Síntese, Entrega Celular e

Chemistry

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Summary

Sensores de fluorescência são ferramentas poderosas nas ciências da vida. Aqui, descrevemos um método para sintetizar e utilizar os sensores fluorescentes baseados em dendrímero para medir o pH em células vivas e in vivo. O andaime dendríticas aumenta as propriedades de corantes fluorescentes conjugados levando a melhores propriedades de detecção.

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Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

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Abstract

O desenvolvimento de indicadores fluorescentes representado uma revolução para as ciências da vida. Geneticamente codificados e fluoróforos sintéticos com capacidade de sensoriamento permitiu a visualização de espécies biologicamente relevantes com alta resolução espacial e temporal. Os corantes sintéticos são de particular interesse, graças à sua alta tunability e da ampla gama de analitos mensuráveis. No entanto, estas moléculas sofrem várias limitações relacionadas com a pequena molécula de comportamento (baixa solubilidade, as dificuldades de segmentação, muitas vezes não há imagem raciométrica permitido). Neste trabalho, introduzir o desenvolvimento de sensores baseados em dendrímero e apresentar um processo para a medição do pH in vitro, em células vivas e in vivo. Nós escolhemos dendrímeros como plataforma ideal para os nossos sensores para suas muitas propriedades desejáveis ​​(monodispersity, propriedades ajustáveis, multivalência) que lhes um andaime amplamente utilizado por vários dispositivos biomédicos feitas. A conjugação de pH fluorescenteindicadores para o cadafalso dendrimer levou a um aprimoramento de suas performances de detecção. Em particular dendrímeros exposição reduzido vazamento celular, melhor direcionamento intracelular e permitir medições raciométrica. Estes novos sensores foram utilizados com sucesso para medir o pH em células HeLa vivo e in vivo em cérebro de ratinho.

Introduction

O uso de moléculas fluorescentes para identificar moléculas biologicamente relevantes específicos mudou completamente a nossa forma de estudar sistemas biológicos. Widefield e microscopia confocal permitiu uma visualização em tempo real de alta resolução de processos biológicos e hoje estão entre as técnicas mais populares para estudar eventos biológicos in vitro, em células e in vivo. 1 Uma melhora significativa foi representado pelo desenvolvimento de indicadores de fluorescência , ou seja, corantes cuja fluorescência é dependente da concentração de uma entidade molecular específico. indicadores de pH e cálcio, em particular, teve um impacto dramático sobre o estudo da fisiologia da célula devido à enorme relevância de 2 + íons H + em biologia e Ca. 2,3

Entretanto, a maioria dos corantes sensíveis apresentam várias limitações intrínsecas relacionadas com a sua pequena molécula comportamento, tais como: i) dificuldades em targeti subcelularng; ii) pouca solubilidade em água e, consequentemente, pobre biocompatibilidade;. e iii) o vazamento de células e, assim, falta de capacidade de imagem de lapso de tempo longo 4 Por outro lado, o sinal de muitas sondas não pode ser corrigido para a dependência da concentração de corante (não- imagiologia raciométrica) e, por conseguinte, uma medição absoluta nas células ou in vivo, não é possível.

Recentemente, descreveu um método simples e eficaz para ultrapassar estas limitações, com base na conjugação de corantes de detecção sobre um andaime de dendrímero. Cinco dendrímeros são polímeros hiper monodispersas com propriedades muito atraentes para aplicações biológicas. 6 Em particular, várias arquitecturas dendríticas têm sido desenvolvidos e utilizados para a droga 7 e entrega do gene. 8 Só muito recentemente vários grupos começaram a explorar o potencial dessas moléculas como suporte para dispositivos de detecção. 9,10,11

Anteriormentedescrita uma via de síntese simples para a funcionalização de poliamidoamina (PAMAM) diferentes suportes com base em ésteres de NHS-activada. Conjugados 12 pode ser obtido num único passo, por meio de diálise como a purificação. Curiosamente, este método pode ser facilmente aplicado a uma variedade de suportes poliméricos ou dendríticas. 13,14

Para alcançar os dendrímeros de imagem raciométrica foram duplamente marcado com dois conjuntos de corantes: i) um indicador de pH (ou seja, a fluoresceína) e ii) uma porção fluorescente independente do pH (ou seja, a rodamina). Isto permitiu-nos realizar imagem pH preciso como o rácio entre a fluoresceína e rodamina é só dependente do pH e não mais sobre a concentração da sonda. Outra abordagem interessante para esta questão é representado pelo uso de sondas à base de toda a vida 15. À medida que a vida não depende de concentração da sonda essas medidas não precisam de uma correção radiométrica. No entanto, lifmedições Etime requerem uma configuração instrumental mais complicado e sua resolução temporal é sub-ótima para processos fisiológicos rápidos, o que limita as suas aplicações potenciais.

A fim de executar imagiologia intracelular, a sonda tem de ser entregue através da membrana plasmática para o citoplasma. Como os dendrímeros não são membrana permeável devido ao seu tamanho e hidrofilicidade, a entrega intracelular pode ser conseguida por meio de electroporação. Por meio desta técnica, amplamente utilizados em biologia, para a transfecção, as macromoléculas marcadas podem ser eficazmente entregues nas células para realizar imagem de alta qualidade. Além disso, com a electroporação as complicações relacionadas com a dendrímero endocitose pode ser evitado que as macromoléculas são entregues directamente para o citoplasma. Curiosamente após eletroporação diferentes dendrímeros mostra localizações distintas no interior das células, mesmo em ausência de qualquer seqüência de alvos específicos. 5 Este passive direccionamento, apenas devido às propriedades físico-químicas do dendrímero, pode ser explorado para atingir o pH de imagem específicos de organelos.

Imagiologia Raciometrico pode ser realizado utilizando microscopia confocal. A fluoresceína e rodamina, covalentemente conjugado com o andaime dendrítica, foram separadamente trabalhada e um pixel-a-pixel proporção mapa foi criado. Vários procedimentos para controlar o pH intracelular em células vivas por meio de ionóforos foram relatados. Os ionóforos são pequenas moléculas hidrófobas capazes de transportar iões através da membrana plasmática; ionóforos de iões H +, tais como nigericina, estão disponíveis e podem ser utilizadas para calibrar os sensores baseados em dendrímero 16 Estas medições revelaram uma resposta linear ao pH de forma semelhante ao que foi descrito. in vitro. Na base do pH intracelular de calibração pode ser medido com precisão. Estas medições demonstraram que o sensor baseado em dendrímero pode ser uma ferramenta valiosa no estudo H + homeostasis em células vivas e processos patológicos que envolvem falhas de regulação de pH.

Recentemente, demonstrou que os sensores de pH à base de dendrímero também pode ser aplicada, in vivo, a realização de imagens de pH no cérebro de ratos anestesiados. 17 Devido ao ambiente complexo de tecidos vivos de elevada qualidade na detecção in vivo é tecnicamente exigente. Aqui nós mostramos uma descrição detalhada do procedimento experimental para a imagem in vivo pH com ênfase das questões cruciais a serem abordados para realizar uma imagem pH precisas no cérebro. Microscopia de dois fótons tem sido empregada por duas razões principais: i) o uso de luz infravermelha permite superar a falta de penetração nos tecidos da microscopia confocal padrão; ii) a ampla absorção de dois fótons de fluoresceína e rodamina permitir a sua excitação simultânea evitando a complicações relacionadas com o uso de dois comprimentos de onda para excitação. medições de pH no cérebro de camundongos foramrealizado com sucesso; sensores prontamente responder à hipóxia induzir mudança de pH no espaço extracelular cerebral. Estas medições demonstram que os indicadores baseados dendrímero pode ser utilizado com êxito para destacar as alterações fisiológicas e patológicas do pH in vivo num modelo animal.

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Protocol

1. Síntese dos Sensores

  1. Na seção seguinte, nós fornecemos um procedimento para a conjugação de indicadores de pH de dendrímeros PAMAM. O mesmo protocolo pode ser aplicado com modificações mínimas para dendrímeros de amina alternativas de rolamento. 5,17,13,14 dendrímeros e corantes comercialmente disponíveis pode ser usada sem mais purificações.
  2. Dissolve-se o dendrímero, em DMSO anidro (50 uM de concentração final). Prepare as soluções de 10 mM de fluoresceína-NHS e tetrametil-rodamina-NHS (TMR) em DMSO anidro.
  3. Adicionar à solução de dendrímero a quantidade desejada de fluoresceína e TMR. A relação molar na mistura irá reflectir a quantidade de corantes carregados no dendrímero. Tipicamente, 1 mL de solução de dendrímero PAMAM G4 num tubo de microcentrífuga é feito reagir com 8 eq (40 ul) de fluoresceína e 8 eq (40 ul) de TMR. Agita-se a solução à temperatura ambiente durante 12 horas.
  4. Dilui-se a 1:10 com água desionizada e carregar a reacçãomistura em um saco de diálise (MWCO = 10 kDa). Dializar durante 24 horas contra água desionizada substituindo frequentemente a água no reservatório.
  5. Transferir a solução para um frasco e seca por congelação durante 24 horas. Um pó de cor purpúrea deve ser obtida. Peso do sólido obtido e dissolvê-lo em água MilliQ a uma concentração final de 10 uM. Alíquota da solução e armazenar a -20 ° C.

2. In Vitro medições de pH

  1. Para in vitro calibração preparar uma solução 500 nM de dendrímero em PBS (fosfato de 2 mM) numa cuvete de quartzo. Recomenda-se o uso de um tampão PBS muito diluídas (2 mM), para evitar alterações bruscas de pH durante a titulação.
  2. Medir o espectro de emissão da fluoresceína (488 nm, exc) e TMR (iva de 550 nm) e optimizar as configurações ópticas do fluorímetro para conseguir uma boa relação de sinal-para-ruído.
  3. Realizar uma titulação de pH pela adição de pequenas quantidades de NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N. Após cada adição agitar a cubapara misturar, esperar um minuto para o equilíbrio e medir o pH, por meio de um microeléctrodo de pH. Espectros de emissão de fluoresceína e TMR devem ser registradas para cada etapa, sem qualquer alteração nas configurações ópticas.
  4. Traça-se a intensidade de fluorescência vs pH para a titulação. O sinal de rodamina não deve ser afectada pelo pH (<10%). O sinal de fluoresceína deve ser uma curva sigmoidal e deve ser equipado com um modelo de ligação único com pK = 6,4.

3. Cultura Celular e Eletroporação

  1. Cultivar as células HeLa em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / mL de estreptomicina (Invitrogen). Manter a cultura das células a 37 ° C em atmosfera húmida 5% de CO2.
  2. Para dendrimer eletroporação, quando as células são confluentes, remova a mídia e lavar as células usando DPBS (fosfato de Dulbecco-Buffered Saline). Remover o DPBS e adicionar tripsina-EDTA. Neutralizar o Tryppecar pela adição de meio contendo soro, mas não antibióticos. Centrifugar a 900-1,200 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente. Remova a mídia e lavar as bolinhas usando DPBS.
  3. Contar as células e levar 4 * 10 6 células. Centrifugar a 1.200-1.500 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente.
  4. Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de tampão de formação de microporos (fornecido pelo fabricante de microporos) e transferência de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Adicionar solução aquosa de dendrímero em células ressuspensas. A quantidade de dendrímero é necessária por exemplo dependente do tipo de PAMAM (tipicamente de 250 nM para o catiónico e 2 uM de dendrímeros neutros).
  6. Adicionar tampão de electroporação (fornecido pelo fabricante de microporos) em um tubo de formação de microporos. Pipeta as células e os dendrímeros misturas com ponta eletroporação de volume de 100 mL de tamanho. Inserir a pipeta de microporos na estação pipeta. Defina a condição de pulso para formação de microporos: Tensão de pulso = 1.005 V; wid pulsoº = 35 ms; número pulso = 2.
  7. Após as células de transferência de impulsos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de centrífuga e as células durante 5 min a 1200 rpm para remover o excesso de dendrímero no meio. Placa 10 ml de células eletroporados Onto 35 milímetros pratos com fundo de vidro (Willco-prato GWSt-3522) com meio fresco w / o antibióticos.

4. Sensing pH em Viver Células HeLa

  1. Células de imagem com um microscópio confocal 12 horas após a eletroporação.
  2. Conjunto de filtros padrão para fluoresceína e rodamina podem ser usados. Se os filtros são ajustáveis ​​conjunto disponível um canal verde 500-550 nm e um canal vermelho de 580 nm a 650 nm. Excitação a 488 nm é óptimo para a fluoresceína, enquanto rodamina pode ser trabalhada, quer com a 543nm ou a linha de laser 561.
  3. Concentre-se na amostra e ajustar lasers e detectores de poder ganhar a maximizar a relação sinal-ruído. Se a electroporação foi células bem sucedidos devem ser fluorescentes brilhantes em ambos os canais. Olocalização depende do tamanho e da carga do dendrímero utilizado. Muitas vezes, algumas localizações lisossômico (pequenas vesículas perinuclear) está presente devido a endocitose ou compartimentalização. Se a localização lisossomal é predominante, isto é, a maior parte da fluorescência está localizada dentro de vesículas e sinal fraco é observado no citossol, isto significa toxicidade e medição deve ser descartado. Adquirir sequencialmente os dois canais, se necessário adquirir vários imagens e calcular a média das imagens para melhorar a qualidade da imagem.
  4. Para braçadeira de calibração de pH celular utilizando tampões com ionóforos a pH diferente e adquirir pelo menos 20 células por pH tal como descrito acima. Para uma descrição detalhada do procedimento e da composição dos buffers consulte Bizzarri e colegas de trabalho 16. Sugerimos para medir pelo menos 5 pontos de pH = 5,5 a pH = 7,5. pH inferior a 6 são tóxicos para as células, mas tolerada para curto espaço de tempo, sugerimos a aquisição das imagens o mais rápido possível. Se as célulasdemonstrar sinais de apoptose, descartar as pilhas e reinicie.
  5. Use ImageJ ou software similar para análise de dados. Importe as imagens do canal verde e vermelho, subtrair fundo e criar um pixel por pixel proporção de imagens com a ferramenta "calculadora de Imagem".
  6. Desenhe uma região de interesse (ROI) selecionar a célula desejada e medir a taxa de verde a vermelho-intracelular. Analisar todas as imagens adquiridas e, em seguida, traçar a proporção em relação ao pH. Na gama de 5,5-7,5 a tendência deve ser linear. O ajuste linear dos pontos obtidos dará a curva de calibração, que serão utilizados para converter proporção verde para vermelho para pH.
  7. Quanto mais controle adquirir várias células não tratadas (não ionóforos) e tentar calcular o pH com a curva de calibração obtida. Um valor entre 7.2 e 7.4 devem ser obtido.

5. In Vivo Preparação da Amostra

  1. Os experimentos foram realizados em C57Bl/6J (machos e fêmeas), entre pós-natal day 28 e 70. Anestesiados o rato com uma injecção intraperitoneal de uretano (isto é, acetato de carbamato) (20% w / v em solução salina fisiológica, 20 mg / kg de uretano). Os animais foram sacrificados após a experiência com uma dose excessiva de uretano seguido por uma injecção intracardíaca do mesmo anestésico.
  2. Realizar uma injecção intramuscular de fosfato sódico de dexametasona (2 mg / kg de peso corporal) para reduzir a resposta de stress cortical e edema cerebral durante a cirurgia.
  3. Raspar a cabeça do animal e aplicar gel de lidocaína 2,5% para o couro cabeludo.
  4. Use a tesoura para cortar o retalho de pele cobrindo o crânio de ambos os hemisférios
  5. Lave o osso exposto com soro fisiológico e retire cuidadosamente o periósteo com a pinça. Isto irá fornecer uma base melhor para cola e cimento dental para aderir com.
  6. Aplique uma cabeça poste de aço feitos sob medida com uma câmara de imagem central e cola-lo com cianoacrilato em um plano aproximadamente paralelo com o crânio sobre a região cortical de interest e corrigi-lo no lugar com cimento dental branco (Paladur).
  7. Fixe a cabeça do mouse, a fim de realizar uma craniotomia de 2-3 mm de diâmetro perfurado sobre a região de interesse.
  8. Tente minimizar o aquecimento do córtex durante a cirurgia, as lágrimas da dura-máter, ou sangramento.
  9. Manter o córtex superfundidas com ACSF estéril (NaCl 126 mM, KCl a 3 mM, 1,2 mM, KH 2 PO 4, 1,3 mM MgSO4, 26 mM de NaHCO 3, 2,4 mM de CaCl2, 15 mM de glicose, HEPES 1,2 mM em H2O destilada , pH = 7,4).

6. imaging pH no cérebro do rato

  1. Durante o experimento ajuda animais respiração fornecendo O ar 2-enriquecido. O oxigénio é enriquecido até 80%. O 2 pressão parcial eo fluxo é frequentemente ajustado para obter uma ajuda de respiração adequada. Manter constante a temperatura do corpo a 37 ° C com um cobertor de aquecimento controlado de feedback.
  2. Corrigir o animal através do poste de aço no âmbito do objectivo de um dois-fotoconfiguração de n imagens.
  3. A fim de injectar o sensor no córtex cerebral carregar uma pipeta de vidro contendo um AgCl (ponta de 4 mm de diâmetro) com a solução de dendrímero (1 uM). O eléctrodo permitirá a gravar os potenciais de campo extracelulares.
  4. Com uma configuração de microinjecção inserir a pipeta no córtex de aproximadamente 150 microns de dimensão. Injectar de 1-2 min a uma pressão de 0,5 psi.
  5. Otimizar a configuração óptica para imagens. Poder do laser deve ser ajustado para minimizar a fotodegradação e fotoenvelhecimento. Normalmente potência do laser empregado é de cerca de 20 mW e ganho PMT foi mantida constante em 667 V desde calibrações anteriores mostraram que esta tensão dá a melhor relação S / N.
  6. Para excitar o sensor de imagem a 820 nm e detectar simultaneamente a fluoresceína e rodamina fluorescência através de filtros FITC e TRITC normais.
  7. Para o tempo de medições resolvidos adquirir séries lapso de tempo entre 2 Hz.
  8. Para a correção de fundo adquirir um quadro escuro com a laser obturador fechado para medir o ruído térmico média resultante nas PMT eo pedestal geralmente adicionados pela eletrônica.
  9. Para análise dos dados seguem o mesmo procedimento relatado na seção 4.

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Representative Results

A Figura 1 mostra uma representação esquemática da conjugação de corantes para detectar diferentes andaimes dendríticas. Os indicadores resultantes podem ser obtidos num passo sintético fácil a partir de produtos disponíveis comercialmente. Os dendrímeros de rolamento-amina reagem com corantes NHS-activada em DMSO e purificada por meio de diálise. Este procedimento geral já foi usado com sucesso para a rotulagem de vários dendrímeros: i) geração dendrímero PAMAM 2, 4 e 6; 12 dendrímeros PAMAM peguilado 17 e híbridos PEG-dendríticas 18. Como dendrímeros distintas mostram diferentes interações com células e tecidos (localização, toxicidade, permeabilidade, difusão) a seleção da estrutura dendrítica está fortemente relacionada com a aplicação desejada e com o modelo de interesse.

Os sensores compreendem dois conjuntos de corantes fluorescentes: i) os indicadores de pH e ii) metades de pH-insensitive atuando como referências internas. AlthOugh uma grande variedade de indicadores e referências estão disponíveis, os melhores resultados foram obtidos com fluoresceína e tetrametilrodamina. A razão entre os dois corantes pode ser sintonizado simplesmente utilizando diferentes equivalentes molares na reacção. Figura 2 mostra uma titulação típico in vitro de um sensor de pH. A fluoresceína e rodamina podem ser excitados separadamente, a 488 nm e 550 nm, respectivamente, permitindo a conversa cruzada mínima entre os dois canais. Como pode ser claramente visto, a fluoresceína (Figura 2A) mostra um comportamento dependente do pH, enquanto a rodamina (Figura 2A) do sinal não se altera significativamente na gama de pH fisiológico. Portanto, a proporção destes dois sinais não depende da concentração do sensor, mas apenas no pH. Esta independência concentração será de grande importância para as medições biológicas como a concentração intracelular sonda não pode ser controlado.

Para medições de células vivas a intrentrega acelular dos sensores dendríticas é conseguido através de electroporação. Esta técnica é utilizada em biologia para a transfecção de ADN e pode ser aplicado com variações mínimas no protocolo do fabricante. Através de eletroporação, as macromoléculas podem ser entregues diretamente para o citoplasma, evitando qualquer complicação relacionada ao sistema vesicular de endocitose. Figura 3a mostra imagens confocal de células HeLa eletroporados com os sensores dendrímero. Um forte sinal em ambos fluoresceína (verde, à esquerda) e rodamina (vermelho, meio) é observada. Os dois sinais perfeitamente colocalize demonstrando a integridade da estrutura do sensor. Um mapa de medida proporcional é reconstruído através da divisão das duas imagens de pixel-a-pixel e representada com uma escala de pseudocores (Figura 3a, à direita). foi realizada com os ionóforos de fixação de pH, a fim de calibrar a resposta do sensor no interior das células. Calibração com ionóforos é um protocolo bem estabelecido, several protocolos têm sido extensivamente descritos e podem ser utilizados sem modificações. 19 Indicadores facilmente responder a um pH com uma alteração da relação de verde para vermelho, como mostrado na Figura 3b. Isto permitiu-nos obter uma curva de calibração (Figura 3-C) para medições de pH precisas. A tendência linear na calibração demonstra a capacidade de o sensor para responder ao pH, sem qualquer perturbação do ambiente celular. A curva de calibração foi usado para determinar o valor de pH de células HeLa que vivem em 7,4 e 4,8 para o citoplasma e lisossomas, respectivamente. Estes resultados estão de acordo com a literatura.

Finalmente, mostrou como sensores baseados em dendrímero pode ser empregue para imagiologia in vivo. Dendrímeros pode ser facilmente injectada através do tecido com um procedimento muito semelhante ao dos indicadores de cálcio amplamente utilizados. 20 Uma vez no tecido, os indicadores de difundir de forma extremamente lenta, allowing de imagem a longo prazo antes de drenagem tecido completa. Os resultados típicos são mostrados na Figura 4. Fluoresceína (verde) e rodamina sinais (vermelhas) foram obtidas simultaneamente com 820 nm de excitação e a proporção mapa foi construído numa base de pixel-a-pixel, similar ao vivo medições células. Notavelmente, os indicadores localizar no espaço extracelular, as áreas não-fluorescentes na imagem identificar corpos celulares ou pequenos vasos sanguíneos. A fim de verificar a resposta do sensor de pH, foi proposto o uso de hipercapnia. De facto, o dióxido de carbono é conhecido por alterar o equilíbrio dos buffers de carbonato no sangue e nos tecidos, o que resulta numa acidificação dos tecidos. 21 Tal como mostrado na Figura 4b, a inalação de 30% de CO 2 é suficiente para induzir uma resposta forte do sensor que é completamente reversível após a re-ventilação do mouse. Estes resultados demonstram o potencial de sensores baseados em dendrímero destacar fisiológico e paalterações patológicas de pH em células vivas e in vivo.

Figura 1
Figura 1. Síntese de sensores baseados em dendrímero representação esquemática do sensor de pH à base de dendrímero. O mesmo procedimento pode ser aplicado a praticamente todos os dendrímeros de amina-rolamento (esquerda). O produto foi obtido através de uma reação de conjugação única, seguido por diálise. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. In vitro titulação do pH para um sensor baseado em dendrímero. a) Resposta da fluoresceína indicador de pH e b) o ireferência nternal, rodamina, sem alteração na faixa de pH fisiológico.

Figura 3
Figura 3. Os resultados representativos de imagem pH em células HeLa vivendo. a) imagem confocal de fluoresceína canal (esquerda), canal de rodamina (meio) e pH mapa raciométrica (direita). b) calibração de pH com ionóforos. c) representativos mapas raciométrica de células fixada em pH diferente. . Reproduzido de Albertazzi L, M Brondi, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer Baseados Indicadores fluorescentes:.. In Vitro e In Vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

Figura 4
Figura 4. imagiologia de pH nocérebro de rato anestesiado. a) canal verde e vermelho (simultaneamente animado em 820 nm) e pH raciométrica mapa. b) resposta típica do sensor à hipercapnia (30% CO 2). Adaptado de:. Reproduzido de Albertazzi L, M Brondi, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer Baseados Indicadores fluorescentes:.. In Vitro e In Vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Clique aqui para ver maior figura .

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Discussion

Os passos críticos para imagiologia de pH bem sucedido com sensores à base de dendrímero são: i) a selecção do andaime dendrítica correcta e o número de indicadores conjugados com ele e ii) a optimização de um protocolo de entrega do sensor nas células ou in vivo.

O procedimento de síntese é relativamente fácil e pode ser aplicado virtualmente a qualquer polímero hiper-rolamento amina. Os sensores podem ser obtidos a partir de dendrímeros disponíveis comercialmente e corantes NHS-activada em um único passo. Nós acreditamos que este procedimento modular simples e será benéfica para a continuação da aplicação de tais sensores para uma variedade de questões biológicas. A purificação pode ser conseguida eficazmente por meio de diálise para remover os corantes não conjugadas. A seleção do andaime dendrítica é fundamental e depende da aplicação específica desejada. Diferentes dendrímeros demonstraram ter localizações particulares dentro das células, devido a interacções específicas com sestruturas ubcellular. Dendrímeros Neutro (por exemplo acetilado PAMAM G4) não mostram qualquer interação dentro das células e mostrar uma localização difusa. Assim, eles representam uma boa opção para uma imagem de células inteiras. Pelo contrário carregada positivamente dendrímeros de diferentes gerações (desde G2 para G6) interações eletrostáticas exibição com carga negativa biomoléculas (ou seja RNA), resultando em localização celular específica. Dendrímeros catiônicos são, portanto, ideal para imagens específicas da organela.

A escolha dos corantes de detecção é crítico. Vários indicadores de pH e corantes pH-insensitive com diferentes emissões de cor e H + afinidade (PK) estão disponíveis. Nós tentamos muitas combinações diferentes de corante e os melhores resultados foram obtidos com fluoresceína e tetrametilrodamina. Este par de proporcionar uma boa resposta ao pH no intervalo fisiológico (pKa = 6,4) e é compatível com as configurações de filtro vulgarmente usados ​​microscopia. Para diferentes requisitos, como medidas em diferentes faixa de pH, alguma otimização pode ser necessária. Notavelmente, nem todos os indicadores de manter as suas propriedades (brilho, PK) sobre dendrimer conjugação 5 Este comportamento depende tanto corante e estruturas dendrimer;. No entanto, fomos capazes de relatar vários indicadores onde as propriedades fotofísicas dos indicadores não são afetados significativamente. 17 Se for este o caso, sugerem a conjugação de corantes por meio de um ligante, a fim de minimizar as interacções dendrímero com corante. Vários corantes reactivos estão disponíveis comercialmente com espaçadores de alquilo 22 ou em ligantes de PEG alternativos podem ser usados. Além disso, o número de indicadores e a razão de indicadores para referência corantes sobre o andaime é importante. A proporção ideal depende da sensibilidade espectral da configuração microscopia utilizado e nas amostras biológicas de interesse 5,17. Embora pode ser necessária alguma solução de problemas, o processo de síntese muito fácil e rápido vai facilitar muito o processo. Finalmenteo grau de funcionalização do dendrímero, isto é, a percentagem de grupos terminais do dendrímero que são conjugados a corantes, poderiam influenciar os desempenhos dos indicadores. Para evitar qualquer problema de solubilidade sugerimos funcionalização cerca de 10% a 20% dos grupos terminais de dendrímero. No caso dos dendrímeros peguilados No entanto, devido à contribuição de PEG a solubilidade, uma funcionalização completa pode ser conseguida. Isso também pode limitar a presença indesejada de outros fenômenos de extinção entre os corantes conjugados e FRET.

Dendrímeros não são células-permeável, mas a entrega intracelular pode ser conseguida por meio de electroporação. Utilizou-se o protocolo do fabricante de ADN-transfecção da linha de células de interesse, sem outras modificações. Um parâmetro essencial é a concentração do dendrímero no tampão de electroporação, e em particular no caso de indicadores com fraca luminosidade ou dendrímeros que em concentrações elevadas poderia ser tóxico para as células. Low concentrations de dendrimer irá resultar em mau sinal no interior das células, enquanto altas concentrações irá causar toxicidade e induzir a morte celular. A concentração ideal depende do par dendrimer / indicador, bem como sobre a configuração de imagem disponível e pode precisar de alguma otimização. Se um electroporador não está disponível no laboratório, microinjeção poderia representar uma alternativa válida. No entanto, esta é uma técnica de uma única célula e vai fazer a aquisição de um número significativo de células a imagem de mais laborioso.

O procedimento de sensores de imagem é muito flexível e pode ser facilmente adaptado a várias configurações de microscopia. Nós previamente relatado o uso de sensores de acordo com um sistema confocal com filtros acusto-óptica sintonizável 5,17 mas padrão conjuntos de filtros FITC / TRITC também pode ser usado. Quando uma concentração intracelular ideal é obtido, imagiologia pH é simples. Sugerimos otimizando intensidade do laser, pinhole e detectores de ganhar por uma grande variedade de sensores intracelularconcentrações antes de executar a calibração de pH com ionóforos. Se a mesma configuração microscopia é utilizado sob as mesmas condições da calibração pode ser usado para todas as experiências. Aqui propomos imagem raciométrica para evitar dependência da concentração do sensor e artefatos. Outra metodologia interessante para conseguir isso é representado por sondas à base de toda a vida como elegantemente mostrou por Vinogradov e colegas de trabalho de 15 e ambas as opções de exibição de vantagens e desvantagens. Medições de tempo de vida que não requer qualquer correcção como são os procedimentos independentes de concentração e de calibração intrinsecamente são muitas vezes mais fácil e mais estável. Além disso, uma única cor é usado evitar as complicações e a possível aberração induzida pelo raciométrica imagem verde para vermelho. No entanto poucos sondas vida eficazes estão disponíveis, enquanto uma grande variedade de sondas à base de intensidade são comercialmente acessível. Os equipamentos necessários para a imagem latente raciométrica é mais simples e mais provável disponível em comoinstalação de microscopia tandard. Medições de tempo de vida Além disso são intrinsecamente lenta e não pode ser aplicado a seguir processos biológicos rápidos. Por conseguinte, a escolha entre estas duas técnicas depende fortemente da instrumentação disponível e no processo biológico de interesse específica.

Embora conceitualmente semelhante, imagem in vivo é mais desafiador do que na cultura de células. A relação sinal-ruído é reduzido por espalhamento e as interacções com os tecidos pode influenciar a resposta do sensor. Além disso, a difusão através do tecido e, assim, a fuga do indicador a partir da região de interesse representam um problema adicional não está presente para medições intracelulares em cultura. Por estas razões, a escolha do indicador é crucial. Enquanto para as medições intracelulares maioria dos dendrímeros funcionar perfeitamente (G4, G4-Ac, G6, híbridos PAMAM-PEG), para detecção in vivo recomendamos o uso de dendrímeros peguilado. 17 Indeed esta arquitectura é particularmente eficaz para este fim, por várias razões: i) o PEG aumentar o tamanho do dendrímero e reduz a fuga a partir do tecido; ii) o ligante de PEG minimiza a extinção resultante do corante-corante e tingem-dendrímero e interacções iii) o PEG protege os corantes do tecido evitando a perda de função frequentemente observada depois da injecção de tecido de sensores. A qualidade do sensor de pH depende fortemente da injecção com sucesso de uma quantidade suficiente de dendrímero no tecido. Quando isto for alcançado o procedimento de imagem e análise de dados são semelhantes ao que já foi relatado para a cultura de células. Esta é uma clara demonstração da eficácia do sensor in vivo e pode ser utilizado como um controlo interno de actividade indicadora antes de qualquer medição.

Acreditamos que estes resultados, juntamente com os procedimentos detalhados apresentados neste trabalho permitirá a aplicação de sensores baseados em dendrímero para destacar Physmudanças iological e patológicos de pH em células vivas e in vivo.

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Disclosures

Padrão: Autores têm nada a revelar.

Acknowledgments

Discussões úteis com Isja de Feijter e Matt Baker são reconhecido agradecimento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

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References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312, (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260, (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110, (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420, (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132, (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23, (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14, (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406, (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69, (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125, (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7, (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7, (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90, (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6, (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50, (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7, (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11, (7), 816-822 (2008).
  22. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. 11th, (2010).

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