastalarda 6 olanlar ile karşılaştırılamaz. (2) kemirgen ve insan bağışıklık sistemi arasında önemli farklılıklar vardır; İnsan T hücreleri, insan FOXP3 ifade mutlaka bir düzenleyici fenotipe 7 vermemektedir, oysa bu nedenle FOXP3, kemirgen düzenleyici T hücrelerinin belirli bir belirtecidir. Ayrıca, insanlarda tanımlandığı gibi Th1/Th2 paradigma murin T hücreleri tamamen transfer değildir. (3) bu tür genel F4/80 ve klasik (M1) markerleri olarak murin monositler ve makrofajlar tanımlamak için kullanılan marker bir dizi alternatif (M2) aktivasyon örüntüleri insan myeloid hücreleri 8 mevcut değildir. (4) Fare tipi kemirgen ve insan periferik kan monositleri gen ekspresyonu 9, büyük ölçüde farklı olduğu bulunmuştur.

Böylece, anlayışımızı ve arttırmak amacıylaİnsan aterosklerozda enflamatuar süreçler, insan doku, kan ya da hücreleri ile çalışma modelleri kullanmak gerekir. Burada, insan enflamatuar lezyonal biyoloji kavramı potansiyel yeni maddelerin araştırılması sağlar: insan plak doku kültürü, bir modeli açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki gibi 1. Ortamı hazırlayın

  1. Kültür Ortamı: RPMI ortamı.
  2. % 10 fetal buzağı serumu (FCS) ilave edin.
  3. 100 U / ml penisilin G ekleyin ve 100 g / mL streptomisin.

Kullanıma kadar taze plak silindirin 2. Saklama

  1. Önemli bir karotis arter darlığı olan (inme, geçici iskemik atak) veya iskemik belirti vermeden hastanın karotis endarterektomi operasyonu kalp cerrahları tarafından koroner arter bypass cerrahisi sırasında damar cerrahları ve koroner arter endarterektomi tarafından yapılacaktır. Karotis / koroner plaklar daha önce tarif edildiği gibi 5 plak yapısının korunması için en bloc kaldırılması gerekir.
  2. Plak ekstirpasyon yer sonra orta dolu tüp içinde örnek ve kullanıma kadar (plak tamamen ortamı ile kaplı olması gerekir) buz üzerinde saklayın.

3.. Plak işleme

  1. Yeterli hücre kültürü çanak (örneğin 60 mm) kullanınve 5 ml RPMI ortamı ekleyin.
  2. Kültür çanağı (plak tamamen ortamı ile kaplanmış olmalıdır) içine plak doku yerleştirin.
  3. Steril forseps kullanılarak doku kenarlarında dikkatlice plak doku tutun.
  4. Steril bir neşter kullanılarak plak numunenin kenarları kesti.
  5. Yarısında plak doku bölün.
  6. (Kalsifiye, lipid zengin, yırtılmış, trombüs, fibrozis) makroskopik lezyon morfolojisi değerlendirin.
  7. Immünohistokimyasal olarak ex vivo deney sonrasında kesin plak morfolojisini analiz. AHA sınıflandırma 10 kullanın.
  8. Şiddetli kalsifikasyon veya fibrozis ile plaklar atın.
  9. Homolog küçük parçalar (3 x 3 x 3 mm) içine plak doku kesilir.
  10. Iki plak adet dondurma şok ve lezyonun temel değerleri için sıvı azot içinde saklayın kullanıma kadar.
  11. , 48 oyuklu plaka hazırlanması.
  12. De Deney için kullanılan her bir 500 ul RPMI ortamı ekleyin.
  13. Kullanın lütfenHer bir grup için t az iki plak adettir.
  14. Faiz (örneğin özel sitokinler ve kemokinlerin) özünü ekleyin.
  15. Kontrol olarak uyarılmamış plak parçaları kullanarak.
  16. Rasgele kuyulara plak adet tahsis sayıda bitki.
  17. Belirtilen zaman noktalarında Kültür plak adettir.
  18. Lipopolisakkarit (LPS) ile plak doku uyarım deney için
    1. 3 saat, 8 saat ve 24 saat: aşağıdaki zaman noktalarında kullanın.
    2. Sırasıyla her zaman noktası için uyarılmamış grup için 2 plak LPS için parçaları ve ikisini kullanın.
    3. Lipopolisakarit 1 ug / ml ilave edilir.
  19. İnkübasyon sırasında,% 5 CO2 içeren nemli hava içinde 37 ° C'de 48-çukurlu plaka korumak.

4. Sonra belirtilen zaman hasat plak doku parçaları

  1. Detaylı bilgi proto-bakınız (mRNA izolasyonu ve cDNA sentezi için plak parçaları dondurarak Şokcol bölüm 5).
  2. Süpernatan toplamak ve ELISA analizi için -20 ° C'de saklanan o.
  3. Batı blot, şut ve plak dokusunu eritmek. 0.65 um ve 0.1 mikron santrifüj filtre cihazı aracılığıyla Lisatı filtre.
  4. Immünhistokimya boyamalar için doku-tec veya parafin plak doku gömün.

Kültür plaka adet 5. RNA ekstraksiyonu

  1. Homojenizasyon için bir TissueLyser kullanın.
  2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak kiti (malzemeler tabloya bakınız) kullanarak, RNA izole edilir.
  3. Spektrofotometre ile numunelerin RNA miktarını ve kalitesini belirler.
  4. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkripsiyon için Boehringer cDNA kiti kullanın.
  5. Nicel PCR için, örneğin SYBR Green ile Roche, gerçek zamanlı PCR kiti kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada ex vivo kültür plak sonuçları gösteren rakamlar bir dizi sunulmuştur. Ex vivo model deneyi ile ilgi ajana yanıt olarak inflamatuar ortam değişiklikleri değerlendirmek için, aterogenez in esas olarak ilgili olduğu bilinen farklı molekülleri ölçer. Temsilcisi pro-aterojenik sitokinler olarak biz TNFa'yı, Il6 ve IFNg 2,11 seçin. Buna ek olarak, ön-trombotik değişiklikleri değerlendirmek için von Willebrand faktörü ve doku faktörü kullanımı. Ayrıca, ilgi bir ajan tarafından uyarılan plak istikrarsızlık, matris metallopeptidase 9 (MMP9) düzeyleri analiz edilecektir gelişimini ele. Chemoattractance böylece, aynı zamanda monositler / makrofajlar için monosit kemotaktik protein-1 (MCP-1), temel kimyasal çekici olarak da adlandırılan CCL2 düzeylerini araştırmak, plak aynı zamanda ilerleme ve gerileme 11'de önemli bir adımdır. Hücre cazibe hücre haddeleme ve yapışma aşağıdaki adımlar sonra.Çünkü biz ICAM-1 seçin. Ayrıca, ilgi konusu madde ile etkilenen sinyalleme yolunu analiz ile biz hücre-dışı sinyal ile düzenlenen kinazları (ERK1 / 2), yaygın olarak ifade edilmiş ve bu sitokinler, apoptoz, farklılaşma, virüs enfeksiyonu ve heterotrimeric G proteini için ligandlar olarak çok farklı stimuli ile aktif hale kullanımı Reseptörler 12 çiftli.

İlk olarak, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) (Şekil 1) ile analiz uyarılmamış kültürlenmiş aterosklerotik lezyonların inflamatuar bileşiğinin zamana bağlı değişiklik göstermektedir. Plak kültür sırasında, enflamatuar lezyonal ortamın aktivitesinin bir artış gözlenmektedir. Hiçbir fark yok kültür (veriler gösterilmemiştir) vs 3 saat sonra bulundu. Plak kültür 8 saat sonra, 24 saat sonra, bir yukarı-regülasyonu var iken, ama TNF a ve IFN g, örneğin IL6 gibi bazı moleküllerin sadece hafif bir yukarı regülasyon bulunduTNF a, IL-6 ve IFN g gibi çeşitli moleküllerin. Özellikle, daha uzun plak kültürünün zaman daha yüksek molekül ifade varyasyon vardır.

İkinci olarak, aterosklerotik lezyonlarda inflamatuar ortam etkileyen uygulanabilirliğini göstermek için, QRT-PCR ile ölçülen, 3 saat boyunca 1 ug / ml LPS (Şekil 2) ile inkübe plak parçalarının sonuçlarını sunarlar. Stimüle edilmemiş plak parçaları bir negatif kontrol olarak görev yapmıştır . Bu LPS aterosklerotik lezyon içindeki enflamatuar bileşik aktivasyon derecesi belirgin bir artışa neden olduğu bulunmuştur. Çeşitli sitokinlerin (IL-6, TNF a, vb Şekil 2A-B), kemokinler (CCL2, vb gösterilmemiştir), yapışma (ICAM-1, gösterilmemiş olan), plak destabilize edici (Matrix MMP9 (9 metallopeptidase), gösterilmemiş olan) ve pro- trombotik moleküller (von Willebrand faktörü, Şekil 2C,

Üçüncü olarak, protein bolluk değerlendirmek, kültürlü lezyonların süpernatantları ELISA ile analiz ve batı (Şekil 3D) blot plak dokuları çökerttiğini. Şekil 3A-C olarak, IFN-g ELISA analizi, LPS ya da 8 saat boyunca kontrolü ile inkübe kültüre örneklerin süpernatanda MCP-1 ve TNF-a göstermektedir. Buna ek olarak, (fosforile edilmiş) ERK 1 / ezilmiş ve parçalanır plak dokuların 2 ya LPS ile uyarılmış veya kontrol için western blot analizi, Şekil 3D'de gösterilmektedir.

Şekil 1
Şekil 1.. Zamanla iltihap Lezyonel bileşik üzerinde plak kültürlemeden Etkisi. Aterosklerotik plak parçalar derhal şok edildi 8 için dondurulmuş veya kültürya da belirtilen sitokinler IL-6 (A), IFN g (B) ve TNF a (° C) 24 saat ve ifade QRT-PCR ile analiz edilmiştir. Gösterilen sonuçlar, beş bağımsız deneyin ortalamasını verir. Her grup için beş aterosklerotik lezyon adet belirtilen bir zaman noktası kullanılmıştır. Değerler b-aktin normalize ve cDNA kopya / 1,000 b-aktin kopya olarak ifade edilir. Sonuçlar kutu ortalama görüntüleme araziler ve 25 inci ve kutuları ve 10 inci ve bıyık gibi 90 inci yüzdelik olarak 75 inci yüzdelik olarak gösterilmiştir. *: P <0.01.

Şekil 2,
Çeşitli enflamatuvar moleküllerin bir artışa neden kültürlenmiş plak parçalarının Şekil 2,. LPS uyarımı. Plak adet 1 ug / ml LPS ile kuluçkalanmıştırya da, 3 saat boyunca uyarılmamış ve QRT-PCR ile analiz edilmiştir. Gösterilen sonuçlar, beş bağımsız deneyin ortalamasını verir. Her bir grup için iki adet kullanılmıştır. Değerler b-aktin normalize ve cDNA kopya / 1,000 b-aktin kopya olarak ifade edilir. Sonuçlar kutu ortalama görüntüleme araziler ve 25 inci ve kutuları ve 10 inci ve bıyık gibi 90 inci yüzdelik olarak 75 inci yüzdelik olarak gösterilmiştir. *: P <0.01.

Şekil 3,
Kültür plağının yüzer Şekil 3. Protein ifadesi. Sitokin Örnek ELISA ölçümleri IFN-g (A), TNF-a (B) ve 8 için LPS ile stimüle edilmemiş ya da muamele edilmiş plak parçalarının süpernatanda MCP-1 (C) saat gösterilir. Gösterilen sonuçlar, beş bağımsız experimen ortalamasını temsil ederts. Sonuçlar kutu ortalama görüntüleme araziler ve 25 inci ve kutuları ve 10 inci ve bıyık gibi 90 inci yüzdelik olarak 75 inci yüzdelik olarak gösterilmiştir. Buna ek olarak, LPS'nin (fosforile edilmiş) ERK 1/2 için temsili western lekeleme uyarılmış ya da 3 saat Şekil 3D'de gösterilmektedir sonra kültürlenmiş aterosklerotik lezyonlar kontrol eder. Telleri gibi ortalama + SEM görüntüleme sütun çubuk grafikler beş bağımsız deneyler ortalamasını temsil eder. *: P <0.01.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada aterosklerotik lezyon biyolojisi potansiyel alakalı maddelerin etkisini araştırmak için bir ex vivo plak kültür model sunuyoruz. Bu ex vivo yöntemin en önemli avantajı, enflamatuar hücreler ve hücre etkileşimi gibi iltihaplı yola ve insan aterosklerotik lezyonlar içinde cascades belirtilen maddelerin etkisini değerlendirmek için yeteneğidir. Çeşitli kullanılabilir yöntemleri (örneğin RT-PCR, western blot, immünhistokimya, akım sitometri, ELISA) aterosklerotik lezyon inflamasyon faiz maddenin etkisini kapsamlı bir analiz sağlamak için yardımcı olur.

Kemirgen aterosklerozun inflamatuar süreçler de aşırı ifade ilgi 11 belirli genleri veya eksik fare modelleri sayesinde de anlaşılmaktadır. Ancak, bulgular her zaman yakından insanlara 6-9,13 uymamaktadır. Aterosklerotik fareler genellikle patolojik yüksek Chol almakdiyet 6 esterol. Buna ek olarak, bu, insan ve fareler arasında bağışıklık sistemi önemli farklılıklar 7-9 gösterdiği bilinmektedir. Burada, Nießner et al. 14 ile gösterildiği gibi, insan aterosklerotik lezyonlarda enflamatuar bileşik üzerinde ilgi konusu bir maddenin etkisini incelemek sağlayan bir ex vivo kültür plak modeli mevcut. Ayrıca, çeşitli ek yöntemler kemirgen çalışmalara benzer bir plak kültür denemenin sonuçlarını analiz etmek için kullanılabilir. Bu nedenle, ex vivo model bazı durumlarda in vivo çalışmalarda sıçangillere değiştirmek için olasılığını açar ve insan biyoloji murin sistemi ve çeviri molekül teşvik eden bir farazi ateroskleroz arasında mükemmel bir köprü oluşturucu bir yöntem temsil edebilir.

Ateroskleroz için insan ex vivo model in vitro hücre deneyleri ile karşılaştırılabilir değildir. Hücre çizgileri kolayca depolanabilir ve kültürlendi, fakat edilebilir fenotip ve fuBirincil hücreleri nctionally özdeş değildir. Taze hücreler Normal kan çekilir ile elde edilebilir, ama bazen onları kültürü için çok zordur ve pek çok faktör kültür işlemine tabi tutulur. Buna ek olarak, in vitro hücre kültürü deneylerinde kullanılarak, aterosklerotik lezyonlarda enflamatuar bileşik üzerinde özel moleküllerin etkisini araştırmak için mümkün değildir. Böylece, in vitro deneyler insan biyolojisi araştırmalar için başlangıç ​​(öteleme) aşama için önemlidir, ancak daha fazla insan ateroskleroz, aterosklerotik lezyonların içindeki inflamatuar şelaleri ve yolunun özellikle hücresel etkileşimin ve etki kavramına ilgi molekülün rolünü analiz etmek için başarısız .

Monako ve diğ. Insan aterosklerotik dokusundan 15 izole hücrelerinin önemli bir kısa vadeli kültür sistemi kurulmuştur. Bunlar, kolajenaz, elastaz ve DNase I'inin bir enzimatik karışımı kullanılmıştır. Bu yöntem sağlar lesi incelenmesiyol analizi ve adenoviral vektörler ile gen transferi çalışmaları sinyalizasyon Önal hücre-hücre deneyleri,. Ama, bu enzimatik karışım hücreleri nasıl etkilediğini aktivasyon örneğin grad bilinmemektedir, vb Ayrıca yüzey markör ifade, bu deneylerin sonuçları, aterosklerotik lezyonların içindeki gerçek işleme spesifik olmadığını sorgulanabilir. Bundan başka, hücrelerin asıl yeri enzimatik karışımı ile imha edilecek ve kısa dönemli kültür sistemi, in vitro deneyler, hücre ile aynı sınırlamalara sahiptir.

Bir aterosklerotik lezyon içine, belirli bir hücre veya hücre popülasyonunun çalışmalar için, lazer yakalama mikro diseksiyon yöntemini kullanmak mümkündür. İlgilenilen hücre ya da hücre bileşik, bir kızıl ötesi veya UV-Laser ve RNA, DNA ya da protein analizi yapılabilir kullanarak doku kesip olacaktır. Lazer yakalama mikro diseksiyon, hücre yüzey reseptörü Expre hücrelere zarar vermiyorsalgılanması gibi yöntemin avantajı, bir aterosklerotik lezyon içine, bir hücre ya da ilgi konusu bir yerin analizidir. Ancak, bundan başka, in vitro çalışmalar gibi hücreleri değerlendirmek mümkün değildir.

Ex vivo model bulguları ölçmek ve analiz etmek mümkün yöntemlerin geniş bir etkisi altına. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu Nießner et al. 14 ile gösterildiği gibi, gen ekspresyonu seviyesini incelemek için RNA izolasyonu ve cDNA sentezi sonra yapılabilir. İmmünohistokimya aterosklerotik lezyon içindeki protein ifadesi ve hücre kanıtlayacaklarına amacıyla protein düzeyini değerlendirmek için kurulmuş bir araçtır. Western blotting sinyal yolları analiz etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir enzim çözeltisi içinde sindirim ile hücre izolasyonu daha fazla, örneğin bir hücre tipi, hücre alt tipleri ve aktivasyon derecesi analiz etmek için bir akış sitometri analizi gerçekleştirmek için fırsat açar. Ayrıca, sonra hücre izolasyonuspectratyping ayrıca T hücre reseptör değişkenliği analiz etmek için iyi bir yöntem temsil eder. Ayrıca, sindirim manyetik hücre izolasyonu daha sonra in vitro çalışmalar ya da mikro-dizi analizi için özel hücresel alt tiplerinin hücre ayırma kanıtlanmış bir yüksek kaliteli bir yöntem olup. Sonunda, süpernatantları ELISA ile protein ölçümü için toplanabilir. Sonuç olarak, ex vivo model insan aterosklerotik lezyonlarda inflamatuar ortamda kesin değişiklikleri araştırmak için değerli bir araçtır.

Ex vivo model endarterektomi örnekleri dayanmaktadır. Farklı bireylerden elde edilen aterosklerotik plaklar kullanarak diferansiyel bir hücresel bileşimin daha yüksek derecede ve ilgi genleri / proteinlerinin seviyelerinin bu şekilde daha fazla değişmesine neden olabilir. Inflamatuvar yanıt fibrosklerotik lesio belirgin düşük olduğundan Böylece, oldukça fibrosklerotik lezyonlar 10 daha lipid zengin veya komplike plak örnekleri kullanmak önemlidirns. Bu nedenle, kültür plak deneylerin sonuçlarını analiz etmeden önce, plak morfolojisinin değerlendirilmesi için büyük önem taşımaktadır.

Buna ek olarak, her bir numune, numune yağ damarları ve rüptüre plaklara bir nekrotik çekirdeğin geliştirilmesine yönelik başlangıç ​​endotel disfonksiyonu ve lipid birikimi aşama aterosklerotik lezyon gelişimi / ilerlemesi, farklı aşamaları içerir. Bu nedenle, plak doku heterojen en aza indirmek amacıyla, genellikle aterojenez erken adımları göstermektedir kenarları, kesmek gereklidir.

Bu kesim doku yaralanması tepkileri indükler göz ardı edilemez. Ama plak doku kültürü deneyleri olmayan kültürlenmiş plak dokulara kültürlenmiş plak dokuların benzer gen ekspresyon düzeyleri göstermiştir. Böylece, bu yöntem mevcut aterosklerotik lezyonlarda inflamatuar ortamı araştırmak için iyi bir araç olduğunu altını çiziyor.

KültürüPlak adet kadar bir günlük bir zaman süresi sınırlıdır. Plak doku bir günden fazla kültüre ise, dramatik sonuçlar artar varyasyon. Buna ek olarak, 3 gün sonra plak oluşumu ve morfoloji çöker.

Bu modeli uygularken akılda tutulması gereken sınırlamalar vardır. Ex vivo model aterosklerotik lezyonlarda inflamatuar ortamı çalışmak için iyi bir yöntemdir. Bununla birlikte, ana bileşenleri bu bağlamda eksik. Hiçbir hemodinamik özellikleri uygulanabilir ve sistemik etkileri tamamen eksik vardır. Buna ek olarak, bu yöntem ile kısa vadeli değişiklikleri araştırmak için mümkün olduğu, ancak, çünkü plak morfolojisinin çöküşünün uzun vadeli analiz yoksundur.

Sonuç olarak, biz burada insan aterosklerotik lezyon enflamasyon üzerindeki potansiyel yeni moleküllerin soruşturma ilgilenen araştırmacılar için yararlı olacak bir yöntem mevcut. Ex vivo plak culture modeli murin ve insan bağışıklık sistemi arasındaki farklar muzdarip yapar, ancak bize aterosklerotik lezyonların bağlamında hücresel etkileşimi analiz eder ve lokal enflamatuar kaskadlar lezyonlu ve yollar araştırmak için bir fırsat sunmaktadır olanağı verir. Burada anlatılan ex vivo plak kültür yöntemi kullanımı kolaydır ve tekrarlanabilir ve yeni hastalık mekanizmaları ve tedavi hedeflerini belirlemek ve doğrulamak için yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çatışma yok.

Acknowledgements

Biz mükemmel teknik yardım için Nadine Wambsganss teşekkür ederim. Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (DFG) ER 682/2-1 ve C. ERBEL için Kardiyoloji Alman Toplumu bir araştırma bursuyla yanı sıra L. Zhao Alman Akademik Hizmet Heidelberg bir araştırma bursuyla tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium Gibco 21875-091
FCS Gibco 10270-106
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
15 ml Tube Sarstedt 62,554,502
Culture dish (60 mm) Orange Scientific 5550200
LPS Sigma L4516
Cell culture plates 48-well Greiner 677102
Scalpel - single use Feather FEA200130011
TissueLyser Precellys 24 Dual Cat. No. EQ03119.200.RD010.0
RNeasy (Mini) Kit  Qiagen Cat. No. 74104
Boehringer cDNA kit  Roche Diagnostics Cat. No. 11483188001
Nanodrop spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  2. Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
  3. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
  4. Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
  5. Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
  6. Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
  7. Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
  8. Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
  9. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  10. Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
  11. Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
  12. Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
  13. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
  14. Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
  15. Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics