合成,细胞和交货

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

荧光传感器是在生命科学的强大工具。这里我们描述的方法来合成,并使用树枝状聚合物为基础的荧光传感器来测量pH值在活细胞和活体 。树突状支架增强的共轭荧光染料从而提高传感特性的属性。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

荧光指标的发展为代表的生命科学的一场革命。基因编码的,并与感测能力的合成的荧光团可生物相关物质的高空间和时间分辨率的可视化。合成染料是特别感兴趣得益于其高可调性和广泛的可测量的分析物。然而,这些分子蒙受小分子行为的若干限制(溶解性差,在定位困难,常无比例成像允许的)。在此工作中,我们介绍的树枝状聚合物基传感器的开发和在体外呈现程序用于pH测量,在活细胞和活体 。我们选择树枝状为我们的传感器理想的平台,他们的许多理想性能(单分散性,可调性,多价),使他们广泛使用的脚手架几个生物医学设备。荧光pH值的共轭指标,树枝状聚合物骨架导致其感测性能的增强。特别是树枝状展览减少细胞渗出,改善细胞内定位,并允许比例测量。这些新颖的传感器被成功地用于测量pH值在活的HeLa细胞和体内在小鼠脑。

Introduction

利用荧光分子标记特定的生物相关分子已经完全改变了我们研究生物系统的方式。广角并允许生物过程的实时高分辨率的可视化和时下激光共聚焦显微镜是最流行 ​​的技术,研究在体外生物事件,在细胞和体内 。1一个相应的改进是由荧光指标的发展代表染料的荧光是依赖于特定的分子实体的浓度。尤其是pH值和钙指标对细胞生理学研究产生了巨大影响,由于H +和Ca 2 +的离子在生物的巨大意义。2,3

然而,大多数目前的传感染料的几个固有的局限性与他们的小分子的行为,如:i)于亚细胞targeti困难纳克;在水中,因而差的生物相容性ⅱ)溶解性差;以及iii)细胞渗漏,因而缺乏长时间推移成像能力4此外,许多探针的信号不能被校正,以染料浓度的依赖性(非比例成像),因此,在细胞中或在体内的绝对测量是不可能的。

最近,我们描述一个简单而有效的方法来克服这些限制,基于传感染料的树枝状聚合物骨架共轭。5树枝状化合物是单分散性的超支化聚合物具有非常吸引人的特性对于生物学应用。6特别一些树突状结构已被开发并用于药物7和基因传递。8只最近几个小组开始研究这些分子作为支架材料用于传感设备的潜力。9,10,11

我们以前描述了基于NHS活化酯对不同聚酰胺-胺的官能化的容易合成路线(PAMAM)支架12的结合物可以在单一步骤中通过透析的方法,因为只有纯化而获得。有趣的是这种方法可以很容易地应用到各种各样的树突或聚合物骨架。13,14

实现成像比例分别为树枝状双标有两套染料:ⅰ)一个pH指示剂( 荧光素)和ii)的pH非依赖性的荧光部分( 例如若丹明)。这使我们能够进行精确的pH值成像的荧光素和罗丹明之间的比率为仅依赖于pH值,没有更多的探针的浓度。另一个有趣的方法这个问题是通过使用生命周期为基础的探针。15表示为终身不依赖于探针浓度这些测量不需要比例修正。然而,LIFETIME测量需要一个更复杂的仪器的设置和它们的时间分辨率是次优的用于快速的生理过程,从而限制了它们的应用潜力。

为了进行细胞内成像,探针需要跨质膜被传递到胞质溶胶中。作为树枝状聚合物不会由于它们的尺寸和亲水性膜渗透性,细胞内递送可通过电穿孔来实现。通过这种技术,广泛应用于生物学转染的方式,标记大分子可以有效地传递到细胞内进行高品质的影像。此外,与电穿​​孔可避免与树枝状聚合物的内吞作用的复杂的大分子被直接递送到细胞质中。有趣的是电穿孔后不同树枝状显示单元,即使在没有任何具体的靶向序列内不同的本地化。5本PASSIVË目标,只是由于树枝状聚合物的物理化学性质,可以被利用来实现细胞器特定的pH成像。

比例成像可以使用共焦显微镜来进行。荧光素和若丹明,共价偶联到树枝状骨架,分别成像,并创建一个像素由像素比例的地图。据报道几个程序由离子载体的手段来控制细胞内pH值在活细胞。离子载体是小的疏水性分子能够穿过细胞膜的运输离子;离子载体为H +离子,如尼日利亚菌素,都是有效的,可用于校准树枝状聚合物为基础的传感器16,这些测量结果表明,以pH值线性响应类似于所观察到的。 体外 。在校准细胞内pH值的基础上可以正确地测定。这些测量结果表明,树枝状聚合物为基础的传感器可以在研究H +的homeost一个有价值的工具ASIS在活细胞和病理过程,涉及pH值调节故障。

我们最近表明,树枝状聚合物为基础的pH传感器也能在体内被应用,在麻醉小鼠的大脑进行成像pH值17由于生物组织体内感应一个高品质在技术上具有挑战性的复杂环境。这里,我们表明所述的实验步骤在体内 pH值成像的寻址到在大脑中进行准确的pH值成像的关键问题加重的详细描述。双光子显微镜已受聘主要有两个原因:一)使用红外光能够克服缺乏标准的共聚焦显微镜组织渗透的;二)荧光素和罗丹明的广泛双光子吸收让他们同时激发回避并发症相关的使用的两个波长进行激发。在小鼠大脑的pH测量是顺利进行;传感器容易缺氧诱导响应pH值在脑细胞外空间的变化。这些测量结果表明,树枝状聚合物为基础的指标,可以成功地用来突出pH值的生理和病理变化在体内在动物模型。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1。该传感器的合成

  1. 在以下部分中,我们提供了一个程序的pH值指标,PAMAM树枝状聚合物的缀合。相同的协议,可以以最小的修改被应用到另一种胺-轴承树枝状聚合物。5,17,13,14市售的树枝状聚合物和染料可以不经进一步纯化使用。
  2. 溶解树枝状聚合物在无水DMSO(50μM终浓度)。在无水DMSO中制备10mM的储备溶液的荧光素-NHS和四甲基罗丹明-NHS(TMR)的。
  3. 添加到树枝状聚合物溶液的荧光素和TMR的所需量。在混合物中的摩尔比将反映染料上的树枝状聚合物装入的量。通常为1毫升的离心管G4 PAMAM树枝状聚合物溶液与8当量的荧光素(40微升)和8当量的TMR(40微升)。搅拌该溶液在室温下搅拌12小时。
  4. 稀释1:10去离子水,并加载该反应混合物透析袋(截留分子量= 10 kDa的)。透析24小时,用去离子水经常更换水在储。
  5. 将该溶液转移至小瓶中并冷冻干燥24小时。紫色粉末应获得。重量所得到的固体,并在10μM的最终浓度溶解在milliQ水中。分装,在-20℃下的溶液,并存储

2, 体外 pH测量

  1. 用于体外校准制备树枝状聚合物的溶液中500nm处的PBS(2 mM磷酸盐)的石英比色杯中。建议使用非常稀的PBS缓冲液(2毫摩尔),以避免pH值的滴定过程中的突然变化。
  2. 测量荧光素(EXC 488 nm)和TMR(EXC 550 nm)的发射光谱和优化荧光计的光学设置,以达到良好的信号噪声比。
  3. 通过添加少量的氢氧化钠0.1N的盐酸和0.1 N。进行pH滴定后每增加摇试管进行搅拌,等待1分钟进行平衡,并通过pH微电极的方法测量pH值。荧光素和TMR的发射光谱应记录没有光学设置的任何改变每一步。
  4. 绘制荧光强度与pH值的滴定。若丹明信号应该由pH值(<10%)受到影响。荧光素信号应该是一个S形曲线,并应配有与PK = 6.4单绑定模型。

3。细胞培养与电穿孔

  1. 培养在补充有10%胎牛血清和100 U / ml青霉素和100毫克/毫升链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)的HeLa细胞。保持细胞培养物在37℃下在湿润的5%CO 2的气氛。
  2. 对于树枝状电,当细胞汇合,取出介质,并使用DPBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲液)洗涤细胞。除去DPBS,并添加胰蛋白酶-EDTA。中和胰通过添加含血清培养基但不犯罪的抗生素。离心机在900-1,200 rpm下在室温下2分钟。取出介质,并用DPBS冲洗颗​​粒。
  3. 计数细胞,并采取4×10 6个细胞。离心机在1,200-1,500 rpm下在室温下2分钟。
  4. 重悬细胞沉淀中加入200μl微穿孔缓冲液(由microporator厂家提供)和细胞转移到1.5 ml离心管。
  5. 加树枝状聚合物水溶液为悬浮细胞。每个样品所需的树枝状聚合物的量取决于PAMAM型(通常为250纳米的阳离子和2微米中性树枝状)。
  6. 加电穿孔缓冲液(由microporator厂家提供)在微穿孔管。吸取与100μl的体积尺寸的电穿孔尖端的细胞和树枝状聚合物的混合物。将microporator吸管插入吸管站。设置为微穿孔脉象:脉冲电压为1,005 V;妇女参与发展的脉搏TH = 35毫秒,脉冲数= 2。
  7. 后的脉冲传递细胞到1.5ml微量离心管中,离心细胞5分钟,在1,200 rpm下以除去培养基中的过量的树枝状聚合物。板10微升电穿孔细胞到35 mm玻璃底菜(Willco公司 - 菜GWSt-3522)用新鲜培养基W / O型抗生素。

4。生活在HeLa细胞的pH传感

  1. 以电穿孔后共聚焦显微镜12小时图象的细胞。
  2. 可用于荧光素和罗丹明标准滤波器组。若可调谐滤波器可安排从500绿色通道 - 550nm和红色通道从580纳米到650纳米。激发波长为488nm处是最佳的荧光素罗丹明时可成像要么与543nm或561激光线。
  3. 聚焦在试样上,并调整激光功率和检测器增益最大化的信号 - 噪声比。如果电穿孔是成功的细胞应该是在两个通道的明亮的荧光。该本地化取决于所使用的树枝状聚合物的大小和电荷。往往是一些溶酶体定位(核周小囊泡)是由于内吞作用或条块存在。如果溶酶体定位是主要的, 大部分的荧光是局部内囊泡,差信号在胞液中被观测到,这意味着毒性和测量应该被丢弃。顺序地获取两个通道,如果需要获取多个图像和平均化图像,以提高图像质量。
  4. 使用缓冲液校准夹具细胞的pH与离子载体在不同的pH和如上所述获得每个pH值至少为20的细胞。对于该过程的详细描述和缓冲器的组合物,请参阅Bizzarri的同事和16中,我们建议至少测量5个点在pH = 5.5至pH = 7.5。 pH值低于6是有毒的细胞,但容忍的时间较短,我们建议获得尽可能快的图像。如果细胞证明细胞凋亡的迹象,丢弃电池,然后重新启动。
  5. 使用ImageJ的或用于数据分析的类似软件。导入的绿色和红色通道的图像,减去背景和由像素比成像与工具“图像计算器”创建一个像素。
  6. 绘制感兴趣区(ROI)选择所需的单元格的区域,并测量细胞内的绿色到红色的比例。分析所有获取的图像,然后绘制比与pH值。在从5.5到7.5的范围内的趋势应该是线性的。所得到的点的线性拟合会给将用于绿色到红色比转换至pH的校准曲线。
  7. 作为进一步的控制收购一些未经处理的细胞(无离子载体),并尝试计算pH值与所获得的校准曲线。应获得7.2和7.4之间的值。

5, 体内样品制备

  1. 实验产后d所对C57BL/6J(男性和女性)进行AY 28和70。麻醉的小鼠腹膜内注射乌拉坦( 乙基氨基甲酸酯)(20%w / v的在生理盐水中,20毫克/公斤的聚氨酯)。实验与聚氨酯的后跟一个心内注射相同的麻醉剂过量后处死动物。
  2. 进行注射地塞米松磷酸钠(2毫克/千克体重)肌肉内,以减少外科手术过程中的皮质应激反应和脑水肿。
  3. 剃除动物的头部和应用2.5%利多卡因凝胶在头皮上。
  4. 用剪刀剪下的皮肤覆盖南北半球的颅骨皮瓣
  5. 用生理盐水冲洗骨外露,轻轻地用镊子取出骨膜。这将提供胶水和牙科用粘固剂附着有更好的基础。
  6. 套用一个特制的钢头后与中央成像室,并与氰基丙烯酸酯在一个平面上胶水约与头骨i的皮层区域平行nterest并修复到位,白色的牙齿水泥(Paladur)。
  7. 修正了鼠标的头部,以执行2-3毫米直径钻孔在该地区的利益开颅手术。
  8. 尝试手术,硬脑膜撕裂,或出血期间尽量减少皮质加热。
  9. 保持灌流用无菌ACSF(126 mM氯化钠,3 mM的氯化钾,1.2mM的KH 2 PO 4,1.3 mM的MgSO 4干燥,26毫米的NaHCO 3,2.4毫米氯化钙2皮层,15mM的葡萄糖,1.2毫摩尔HEPES中蒸馏H 2 O的,pH值= 7.4)。

6。在小鼠脑成像pH值

  1. 在实验过程中帮助动物的呼吸提供氧气的富氧空气。氧被浓缩至高达80%。 O 2分压和流量经常调整,以获得正确的呼吸辅助。保持体温恒定在37℃与反馈控制的加热毯。
  2. 通过以下的两个照片的目标的钢后的修复动物Ñ​​成像设置。
  3. 为了将传感器在大脑皮质注入装入含有氯化银电极(尖端直径为4毫米),树枝状聚合物溶液(1μM)的玻璃移液管。电极将允许录制外场电位。
  4. 用显微注射法设置插入吸移管在皮层,大约150微米的深度。注射1-2分钟在0.5 psi的压力。
  5. 优化的光学装置的成像。激光功率应调整,以减少光漂白和光损伤。采用通常的激光功率大约为20毫瓦,而光电倍增管的增益保持恒定在667因为V先前校正表明,该电压提供了最好的S / N比。
  6. 对于成像激励传感器在820 nm和通过标准FITC和TRITC过滤器同时检测荧光素和罗丹明荧光。
  7. 时间分辨测量采集时间的推移扳成2赫兹。
  8. 背景校正获得一个黑暗的框架落色ř快门关闭来衡量,通常由电子添加的光电倍增管和底座所产生的平均热噪声。
  9. 数据分析报告遵循在第4相同的步骤。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

图1示出的传感染料以不同的树枝状骨架的缀合的示意图。所得到的指标,可以从市售品1容易合成的步骤来获得。胺息树枝状化合物与NHS-活化的染料在DMSO中,并通过渗析提纯。这是一般的程序已经被成功地用于多种树枝状标签:我)PAMAM树形分子的产生2,4和6; 12聚乙二醇化树形分子17和PEG-树突状杂种18。作为不同的树枝状聚合物显示出与细胞和组织(本地化,毒性,渗透性,扩散)的不同交互的树枝状结构的选择是密切相关的所希望的应用和所关注的样品。

该传感器包括两套荧光染料的:一)pH值指标及ii)作为内部参考的pH不敏感的部分。 ALTHough了大量的各种指标和引用的情况下,最好的结果已与荧光素和四甲获得。两种染料的比率可以简单地在该反应使用不同摩尔当量进行调整, 图2显示了一个典型的体外滴定的pH传感器。荧光素和罗丹明,可以分别激发在488nm处和550nm处,分别使两个通道之间的最小串扰。如可以清楚地看出,荧光( 图2A)显示了pH依赖性的行为,而若丹明( 图2A)的信号不存在于生理pH范围显著改变。因此,这两个信号的比率不依赖于传感器的浓度,但只在pH值。这个浓度独立性将是非常重要的用于生物测量细胞内探针的浓度不能被控制。

对于活细胞测量INTR脱细胞递送树突传感器是通过电穿孔来实现。这种技术被广泛用于生物学用于DNA转染,可与在制造商协议微小的变化被应用。通过电穿孔,大分子可被直接传送到细胞质中,避免与内吞作用的小泡系统中的任何并发症。 图3a示HeLa细胞电穿孔的树枝状聚合物传感器的共聚焦图像。 (绿色,左)和罗丹明(红色,中)在这两个荧光素的强烈信号是观察。两个信号完美地表现体现了传感器结构的完整性。进行比例映射是通过将两个图像的像素由像素,代表了伪标( 图3a,右)重建。 pH的夹紧用的离子载体中进行,以校准细胞内的传感器响应。校准与离子载体是一种行之有效的协议,塞弗拉尔协议已被广泛描述和可以使用,不用修改。19指标容易地至pH响应的绿色到红色比的变化, 如图3b所示。这使我们获得的校准曲线( 图3c),用于精确的pH测量。在校正的线性趋势表明了传感器,以不从蜂窝环境中的任何扰动响应pH值的能力。校准曲线已被使用,以确定生活HeLa细胞为7.4的4.8的pH值和对​​细胞质和溶酶体分别。这些结果与文献报道一致。

最后,我们发现树状为基础的传感器如何可以用于体内成像。树枝状聚合物可以很容易地用一个程序非常类似于广泛使用的钙指标被注入穿过组织20一旦在组织中,各项指标扩散非常慢,allowin完整的组织排水前克长期的成像。典型的结果示于图4。荧光素(绿色)和罗丹明(红色)信号已同时获得具有820 nm激发和比例的地图是建立在逐个像素的基础上,与活细胞测量。值得注意的是,指示器定位在胞外空间,图像中的非荧光区域识别蜂窝体或小血管。为了验证传感器的响应pH值,我们提出了利用高碳酸血症。的确,二氧化碳是已知的,以改变碳酸盐缓冲液在血液和组织中的均衡,从而在组织中的酸化。21图4b中所示,30%的CO 2的吸入,就足以诱导的强烈的反应传感器是在重新通风鼠标完全可逆的。这些结果证明树枝状聚合物基传感器的电位突出的生理和PApH值在活细胞和活体内 thological变化

图1
图1。合成的树枝状聚合物基传感器树枝状聚合物为基础的pH传感器的示意图。相同的步骤可以应用到几乎所有的胺树枝状聚合物轴承(左)。产品是通过一个单一的共轭反应再进行透析获得的。 点击这里查看大图

图2
图2。 体外 pH滴定为树枝状聚合物为基础的传感器。一)反应的pH指示剂的荧光素和b)第internal参考,若丹明,表示在生理pH范围内没有变化。

图3
图3。 pH值成像在活HeLa细胞具有代表性的结果。荧光通道(左),罗丹明通道(中)和pH值比例图(右)。 二)pH校准与离子载体细胞钳制在不同的pH值。 三)代表比例地图的)共焦成像。 ALBERTAZZI L,BRONDI M,帕通用,佐藤SS, 转载(2011)树状为基础的荧光指示灯: 在体外体内应用PLoS ONE的 6(12),e28450。 DOI:10.1371/journal.pone.0028450

图4
图4。在pH值成像大脑的麻醉鼠标。一个)的绿色和红色通道(同时激发在820 nm)和pH值成比例的地图。b)该传感器的高碳酸血症的典型反应(30%CO 2)。 ALBERTAZZI L,BRONDI M,帕通用,佐藤SS, 转载(2011)树状为基础的荧光指标:从适应。在体外体内应用PLoS ONE的 6(12),e28450。 DOI:10.1371/journal.pone.0028450 点击这里查看大图

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

对于成功的pH成像与树枝状聚合物基传感器的关键步骤是:在正确的树突状支架ⅰ)选择和缀合到它指示的数目和传感器递送协议ⅱ)在细胞内或体内的最优化

该合成过程是相当容易的,并且可以几乎应用于每个胺息的超支化聚合物。该传感器可以由一个单步市售的树枝状聚合物与NHS-活化的染料来获得。我们认为,这种模块化和简单的过程将有利于为各种生物学问题的进一步应用这种传感器。纯化可以通过透析来有效地实现以除去未结合的染料。树枝状骨架的选择是至关重要的,取决于所需的特定应用程序。不同的树枝状聚合物已被证明具有细胞内的特有的本地化由于与S的特异性相互作用ubcellular结构。中性树枝状(例如乙酰化PAMAM G4)没有显示出细胞内的任何交互,并显示出弥漫性定位。因此,他们代表了全细胞成像不错的选择。相反正电荷不同世代的树枝状高分子(从G2到G6)显示静电相互作用与带负电荷的生物分子( RNA),导致特定的细胞定位。阳离子树枝状因而理想的细胞器特异性成像。

传感染料的选择是至关重要的。几个pH指示剂和pH值不敏感的染料具有不同的发色和H +的亲和力(PK)是可用的。我们尝试了许多不同的染料组合和最好的结果是用荧光素和四甲获得。这对提供的pH良好的反应在生理范围内(PK = 6.4),并与常用的显微镜​​设置过滤器兼容。对于不同的要求,如测量在不同pH范围s,某些优化可能需要。值得注意的是,并非所有的指标在树枝状共轭保持其性能(亮度,PK)5这种行为既取决于染料和树枝状结构,然而,我们能够汇报几项指标,其中的指标光物理性质没有显著影响。 17如果是这样,我们建议通过连接体,以尽量减少树枝状大分子相互作用的染料缀合的染料的情况。几个活性染料是市售的具有烷基间隔件22或在替代的PEG连接子都可以使用。还指示器的数量和比率的指标对参考染料在支架上是重要的。理想的比例取决于所使用的显微镜设置的光谱灵敏度和利息5,17的生物试样。虽然有些故障可能是需要的,非常容易和快速的合成过程,将大大促进这一进程。最后树枝状聚合物的官能化程度, 端基被缀合的染料的树枝状聚合物的百分数,可以影响指标的表演。为了避免我们建议官能约10%的树枝状聚合物的端基的20%溶解度的任何问题。然而,在聚乙二醇化的树枝状聚合物中,由于聚乙二醇对溶解度的贡献的情况下,一个完整的官能化就可以实现。这也可以限制FRET和共轭染料其中猝灭现象的不希望存在的。

树枝状聚合物是不细胞渗透性的,但细胞内递送可通过电穿孔来实现。我们采用的DNA转染的制造商协议,用于所关注的细胞系没有进一步的修改。一个关键的参数是在电穿孔缓冲液中树枝状聚合物的浓度,尤其在指标不佳亮度或树枝状聚合物,在高浓度可能对细胞有毒性的情况。低conce树枝状ntrations会导致细胞内信号不佳而高浓度会导致毒性和诱导细胞死亡。理想的浓度取决于树枝状聚合物/指示器对,以及对成像的设置可用,并可能需要一些优化。如果电穿孔不可用在实验室,显微注射可能是一个有效的替代。然而,这是一个单细胞技术,将使收购显著数目的细胞成像更费力。

传感器成像过程是很灵活的,可以很容易地适应多种显微设置。我们先前报道使用传感器的下一个共焦系统具有可调acusto光学滤波器5,17,但标准的FITC / TRITC滤集也可以使用。当获得一个最佳的细胞内浓度,pH成像是直截了当的。我们建议优化激光强度,针孔和探测器获得在大范围内的传感器的与离子载体运行pH校准之前的浓度。如果同一显微镜安装在相同的条件下使用的校准可被用于所有实验。在这里,我们提出的成像比例,以避免传感器浓度依赖性和文物。另一个有趣的方法来实现这一目标是通过维诺格拉多夫的优雅表现和他的同事15终身型探头和两个选项显示的优点和缺点表示。寿命测量不需要任何校正,因为它们本质上是浓度无关和校准程序往往更容易和更稳定。此外,单一的颜色是用来避免了并发症和可能的像差引起的绿色到红色比例成像。然而,只有少数的有效寿命探头可同时大阵强度为基础的探针是商业访问。所需的比例成像设备更简单,更容易提供如TANDARD显微镜设施。此外寿命测量本质上是慢的,并且不能被应用到遵循快速生物过程。因此,这两种技术之间的选择在很大程度上依赖于可用的仪器和在感兴趣的特定生物过程。

虽然概念上类似的, 在体内成像比在细胞培养更具挑战性。信噪比是由散射减少,并与组织的相互作用会影响传感器的应答。此外,通过组织扩散,从而泄漏从感兴趣区域的指示器指在培养细胞内测量,不存在一个额外的问题。由于这些原因,该指标的选择是至关重要的。而细胞内的测量大多数树枝状工作出色(G4,G4-AC,G6,PAMAM-PEG杂交), 在体内感应,我们建议使用聚乙二醇化树枝状17工业EED此架构是为此目的特别有效的有以下几个原因:ⅰ)的PEG增加了树枝状聚合物的大小,并降低来自所述组织的泄漏;ⅱ)的PEG连接减少了来自染料的染料所产生的骤冷和染料 - 树枝状聚合物的相互作用和iii)本PEG屏蔽染料从组织避免丧失功能的组织注射传感器后经常观察。 pH值检测的质量在很大程度上依赖于成功的注射树枝状聚合物的足量的组织。当这样获得的成像程序和数据分析是类似于已经报道了细胞培养物。这清楚地表明了在体内的传感器有效性和可作为指示剂活动的任何测量前的内部控制。

我们认为,这些结果连同报道了这项工作的详细程序将允许树状为基础的传感器的应用突出物理pH值在活细胞和活体内 iological和病理变化

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

默认:作者什么都没有透露。

Acknowledgments

与Isja德Feijter和马特·贝克有益的讨论表示诚挚的谢意。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312, (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260, (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110, (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420, (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132, (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23, (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14, (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406, (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69, (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125, (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7, (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7, (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90, (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6, (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50, (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7, (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11, (7), 816-822 (2008).
  22. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. 11th, (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics