संश्लेषण, वितरण सेलुलर और

Chemistry

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Summary

प्रतिदीप्ति सेंसर जीवन विज्ञान के क्षेत्र में शक्तिशाली उपकरण हैं. यहाँ हम synthesize और जीवित कोशिकाओं में और vivo में पीएच मापने के लिए Dendrimer आधारित फ्लोरोसेंट सेंसर का उपयोग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन. वृक्ष के समान पाड़ सुधार संवेदन गुण के लिए अग्रणी संयुग्मित फ्लोरोसेंट रंगों के गुणों को बढ़ाता है.

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Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

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Abstract

फ्लोरोसेंट संकेतक का विकास जीवन विज्ञान के लिए एक क्रांति का प्रतिनिधित्व किया. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग और संवेदन क्षमताओं के साथ सिंथेटिक fluorophores उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान के साथ जैविक रूप से प्रासंगिक प्रजातियों के दृश्य की अनुमति दी. सिंथेटिक रंगों उनके उच्च tunability और measureable analytes की विस्तृत श्रृंखला के लिए विशेष रुचि धन्यवाद के हैं. हालांकि, इन अणुओं (गरीब विलेयता, लक्ष्यीकरण में कठिनाइयों, अक्सर कोई ratiometric इमेजिंग की अनुमति है) छोटे अणु व्यवहार से संबंधित कई सीमाएं पीड़ित हैं. इस काम में हम Dendrimer आधारित सेंसर का विकास शुरू करने और जीवित कोशिकाओं में और vivo में इन विट्रो में पीएच माप के लिए एक प्रक्रिया मौजूद है. हम उन्हें कई जैव चिकित्सा उपकरणों के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल पाड़ कर दिया है कि उनके कई वांछनीय गुणों (monodispersity, tunable गुण, multivalency) के लिए हमारे सेंसर के लिए आदर्श मंच के रूप में dendrimers चुनें. फ्लोरोसेंट पीएच के विकारdendrimer पाड़ के लिए संकेतक उनके संवेदन प्रदर्शन का एक वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया. विशेष रूप से dendrimers प्रदर्शनी सेल रिसाव, सुधार intracellular लक्ष्यीकरण और ratiometric माप की अनुमति कम कर दिया. ये उपन्यास सेंसर सफलतापूर्वक HELA कोशिकाओं में रहने वाले और माउस मस्तिष्क में vivo में पीएच मापने के लिए कार्यरत थे.

Introduction

विशिष्ट जैविक प्रासंगिक अणुओं लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट अणु का उपयोग पूरी तरह से हम जैविक प्रणालियों का अध्ययन का तरीका बदल गया है. Widefield और आजकल एक वास्तविक समय उच्च संकल्प जैविक प्रक्रियाओं के दृश्य और के लिए अनुमति दी confocal माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं में और vivo में इन विट्रो में जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे लोकप्रिय तकनीक में हैं. 1 एक प्रासंगिक सुधार प्रतिदीप्ति संकेतकों के विकास के द्वारा प्रस्तुत किया गया था , जिसका प्रतिदीप्ति एक विशिष्ट आणविक इकाई की एकाग्रता पर निर्भर है यानी रंगों. विशेष रूप से पीएच और कैल्शियम संकेतक कारण एच + और ​​सीए जीव विज्ञान में 2 + आयनों की भारी प्रासंगिकता को सेल शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन पर एक नाटकीय प्रभाव पड़ा. 2,3

Subcellular targeti में मैं) कठिनाइयों: हालांकि, वर्तमान संवेदन रंगों के सबसे कई आंतरिक सीमाओं जैसे उनके छोटे अणु व्यवहार से संबंधितएनजी, पानी और फलस्वरूप गरीब biocompatibility में द्वितीय) गरीब विलेयता;. और III) सेल रिसाव और लंबे समय चूक इमेजिंग क्षमता 4 के इस प्रकार कमी इसके अलावा, कई जांच के संकेत डाई एकाग्रता पर निर्भरता के लिए सही नहीं किया जा सकता है (गैर ratiometric इमेजिंग) और इसलिए, कोशिकाओं में या विवो में एक निरपेक्ष माप संभव नहीं है.

हमने हाल ही में एक dendrimer पाड़ पर संवेदन रंगों के संयोजन पर आधारित, इन सीमाओं को पार करने के लिए एक सरल और प्रभावी पद्धति का वर्णन किया. 5 Dendrimers जैविक अनुप्रयोगों के लिए बहुत आकर्षक गुणों के साथ monodisperse hyperbranched पॉलिमर हैं. विशेष रूप से 6 कई वृक्ष के समान आर्किटेक्चर विकसित और इस्तेमाल किया गया है दवा 7 और जीन डिलीवरी के लिए. 8 बहुत ही हाल ही में कई समूहों संवेदी उपकरणों के लिए पाड़ के रूप में इन अणुओं की क्षमता का पता लगाने के लिए शुरू कर दिया. 9,10,11

हम पहलेएनएचएस सक्रिय एस्टर के आधार पर अलग polyamidoamine की functionalization की दिशा में एक आसान सिंथेटिक मार्ग (PAMAM) scaffolds का वर्णन किया. 12 Conjugates केवल शुद्धि के रूप में डायलिसिस के माध्यम से एक भी कदम में प्राप्त किया जा सकता है. दिलचस्प बात यह है कि इस दृष्टिकोण को आसानी से वृक्ष के समान या polymeric scaffolds की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है. 13,14

मैं) एक पीएच सूचक (यानी fluorescein) और द्वितीय) एक पीएच स्वतंत्र फ्लोरोसेंट आधा भाग (यानी rhodamine): ratiometric इमेजिंग dendrimers प्राप्त करने के लिए डबल लेबल रंगों के दो सेट के साथ थे. यह हमें fluorescein और rhodamine के बीच अनुपात पीएच पर ही निर्भर है और कोई और अधिक जांच की एकाग्रता पर ही सही पीएच इमेजिंग प्रदर्शन करने की अनुमति दी. जीवन भर इन मापों एक ratiometric सुधार की जरूरत नहीं है जांच एकाग्रता पर निर्भर नहीं करता है के रूप में इस मुद्दे पर एक और दिलचस्प दृष्टिकोण जीवनकाल आधारित जांच का उपयोग. 15 का प्रतिनिधित्व करती है. हालांकि, lifEtime माप एक अधिक जटिल भूमिका निभाई सेटअप की आवश्यकता होती है और उनके अस्थायी समाधान इस तरह उनके संभावित अनुप्रयोगों सीमित तेजी से शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए उप इष्टतम है.

Intracellular इमेजिंग प्रदर्शन करने के क्रम में, जांच cytosol में प्लाज्मा झिल्ली भर में वितरित किए जाने की जरूरत है. Dendrimers की वजह से उनके आकार और hydrophilicity को पारगम्य झिल्ली नहीं कर रहे हैं, intracellular वितरण electroporation के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. व्यापक रूप से अभिकर्मक के लिए जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है कि इस तकनीक के माध्यम से, लेबल अणुओं को प्रभावी ढंग से उच्च गुणवत्ता इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए कोशिकाओं में दिया जा सकता है. बड़े अणुओं सीधे cytoplasm के लिए दिया जाता है इसके अलावा, electroporation के साथ dendrimer endocytosis से संबंधित जटिलताओं से बचा जा सकता है. Electroporation अलग dendrimers भी किसी भी विशिष्ट लक्षित अनुक्रम के अभाव में कोशिकाओं के अंदर अलग localizations पता चलता दिलचस्प के बाद. 5 यह passivई कारण ही dendrimer के भौतिक गुणों को निशाना, organelle विशेष पीएच इमेजिंग प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Ratiometric इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है. Covalently वृक्ष के समान पाड़ संयुग्मित fluorescein और rhodamine, अलग imaged थे और एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल अनुपात नक्शा बनाया गया था. Ionophores के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में intracellular पीएच को नियंत्रित करने के लिए कई प्रक्रियाओं की सूचना मिली. Ionophores प्लाज्मा झिल्ली भर आयनों परिवहन करने में सक्षम छोटे हाइड्रोफोबिक अणु होते हैं, एच + आयन के लिए ionophores, ऐसे nigericin के रूप में उपलब्ध हैं, और Dendrimer आधारित सेंसर जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 16 इन मापों मनाया क्या करने के लिए इसी पीएच को एक रेखीय प्रतिक्रिया का पता चला. इन विट्रो में. अंशांकन intracellular पीएच के आधार पर सही मापा जा सकता है. इन मापों Dendrimer आधारित सेंसर अध्ययन एच + homeost में एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है कि प्रदर्शनASIS जीवित कोशिकाओं और रोग प्रक्रियाओं में पीएच विनियमन malfunctions शामिल है.

हमने हाल ही में Dendrimer आधारित पीएच सेंसर भी anesthetized चूहों के मस्तिष्क में पीएच इमेजिंग प्रदर्शन, विवो में लागू किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया. 17 कारण विवो संवेदन में एक उच्च गुणवत्ता वाले तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है जीवित ऊतकों की जटिल पर्यावरण के लिए. यहाँ हम मस्तिष्क में एक सटीक पीएच इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए संबोधित किया जाना महत्वपूर्ण मुद्दों के जोर देने के साथ vivo में पीएच इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का विस्तृत विवरण दिखा. दो photon माइक्रोस्कोपी दो मुख्य कारणों के लिए नियोजित किया गया है: मैं) अवरक्त प्रकाश का उपयोग मानक confocal माइक्रोस्कोपी के ऊतक प्रवेश की कमी को दूर करने के लिए अनुमति देता है; द्वितीय) fluorescein और rhodamine की व्यापक दो photon अवशोषण उनके साथ उत्तेजना से बचने की अनुमति उत्तेजना के लिए दो तरंग दैर्ध्य के उपयोग से संबंधित जटिलताओं. माउस मस्तिष्क में पीएच माप थेसफलतापूर्वक बाहर किया, सेंसर आसानी मस्तिष्क बाह्य अंतरिक्ष में पीएच के परिवर्तन के लिए प्रेरित हाइपोक्सिया का जवाब. इन मापों Dendrimer आधारित संकेतक सफलतापूर्वक एक पशु मॉडल में vivo में पीएच की शारीरिक और रोग परिवर्तन को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है.

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Protocol

1. सेंसर का संश्लेषण

  1. निम्न भाग में हम PAMAM dendrimers पीएच संकेतक के संयोजन के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करते हैं. एक ही प्रोटोकॉल वैकल्पिक amine असर dendrimers को न्यूनतम संशोधन के साथ लागू किया जा सकता है. 5,17,13,14 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dendrimers और रंजक आगे purifications बिना इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. निर्जल DMSO (50 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) में dendrimer भंग. निर्जल DMSO में fluorescein एन एच एस और tetramethyl-rhodamine-एनएचएस (TMR) के 10mM शेयर समाधान तैयार करें.
  3. Dendrimer समाधान के लिए fluorescein और TMR के वांछित राशि जोड़ें. मिश्रण में दाढ़ अनुपात dendrimer पर लोड रंगों की राशि को प्रतिबिंबित करेगा. आम तौर पर एक microcentrifuge ट्यूब में जी -4 PAMAM dendrimer समाधान के 1 एमएल fluorescein के 8 EQ (40 μl) और TMR के 8 EQ (40 μl) के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है. 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर समाधान हिलाओ.
  4. विआयनीकृत पानी के साथ 01:10 पतला और प्रतिक्रिया लोडएक डायलिसिस बैग (MWCO = 10 केडीए) में मिश्रण. जलाशय में अक्सर पानी की जगह विआयनीकृत पानी के खिलाफ 24 घंटे के लिए dialyze.
  5. एक शीशी का हल स्थानांतरण और फ्रीज सूखे 24 घंटा के लिए. एक बैंगनी पाउडर प्राप्त किया जाना चाहिए. वजन ठोस प्राप्त और 10 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में milliQ पानी में भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान और दुकान विभाज्य

2. इन विट्रो पीएच माप

  1. इन विट्रो जांच के लिए एक क्वार्ट्ज क्युवेट में पीबीएस में dendrimer की एक समाधान 500nm (2 मिमी फॉस्फेट) तैयार करते हैं. अनुमापन दौरान पीएच का आकस्मिक परिवर्तन से बचने के लिए एक बहुत ही पतला पीबीएस बफर (2 मिमी) के उपयोग की सिफारिश की है.
  2. Fluorescein के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (exc 488 एनएम) और TMR (exc 550 एनएम) को मापने और एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात को प्राप्त करने के लिए fluorimeter की ऑप्टिकल सेटिंग्स का अनुकूलन.
  3. हर अलावा क्युवेट मिलाने के बाद NaOH 0.1 एन और एचसीएल 0.1 एन की छोटी मात्रा में जोड़कर एक पीएच अनुमापन प्रदर्शन करनामिक्सिंग के लिए, संतुलन के लिए 1 मिनट प्रतीक्षा करें और एक पीएच microelectrode के माध्यम से पीएच उपाय. Fluorescein और TMR के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ऑप्टिकल सेटिंग में किसी भी बदलाव के बिना हर कदम के लिए दर्ज किया जाना चाहिए.
  4. अनुमापन के लिए पीएच बनाम प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लॉट. rhodamine संकेत पीएच (<10%) से अप्रभावित किया जाना चाहिए. fluorescein संकेत एक sigmoidal वक्र होना चाहिए और पी = 6.4 के साथ एक एकल बंधन मॉडल के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए.

3. सेल संस्कृति और electroporation

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen) के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में HELA कोशिकाओं खेती. एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति रखें.
  2. Dendrimer electroporation के लिए, कोशिकाओं मिला हुआ हैं, जब मीडिया को हटाने और DPBS (Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा) का उपयोग कोशिकाओं धो लो. DPBS निकालें और trypsin-EDTA जोड़ें. Tryp बेअसरमध्यम युक्त सीरम लेकिन नहीं एंटीबायोटिक दवाओं जोड़कर पाप. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 900-1,200 rpm पर अपकेंद्रित्र. मीडिया निकालें और DPBS का उपयोग छर्रों कुल्ला.
  3. कक्षों की गणना और 4 * 10 6 कोशिकाओं ले. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1,200-1,500 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  4. (Microporator निर्माता द्वारा प्रदान की) microporation बफर के 200 μl में सेल गोली Resuspend और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण.
  5. Resuspended कोशिकाओं में dendrimer जलीय घोल जोड़ें. नमूना प्रति अपेक्षित dendrimer की राशि PAMAM प्रकार (cationic और तटस्थ dendrimers के लिए 2 माइक्रोन के लिए आम तौर पर 250 एनएम) पर निर्भर है.
  6. एक microporation ट्यूब में (microporator निर्माता द्वारा प्रदान की) electroporation बफर जोड़ें. 100 μl मात्रा आकार की electroporation टिप के साथ कोशिकाओं और dendrimers मिश्रण पिपेट. पिपेट स्टेशन में microporator पिपेट डालें. Microporation के लिए नाड़ी शर्त सेट: पल्स वोल्टेज = 1005 वी, नाड़ी widवें 35 मिसे =; पल्स संख्या = 2.
  7. 1,200 rpm पर 5 मिनट के लिए एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को नाड़ी कोशिकाओं स्थानांतरण माध्यम में dendrimer से अधिक दूर करने के बाद. ताजा माध्यम के साथ प्लेट 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन पर electroporated कोशिकाओं के 10 μl (WILLCO पकवान GWSt-3522) डब्ल्यू / एंटीबायोटिक दवाओं ओ.

4. लिविंग HELA कोशिकाओं में पीएच सेंसिंग

  1. Electroporation के बाद एक confocal खुर्दबीन 12 घंटा के साथ छवि कोशिकाओं.
  2. Fluorescein और rhodamine के लिए मानक फिल्टर सेट किया जा सकता है. 550 एनएम और 580 एनएम से 650 एनएम के लिए एक लाल चैनल - ट्यून करने योग्य फिल्टर 500 से एक ग्रीन चैनल उपलब्ध सेट कर रहे हैं. Rhodamine या तो 543nm या 561 लेजर लाइन के साथ imaged किया जा सकता है, जबकि 488nm पर उत्तेजना fluorescein के लिए इष्टतम है.
  3. नमूना पर ध्यान दें और लेज़रों शक्ति को समायोजित करने और डिटेक्टरों संकेत करने वाली शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए प्राप्त करें. Electroporation था तो सफल कोशिकाओं दोनों चैनलों में चमकीले फ्लोरोसेंट होना चाहिए.स्थानीयकरण इस्तेमाल किया dendrimer के आकार और आरोप पर निर्भर करता है. अक्सर कुछ lysosomal स्थानीयकरण (छोटे perinuclear vesicles) के कारण endocytosis या compartmentalization के लिए मौजूद है. Lysosomal स्थानीयकरण प्रबल है, यानी प्रतिदीप्ति की सबसे पुटिका के अंदर ही सीमित नहीं है और गरीब संकेत cytosol में मनाया जाता है, इस का प्रतीक है विषाक्तता और माप खारिज किया जाना चाहिए. अधिग्रहण कई छवियों यदि आवश्यक हो तो, क्रमिक रूप से दो चैनलों के अधिग्रहण और छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए छवियों औसत.
  4. अंशांकन दबाना सेल पीएच अलग पीएच पर ionophores साथ buffers का उपयोग और ऊपर वर्णित के रूप में पीएच के अनुसार कम से कम 20 कोशिकाओं के अधिग्रहण के लिए. प्रक्रिया का विस्तृत विवरण और buffers की रचना के लिए Bizzarri और सहकर्मियों को देखें. 16 हम = पीएच 5.5 से पीएच = 7.5 कम से कम 5 अंक को मापने के लिए सुझाव देते हैं. 6 नीचे पीएच कोशिकाओं को विषाक्त लेकिन समय की छोटी राशि के लिए सहन कर रहे हैं, हम यथासंभव जल्दी छवियों को प्राप्त करने के लिए सुझाव देते हैं. यदि कोशिकाओंapoptosis के लक्षण दिखाना है, कोशिकाओं को त्यागें और पुनः आरंभ.
  5. ImageJ या डेटा विश्लेषण के लिए अनुरूप सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. हरे और लाल चैनल की छवियाँ आयात, पृष्ठभूमि घटाना और उपकरण "छवि कैलकुलेटर" के साथ पिक्सेल अनुपात इमेजिंग द्वारा एक पिक्सेल बना.
  6. वांछित कक्ष का चयन ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र ड्रा और intracellular हरे से लाल अनुपात को मापने. का अधिग्रहण सभी छवियों का विश्लेषण और फिर पीएच बनाम अनुपात साजिश है. 5.5-7.5 रेंज में प्रवृत्ति रैखिक होना चाहिए. प्राप्त अंक के रेखीय फिट पीएच को हरी करने वाली लाल अनुपात कन्वर्ट करने के लिए उपयोग किया जाएगा जो अंशांकन वक्र दे देंगे.
  7. आगे नियंत्रण के रूप में कई अनुपचारित कोशिकाओं (कोई ionophores) हासिल करने और प्राप्त अंशांकन वक्र के साथ पीएच गणना करने के लिए प्रयास करें. 7.2 और 7.4 के बीच का मान प्राप्त किया जाना चाहिए.

5. में Vivo नमूना तैयार

  1. प्रयोगों प्रसव के बाद डी के बीच C57BL/6J (पुरुषों और महिलाओं) पर प्रदर्शन किया गयाप्र 28 और 70. Urethane की intraperitoneal इंजेक्शन (यानी एथिल carbamate) (20% शारीरिक खारा में w / वी, 20 मिलीग्राम / किग्रा urethane) के साथ माउस anesthetized. पशु एक ही संवेदनाहारी की एक intracardiac इंजेक्शन द्वारा पीछा urethane की अधिक मात्रा के साथ प्रयोग के बाद बलिदान किया गया.
  2. सर्जरी के दौरान cortical तनाव प्रतिक्रिया और मस्तिष्क edema कम करने के लिए dexamethasone सोडियम फास्फेट (2 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन प्रदर्शन.
  3. पशु के सिर दाढ़ी और सिर को 2.5% lidocaine जेल लागू होते हैं.
  4. दोनों गोलार्द्धों की खोपड़ी को कवर त्वचा का फ्लैप कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें
  5. नमक के साथ संपर्क में हड्डी धो लें और धीरे संदंश का उपयोग periosteum हटा दें. इस गोंद और साथ पालन करने के लिए दंत सीमेंट के लिए एक बेहतर आधार प्रदान करेगा.
  6. एक केंद्रीय इमेजिंग चैम्बर के साथ एक कस्टम निर्मित इस्पात सिर डाक लागू करें और एक विमान में cyanoacrylate साथ गोंद यह लगभग मैं के cortical क्षेत्र पर खोपड़ी के साथ समानांतरnterest और सफेद दंत सीमेंट (Paladur) के साथ जगह में यह तय कर लो.
  7. हित के क्षेत्र के ऊपर drilled व्यास में 2-3 मिमी की कपाल - उच्छेदन प्रदर्शन करने के क्रम में माउस के सिर को ठीक करें.
  8. सर्जरी, dural आँसू, या रक्तस्राव के दौरान प्रांतस्था के ताप को कम करने की कोशिश करें.
  9. बाँझ ACSF (126 मिमी NaCl, 3 मिमी KCl, 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 1.3 मिमी MgSO 4, 26 मिमी 3 NaHCO, 2.4 मिमी 2 CaCl साथ superfused प्रांतस्था रखें, 15 मिमी ग्लूकोज, 1.2 मिमी HEPES आसुत एच 2 हे , पीएच = 7.4).

6. माउस मस्तिष्क में पीएच इमेजिंग

  1. 2 समृद्ध हवा उपलब्ध कराने के प्रयोग सहायता पशु श्वसन के दौरान. आक्सीजन 80% तक समृद्ध है. ओ 2 आंशिक दबाव और प्रवाह अक्सर एक उचित श्वसन सहायता प्राप्त करने के लिए निकाला जाता है. एक प्रतिक्रिया नियंत्रित हीटिंग कंबल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान स्थिर रखें.
  2. एक दो फोटो के उद्देश्य के तहत इस्पात के बाद के माध्यम से पशु फिक्सn इमेजिंग सेटअप.
  3. मस्तिष्क प्रांतस्था में सेंसर इंजेक्षन करने के क्रम में dendrimer समाधान (1 माइक्रोन) के साथ एक AgCl इलेक्ट्रोड (टिप व्यास 4 मिमी) से युक्त एक गिलास विंदुक लोड. इलेक्ट्रोड बाह्य क्षेत्र क्षमता रिकॉर्ड करने की अनुमति देगा.
  4. एक microinjection सेटअप के साथ लगभग 150 मीटर की गहराई पर प्रांतस्था में पिपेट डालें. 0.5 साई के दबाव में 1-2 मिनट के लिए इंजेक्षन.
  5. इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल सेटअप का अनुकूलन. लेजर शक्ति photobleaching और photodamage कम करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. नियोजित आमतौर पर लेजर बिजली पिछले calibrations इस वोल्टेज सबसे अच्छा एस / एन अनुपात देता है पता चला है कि बाद मेगावाट और PMT लाभ 667 वी पर स्थिर रखा गया था लगभग 20 है.
  6. इमेजिंग के लिए 820 एनएम पर सेंसर उत्तेजित और मानक FITC और TRITC फिल्टर के माध्यम से fluorescein और rhodamine प्रतिदीप्ति एक साथ पता लगाने.
  7. समय के लिए हल माप 2 हर्ट्ज पर समय व्यतीत श्रृंखला के अधिग्रहण.
  8. पृष्ठभूमि सुधार लेस के साथ एक काले फ्रेम के अधिग्रहण के लिएआर शटर आमतौर पर इलेक्ट्रॉनिक्स द्वारा जोड़ा PMTs और पीठ में उत्पन्न होने वाली मतलब थर्मल शोर को मापने के लिए बंद कर दिया.
  9. डेटा विश्लेषण के लिए धारा 4 की रिपोर्ट में एक ही प्रक्रिया का पालन करें.

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Representative Results

चित्रा 1 अलग वृक्ष के समान scaffolds के लिए रंगों संवेदन के विकार का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है. परिणामस्वरूप संकेतक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों से एक आसान सिंथेटिक चरण में प्राप्त किया जा सकता है. Amine असर dendrimers DMSO में एनएचएस सक्रिय रंगों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की और डायलिसिस से शुद्ध कर रहे हैं. यह सामान्य प्रक्रिया पहले से ही सफलतापूर्वक कई dendrimers की लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है: मैं) PAMAM dendrimer पीढ़ी 2, 4 और 6, 12 pegylated PAMAM dendrimers 17 और खूंटी वृक्ष के समान संकर 18. अलग dendrimers कोशिकाओं और ऊतकों (स्थानीयकरण, विषाक्तता, पारगम्यता, प्रसार) के साथ अलग अलग बातचीत दिखाने के रूप में वृक्ष के समान संरचना का चयन दृढ़ता से वांछित आवेदन करने के लिए और ब्याज का नमूना से संबंधित है.

मैं) पीएच संकेतकों और के रूप में आंतरिक संदर्भ अभिनय द्वितीय) पीएच असंवेदनशील moieties: सेंसर फ्लोरोसेंट रंगों के दो सेट शामिल है. Although संकेतकों और संदर्भ की एक विशाल विविधता के लिए सबसे अच्छा परिणाम fluorescein और tetramethylrhodamine साथ प्राप्त किया गया है, उपलब्ध हैं. दो रंगों के अनुपात प्रतिक्रिया में अलग दाढ़ समकक्ष का उपयोग कर बस देखते जा सकता है. 2 आंकड़ा एक पीएच सेंसर की एक ठेठ में इन विट्रो अनुमापन से पता चलता है. Fluorescein और rhodamine अलग दो चैनलों के बीच कम से कम पार से बात की इजाजत दी, क्रमशः, 488nm और 550nm पर उत्साहित किया जा सकता है. स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है rhodamine (2A चित्रा) संकेत शारीरिक पीएच रेंज में काफी परिवर्तन नहीं करता है, जबकि fluorescein (2A चित्रा) एक पीएच निर्भर व्यवहार को दर्शाता है. इसलिए, इन दो संकेतों के अनुपात सेंसर एकाग्रता पर लेकिन केवल पीएच पर निर्भर नहीं करता है. Intracellular जांच एकाग्रता से नियंत्रित नहीं किया जा सकता क्योंकि यह एकाग्रता स्वतंत्रता जैविक मापन के लिए बहुत महत्व का हो जाएगा.

जीवित कोशिकाओं माप के लिए intrवृक्ष के समान सेंसर की अकोशिकीय वितरण electroporation के माध्यम से हासिल की है. इस तकनीक का व्यापक रूप से डीएनए अभिकर्मक के लिए जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है और निर्माता प्रोटोकॉल पर कम से कम बदलाव के साथ लागू किया जा सकता है. Electroporation के माध्यम से, अणुओं endocytosis की vesicular प्रणाली से संबंधित किसी भी जटिलता से बचने, कोशिका द्रव्य को सीधे दिया जा सकता है. चित्रा 3a dendrimer सेंसर के साथ electroporated HELA कोशिकाओं के confocal छवियों से पता चलता है. दोनों fluorescein में एक मजबूत संकेत (बाएं हरे,) और rhodamine (लाल, मध्य) मनाया जाता है. दो संकेतों पूरी तरह से सेंसर संरचना की अखंडता का प्रदर्शन colocalize. एक ratiometric मानचित्र (सही, चित्रा 3 ए) पिक्सेल पिक्सेल द्वारा और एक pseudocolor पैमाने के साथ प्रतिनिधित्व दो छवियों को विभाजित करके खंगाला है. पीएच clamping ionophores साथ कोशिकाओं के अंदर सेंसर प्रतिक्रिया जांचना के क्रम में, प्रदर्शन किया गया था. Ionophores साथ अंशांकन एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल, seve हैRAL प्रोटोकॉल संशोधनों के बिना बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है और किया जा सकता है. चित्रा 3 बी में दिखाया गया के रूप में 19 संकेतक आसानी से हरे से लाल अनुपात का एक परिवर्तन के साथ पीएच का जवाब. यह हमें सही पीएच माप के लिए एक अंशांकन वक्र (चित्रा -3 सी) प्राप्त करने के लिए अनुमति दी. अंशांकन में रेखीय प्रवृत्ति सेलुलर पर्यावरण से किसी भी गड़बड़ी के बिना पीएच के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए सेंसर की क्षमता को दर्शाता है. अंशांकन वक्र क्रमशः, कोशिका द्रव्य और लाइसोसोम के लिए 7.4 पीएच होने के लिए HELA कोशिकाओं जीने का मूल्य और 4.8 निर्धारित किया गया है. इन परिणामों साहित्य के साथ अच्छे समझौते में हैं.

अंत में, हम Dendrimer आधारित सेंसर में vivo इमेजिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है कि कैसे पता चला. Dendrimers व्यापक रूप से इस्तेमाल कैल्शियम संकेतकों के लिए बहुत समान प्रक्रिया के साथ ऊतकों के माध्यम से आसानी से इंजेक्ट किया जा सकता है. 20 बार ऊतक में, संकेतक allowin, बहुत धीरे फैलानापूरा ऊतक जल निकासी से पहले जी दीर्घकालिक इमेजिंग. ठेठ परिणाम चित्रा 4 में दिखाया गया. Fluorescein (हरा) और rhodamine (लाल) संकेत एक साथ 820 एनएम उत्तेजना के साथ प्राप्त किया गया है और अनुपात का नक्शा एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल आधार पर बनाया गया था, कोशिकाओं माप रहने के लिए इसी तरह की. विशेष रूप से, संकेतक बाह्य अंतरिक्ष में स्थानीयकरण, छवि में गैर फ्लोरोसेंट क्षेत्रों सेलुलर निकायों या छोटे रक्त वाहिकाओं की पहचान. पीएच को सेंसर प्रतिक्रिया सत्यापित करने के लिए, हम hypercapnia के उपयोग का प्रस्ताव रखा. दरअसल, कार्बन डाइऑक्साइड के ऊतकों की एक अम्लीकरण, जिसके परिणामस्वरूप रक्त और ऊतकों में कार्बोनेट buffers के संतुलनों को बदलने के लिए जाना जाता है. 21 के रूप में चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, 30% सीओ 2 की साँस लेना के एक मजबूत प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है माउस के फिर से वेंटिलेशन पर पूरी तरह से प्रतिवर्ती है कि सेंसर. इन परिणामों को उजागर करने के लिए Dendrimer आधारित सेंसर की क्षमता प्रदर्शित शारीरिक और देहातजीवित कोशिकाओं में और vivo में पीएच की thological परिवर्तन.

चित्रा 1
चित्रा 1. Dendrimer आधारित सेंसर Dendrimer आधारित पीएच सेंसर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व का संश्लेषण. उसी प्रक्रिया लगभग हर amine असर dendrimer (बाएं) के लिए आवेदन किया जा सकता है. उत्पाद डायलिसिस के बाद एक विकार प्रतिक्रिया के माध्यम से प्राप्त हुई थी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
एक Dendrimer आधारित सेंसर के लिए चित्रा 2. इन विट्रो पीएच अनुमापन. एक) पीएच सूचक fluorescein की प्रतिक्रिया और बी) मैंnternal संदर्भ, rhodamine, शारीरिक पीएच सीमा पर कोई परिवर्तन नहीं दिखा.

चित्रा 3
चित्रा 3. HELA कोशिकाओं में रहने वाले पीएच इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम. fluorescein चैनल (बाएं), rhodamine चैनल (मध्य) और पीएच ratiometric मानचित्र (दाएं) ionophores अलग पीएच पर clamped कोशिकाओं की. ग) प्रतिनिधि ratiometric नक्शे के साथ. ख) पीएच अंशांकन की एक) confocal इमेजिंग. . एट अल Albertazzi एल, BRONDI एम, पवन जीएम, सातो एस एस, से Reproduced (2011) Dendrimer आधारित फ्लोरोसेंट संकेतक:.. इन विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में एक PLoS 6 (12), e28450. Doi: 10.1371/journal.pone.0028450

चित्रा 4
चित्रा 4. में पीएच इमेजिंगanesthetized माउस के मस्तिष्क. एक), हरे और लाल चैनल (820 एनएम पर एक साथ उत्साहित) और पीएच ratiometric नक्शा. ख) hypercapnia को सेंसर की सामान्य प्रतिक्रिया (30% सीओ 2). . एट अल Albertazzi एल, BRONDI एम, पवन जीएम, सातो एस एस, से Reproduced (2011) Dendrimer आधारित फ्लोरोसेंट संकेतक:: से अनुकूलित.. इन विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में एक PLoS 6 (12), e28450. Doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

Dendrimer आधारित सेंसर के साथ सफल पीएच इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: मैं) सही वृक्ष के समान पाड़ का चयन और यह संयुग्मित संकेतक की संख्या और कोशिकाओं में या विवो में सेंसर वितरण प्रोटोकॉल के द्वितीय) अनुकूलन.

कृत्रिम प्रक्रिया काफी आसान है और हर amine असर hyperbranched बहुलक वस्तुतः लागू किया जा सकता है. सेंसर एक भी कदम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dendrimers और एनएचएस सक्रिय रंगों से प्राप्त किया जा सकता है. हम इस मॉड्यूलर और सरल प्रक्रिया जैविक सवालों की एक किस्म के लिए इस तरह के सेंसर के आगे आवेदन के लिए फायदेमंद हो जाएगा. शोधन प्रभावी ढंग से unconjugated रंगों को दूर करने के लिए डायलिसिस के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. वृक्ष के समान पाड़ का चयन महत्वपूर्ण है और वांछित विशिष्ट आवेदन पर निर्भर करता है. अलग dendrimers के साथ विशेष बातचीत के कारण कोशिकाओं के अंदर अजीब localizations के लिए दिखाया गया हैubcellular संरचनाओं. तटस्थ dendrimers (उदाहरण के लिए PAMAM जी -4 acetylated) कोशिकाओं के अंदर किसी भी बातचीत दिखा और एक फैलाना स्थानीयकरण नहीं दिखाते. इस प्रकार वे एक पूरे सेल इमेजिंग के लिए एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके विपरीत सकारात्मक नकारात्मक विशिष्ट सेलुलर स्थानीयकरण में जिसके परिणामस्वरूप biomolecules (यानी आरएनए) का आरोप लगाया साथ (जी 2 से G6 के लिए) प्रदर्शन बातचीत electrostatic अलग पीढ़ियों के dendrimers का आरोप लगाया. Cationic dendrimers organelle विशेष इमेजिंग के लिए इस प्रकार आदर्श होते हैं.

संवेदन रंगों का चुनाव महत्वपूर्ण है. अलग रंग उत्सर्जन और एच + आत्मीयता (पी) के साथ कई पीएच संकेतकों और पीएच असंवेदनशील रंगों में उपलब्ध हैं. हमने कई अलग अलग डाई संयोजन की कोशिश की है और सबसे अच्छा परिणाम fluorescein और tetramethylrhodamine साथ प्राप्त किया गया. यह जोड़ी शारीरिक सीमा (पी = 6.4) में पीएच के लिए एक अच्छी प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं और आमतौर पर इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी फिल्टर setups के साथ संगत है. माप जैसे विभिन्न आवश्यकताओं के लिएविभिन्न पीएच रेंज में है, कुछ अनुकूलन आवश्यक हो सकता है. विशेष रूप से, नहीं सभी संकेतकों dendrimer विकार पर उनके गुणों (चमक, पी) को बनाए रखने के 5 यह व्यवहार दोनों डाई और dendrimer ढांचे पर निर्भर करता है;. हालांकि, हम संकेतकों के photophysical गुण काफी प्रभावित नहीं हैं, जहां कई संकेतक रिपोर्ट करने में सक्षम थे. यह हम dendrimer डाई बातचीत को कम करने के क्रम में एक linker के माध्यम से रंगों conjugating का सुझाव मामला है 17 है. कई प्रतिक्रियाशील रंगों का इस्तेमाल किया जा सकता है alkyl स्पेसर 22 या वैकल्पिक खूंटी linkers में साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. इसके अलावा संकेतकों की संख्या और पाड़ पर अनुपात संकेतक करने वाली संदर्भ रंगों महत्वपूर्ण है. आदर्श अनुपात इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी सेटअप के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता पर और ब्याज 5,17 की जैविक नमूना पर निर्भर करता है. कुछ समस्या निवारण की जरूरत हो सकता है, बहुत आसान है और तेजी से सिंथेटिक प्रक्रिया बहुत प्रक्रिया में मदद करेगा. अंत मेंdendrimer की functionalization की डिग्री, रंग संयुग्मित रहे हैं कि dendrimer के अंत समूहों का प्रतिशत यानी, संकेतक के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है. हम के बारे में 10% dendrimer अंत समूहों के -20% functionalizing सुझाव है कि किसी भी घुलनशीलता समस्या से बचने के लिए. घुलनशीलता को खूंटी योगदान की वजह से हालांकि pegylated dendrimers, के मामले में, एक पूरा functionalization प्राप्त किया जा सकता है. यह भी झल्लाहट और संयुग्मित रंगों के बीच अन्य शमन घटना की अवांछित उपस्थिति सीमित कर सकते हैं.

Dendrimers सेल पारगम्य नहीं कर रहे हैं, लेकिन intracellular वितरण electroporation के माध्यम से हासिल किया जा सकता है. हम आगे संशोधनों के बिना ब्याज की सेल लाइन के लिए डीएनए अभिकर्मक निर्माता प्रोटोकॉल कार्यरत हैं. एक महत्वपूर्ण पैरामीटर electroporation बफर में dendrimer की एकाग्रता है, गरीब चमक या उच्च सांद्रता में कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है कि dendrimers साथ संकेतकों के मामले में विशेष रूप से. कम conceउच्च सांद्रता विषाक्तता का कारण है और कोशिका मृत्यु को उत्पन्न होगा, जबकि dendrimer की ntrations कोशिकाओं के अंदर गरीब संकेत में परिणाम होगा. आदर्श एकाग्रता dendrimer / सूचक जोड़ी पर साथ ही साथ उपलब्ध इमेजिंग स्थापना पर निर्भर करता है और कुछ अनुकूलन की जरूरत हो सकती है. एक electroporator प्रयोगशाला में उपलब्ध नहीं है, तो microinjection एक मान्य विकल्प का प्रतिनिधित्व करेगा. बहरहाल, यह एक एकल कोशिका तकनीक है और imaged कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या के अधिग्रहण अधिक श्रमसाध्य कर देगा.

सेंसर इमेजिंग प्रक्रिया बहुत लचीला है और आसानी से कई माइक्रोस्कोपी setups के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम पहले से tunable acusto ऑप्टिक फिल्टर 5,17 लेकिन मानक FITC / TRITC फिल्टर सेट के साथ एक confocal प्रणाली के तहत सेंसर का उपयोग भी किया जा सकता है की सूचना दी. एक इष्टतम intracellular एकाग्रता प्राप्त किया जाता है, पीएच इमेजिंग सीधा है. हम लेजर तीव्रता के अनुकूलन पिनहोल और डिटेक्टरों सेंसर intracellular की एक बड़ी रेंज पर हासिल करने का सुझावionophores साथ पीएच अंशांकन चलाने से पहले सांद्रता. एक ही माइक्रोस्कोपी सेटअप ही परिस्थितियों में किया जाता है, तो अंशांकन सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ हम सेंसर एकाग्रता निर्भरता और कलाकृतियों से बचने के लिए ratiometric इमेजिंग प्रस्ताव. उस लक्ष्य को हासिल करने के लिए एक और दिलचस्प कार्यप्रणाली जीवनकाल आधारित के रूप में सुंदर ढंग से Vinogradov द्वारा दिखाया और 15 सहकर्मियों जांच और विकल्प प्रदर्शित फायदे और नुकसान दोनों का प्रतिनिधित्व करती है. वे आंतरिक रूप से एकाग्रता स्वतंत्र और अंशांकन प्रक्रियाओं अक्सर तेजी से और अधिक स्थिर रहे हैं के रूप में लाइफटाइम माप किसी भी सुधार की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, एक ही रंग जटिलताओं और हरे रंग से लाल ratiometric इमेजिंग द्वारा प्रेरित संभव विपथन से परहेज किया जाता है. तीव्रता के आधार पर जांच का एक बड़ा सरणी व्यावसायिक तौर पर पहुंच रहे हैं, जबकि हालांकि केवल कुछ प्रभावी जीवनकाल जांच उपलब्ध हैं. ratiometric इमेजिंग के लिए आवश्यक उपकरण के रूप में सरल और अधिक होने की संभावना उपलब्ध हैtandard माइक्रोस्कोपी सुविधा. इसके अलावा जीवनकाल माप आंतरिक रूप से धीमी गति से कर रहे हैं और तेजी से जैविक प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता. इसलिए इन दोनों तकनीकों के बीच चुनाव दृढ़ता से उपलब्ध उपकरण पर और हित के विशिष्ट जैविक प्रक्रिया पर निर्भर करता है.

धारणात्मक समान हालांकि, vivo इमेजिंग सेल संस्कृति में अधिक से अधिक चुनौतीपूर्ण है. शोर अनुपात संकेत बिखरने से कम है और ऊतकों के साथ बातचीत सेंसर की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, ऊतकों के माध्यम से प्रसार और ब्याज के क्षेत्र से सूचक के इस प्रकार रिसाव संस्कृति में intracellular मापन के लिए उपस्थित नहीं एक अतिरिक्त अंक का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन कारणों के लिए, सूचक का चुनाव महत्वपूर्ण है. Intracellular मापन के लिए dendrimers की सबसे अधिक (जी -4, जी -4 एसी, G6, PAMAM खूंटी संकर) उत्कृष्ट काम करते हैं, vivo में संवेदन के लिए हम pegylated dendrimers के इस्तेमाल की सिफारिश. 17 इंडस्ट्रीज़; द्वितीय) खूंटी लिंकर डाई डाई से उत्पन्न शमन को कम करता है और बातचीत-dendrimer डाई और मैं) खूंटी dendrimer के आकार में वृद्धि और ऊतकों से अपनी लीक कम कर देता है: eed इस वास्तुकला कई कारणों से इस उद्देश्य के लिए विशेष रूप से प्रभावी है iii) खूंटी अक्सर सेंसर के ऊतक इंजेक्शन के बाद मनाया समारोह के नुकसान से बचने के ऊतकों से रंगों ढालें. पीएच संवेदन की गुणवत्ता दृढ़ता से ऊतक में dendrimer की एक पर्याप्त राशि की सफल इंजेक्शन पर निर्भर करता है. इस हासिल की है जब इमेजिंग प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण पहले से ही सेल संस्कृति के लिए सूचित किया गया था कि क्या करने के लिए समान हैं. इस विवो में सेंसर प्रभाव का एक स्पष्ट प्रदर्शन है और किसी भी माप से पहले सूचक गतिविधि का एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

हम एक साथ इस काम की रिपोर्ट में विस्तृत प्रक्रियाओं के साथ इन परिणामों Dendrimer आधारित सेंसर का आवेदन मानसिक उजागर करने की अनुमति देगा का मानना ​​है किजीवित कोशिकाओं में और vivo में पीएच की iological और रोग परिवर्तन.

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Disclosures

डिफ़ॉल्ट: लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

Isja डे Feijter और मैट बेकर के साथ उपयोगी चर्चा कृतज्ञता स्वीकार कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

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References

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