كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

يوفر شبكية العين الفئران حديثي الولادة نموذجا الفسيولوجية تتميز كذلك من الأوعية الدموية، والذي يسمح التحقيقات عن دور الجينات المختلفة أو الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية في

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الأوعية الدموية هي عملية معقدة من جديد تشكيل الأوعية الدموية التي يحددها تنتشر الأوعية الدموية الجديدة من شبكة الأوعية الموجودة من قبل. الأوعية الدموية تلعب دورا رئيسيا ليس فقط في التطور الطبيعي للأعضاء وأنسجة، ولكن أيضا في كثير من الأمراض التي تشكل الأوعية الدموية هو dysregulated، مثل السرطان والعمى والأمراض الدماغية. في حياة الكبار، والأوعية الدموية هي هادئة عموما حتى الأوعية الدموية هو هدف هام لتطوير العقاقير الرواية في محاولة لتنظيم تشكيل السفينة الجديدة وتحديدا في المرض. من أجل فهم أفضل الأوعية الدموية، ووضع استراتيجيات ملائمة لتنظيم ذلك، يطلب من النماذج التي تعكس بدقة الخطوات البيولوجية المختلفة التي ينطوي عليها. يوفر شبكية العين حديثي الولادة الماوس نموذجا ممتازا من الأوعية الدموية بسبب الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية تطوير لتشكيل الضفيرة الوعائية خلال الأسبوع الأول بعد الولادة. يحتوي هذا النموذج أيضا الاستفادة من وجود اثنين من ديmensional (2D) هيكل صنع تحليل بسيط مقارنة مع التشريح المعقدة 3D من شبكات الأوعية الدموية الأخرى. من خلال تحليل الشبكية الوعائية الضفيرة في أوقات مختلفة بعد الولادة، فمن الممكن لمراقبة مراحل مختلفة من الأوعية الدموية تحت المجهر. توضح هذه المقالة إجراءات واضحة لتحليل الأوعية الدموية من شبكية العين باستخدام الماوس تلطيخ الفلورسنت مع الأجسام المضادة المحددة isolectin والأوعية الدموية.

Introduction

الأوعية الدموية هي عملية معقدة التنموية التي حددها تشكيل الأوعية الدموية الجديدة من شبكة الأوعية الموجودة مسبقا ويتم تنظيمها من قبل عدة مسارات الإشارات. وأبرز هذه هو الطريق VEGF. يتم تحريرها من قبل خلايا VEGF الدماغية ويؤدي إلى بدء عائية تنتشر في الأوعية الدموية المجاورة. الخلية البطانية الرائدة من الأوعية الدموية الجديدة تنبت هو 'غيض' الخلية، التي تنتج أرجل كاذبة خيطية التي تصل إلى نحو مصدر VEGF، وتبعتها تكاثر الخلايا البطانية "ساق". في هذه الطريقة، تنشيط الخلايا البطانية وتهاجر تتكاثر نحو المنطقة اوعائية حيث أنها تشكل أنابيب الأوعية الدموية الجديدة. من أجل تحقيق الاستقرار في هذه الأنابيب لدعم تدفق الدم، والخلايا البطانية التفاعل مع pericytes وخلايا العضلات الملساء، التي تحيط الأوعية الدموية الجديدة 1. تكوين الأوعية الدموية ضروري لالأوعية الدموية للجنين والأنسجة المتنامية. ومع ذلك، فإنه يساهم أيضا في العديد من pathologiاضطرابات كال مثل السرطان، في حين ترتبط عيوب في الأوعية الدموية مع الأمراض الدماغية. وبالتالي فإن تطوير علاجات فعالة المخدرات لتنظيم الأوعية الدموية كوسيلة لعلاج المرض هو من مصلحة كبيرة. على سبيل المثال، سوف العوامل المضادة للعائية فعالة لحد من نمو السرطان، في حين استراتيجيات الموالية للعائية يمكن أن تستخدم لعلاج الأمراض الدماغية. وهكذا، ونماذج من الأوعية الدموية ضرورية لفهم أفضل لتنظيم تشكيل سفينة جديدة وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة لتعزيز نمو الأوعية الدموية أو نقصان.

ومن العناصر الأساسية للبحث الأوعية الدموية هو اختيار نموذج الأوعية الدموية المناسبة. وقد تم العديد من نماذج في المختبر يهدف إلى إعادة إنتاج الخطوات الأساسية لتكوين الأوعية الدموية مثل هجرة الخلايا البطانية، وانتشار وبقاء 2،3. A المستخدمة بشكل متكرر في المختبر فحص هو تشكيل شبكة متفرعة من الخلايا البطانية على مصفوفة Matrigel، على الرغم من ربلاده ليست محددة لخلايا بطانة الأوعية الدموية، كما أنها لا تتضمن عادة بدعم من pericytes أو خلايا العضلات الملساء. تقييم تنتشر الأوعية الدموية خارج الجسم باستخدام الماوس ثقافة الجهاز مثل فحص الجسم مضغي الشكل، ومقايسة حلقة الأبهر وفحص مشط القدم الجنين يسمح للتحليل من الأوعية الدموية من الخلايا البطانية في سياق خلايا داعمة إضافية. ومع ذلك، فإن القيود الرئيسية من هذه المقايسات تشمل نقص تدفق الدم والانحدار من السفن على مر الزمن، وإعطاء نافذة محدودة للتحليل. لذلك، لفهم تنظيم الأوعية الدموية على نحو أدق، في النماذج الحية مطلوبة مثل تلك التي وضعت في الماوس باستخدام الإسفنج مزروع تحت الجلد أو المقابس matrigel، وكذلك هند أطرافهم نموذج نقص التروية. ومع ذلك، فإن هذه النماذج تشكل تحديا لتحليل ويرجع ذلك إلى بنية معقدة 3D من neovessels. في المقابل، فقد ثبت أن الجنين الزرد نموذجا ممتازا لتصور الأوعية الدموية في كاملالكائن الحي 4. ومع ذلك، فإن الفأر هو متعلق تطويريا أكثر من ذلك بكثير عن كثب إلى الإنسان من الزرد، مما يجعل الماوس على النموذج المفضل في كثير من الحالات. وبالتالي تكوين الأوعية الدموية في شبكية العين الماوس بعد الولادة يمثل طريقة تتسم جيدا من خيار للأبحاث الأوعية الدموية. لأنه لا يوفر بيئة الفسيولوجية، ولكن أيضا 2D الضفيرة الوعائية التي يمكن تصور بسهولة باستخدام البقع الفلورسنت المناسب. الهندسة المعمارية للشبكة سفينة، وانتشار البطانية، تبرعم، تجنيد خلية حول الأوعية وإعادة عرض السفينة يمكن لجميع يتم التحقيق باستخدام هذه التقنية.

في شبكية العين الماوس حديثي الولادة، وتطوير الأوعية الدموية في شبكية العين يحدث في الأسبوع الأول من الحياة بعد الولادة. الفئران، على عكس البشر، ولدوا مكفوفين وشبكية العين تصبح أوعية دموية فقط بعد الولادة. تنشأ الأوعية الشبكية من وسط إغلاق الشبكية إلى العصب البصري في يوم ما بعد الولادة 0 (P0)، وتطوير من قبل الأوعية الدموية لتشكيل تنظيم للغايةد الضفيرة الوعائية التي تصل إلى محيط الشبكية بنحو P8 5. الأوعية الدموية تطوير بطريقة مميزة مع الضفيرة الشعرية متزايد تدريجيا نحو الخارج من القرص البصري نحو المحيط الخارجي لتوليد نمط بالتناوب العادية من الشرايين والأوردة مع شبكة الشعرية التدخل. يوفر الأوعية الدموية في شبكية العين وهو نموذج مثالي لدراسة الأوعية الدموية والأوعية ويمكن التعرف عليها بسهولة لأنها تنمو في ما هو في الأساس طائرة 2D، مما يجعل من السهل نسبيا لفحص الأوعية الدموية في شبكية العين في الاستعدادات مسطحة جبل 5. وتم الإبلاغ عن طريقة لعزل شبكية العين الولدان الماوس لتحليل استجابات الخلايا البطانية طرف على مدى عدة ساعات خارج الجسم 6. بدلا من ذلك، تحقيقا أكثر تفصيلا من الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها وعلامات الأوعية الدموية المرتبطة بها يتطلب المناعية من العينات الشبكية الثابتة في مراحل مختلفة من التنمية.

هنا نقدموصفا مفصلا لطريقة موثوقة وتقنيا على التوالي إلى الأمام التي نستخدمها لكامل تلطيخ جبل من الفئران الشبكية الوعائية الضفيرة، من قلع الأولي من العين بعد الولادة (انظر أيضا 7) من خلال بروتوكولات تلطيخ إلى التصوير النهائية تحت المجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم يرد خلاف ذلك.

1. قلع والتثبيت من العيون بعد الولادة

  1. ضع مؤشر الفأرة قتل إنسانية الجرو على جانبها، وإزالة الجلد الذي يغطي العين مع مقص.
  2. استخدام مقص وملقط لاستأصل العين.
  3. مكان مقص تحت العين منزوعة النواة، وقطع العصب البصري والأنسجة المحيطة بها واخراج العين. نقل إلى لوحة 24 أيضا تحتوي على امتصاص العرق 4٪ (PFA) تتكون في 2X PBS في درجة حرارة الغرفة.
  4. تسمح كل عين لإصلاح لمدة 10 - 15 دقيقة، ثم نقل إلى 2X الباردة برنامج تلفزيوني على الجليد لمدة 5 - 10 دقيقة. فمن الأفضل لارباك enucleations والتثبيت لاحقة لضمان درجة من التثبيت تساوي لكل عين.

2. تشريح الفئران شبكية العين بعد الولادة

  1. عيون نقل إلى طبق بتري تحتوي على 2X PBS باستخدام ماصة باستير البلاستيك التي تم قطع لتوسيع الفتحة ومكان تحت ديسيهcting المجهر.
  2. إزالة أي دهون حول العين باستخدام ملقط ومقص.
  3. بيرس حافة القرنية مع مقص حاد وقطع حول القرنية والقزحية وتجاهل.
  4. إدراج ملقط بين شبكية العين والصلبة وإزالة الصلبة مع الحرص على عدم تمزق شبكية العين. ويمكن أيضا أن إزالة طبقة المشيمية، ولكن إذا كان هناك خطر من تلف في الشبكية التي تحدث خلال هذه الخطوة، يمكن أن تترك طبقة المشيمية على ما ينبغي أن لا تؤثر تأثيرا كبيرا على نوعية المناعية.
  5. إزالة العدسة والنكتة الزجاجي باستخدام ملقط.
  6. إزالة السفن hyaloids عن طريق جمع بعضهم البعض في وسط العين مع ملقط غرامة ثم سحب بسرعة بعيدا عن مركز الشبكية (بدلا من قص في قاعدة السفن الجسم الزجاجي مع مقص غرامة).
  7. شطف شبكية العين على شكل كوب مع برنامج تلفزيوني في طبق بيتري نظيفة.
  8. جعل 4-5 شقوق شعاعي التوصل إلى ما يقرب من 2/3 من دائرة نصف قطرها من شبكية العين باستخدام الربيع scissoRS لإنشاء شكل "البتلة".
  9. رسم قبالة PBS باستخدام ماصة باستور لشد شبكية العين، ثم قم بإزالة أي برنامج تلفزيوني الزائدة مع قطعة صغيرة من ورقة ماصة.
  10. ببطء ماصة البارد (-20 ° C) قطرة قطرة الميثانول على سطح شبكية العين حتى تغطيها تماما ثم الفيضانات مع الميثانول إضافية. هذا سوف يساعد على إصلاح شبكية العين وسيسهل permeabilization. سوف تتحول شبكية العين البيضاء.
  11. نقل إلى أنبوب مل 2 باستخدام ماصة باستير البلاستيك التي تم قطع لتوسيع الفتحة.
  12. ترك شبكية العين في الميثانول البارد لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الشروع في المناعية. من الأجسام المضادة المستخدمة هنا، لا يمكن أن تستخدم فقط VE كادهيرين بنجاح على شبكية العين الثابتة الميثانول. في هذه الحالة تحتاج إلى شبكية العين والمضي قدما على التوالي لالمناعية بعد الخطوة 9.
  13. إذا لزم الأمر، ويمكن تخزين شبكية العين في الميثانول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر قبل تلطيخ.

3. المناعية / تلطيخ isolectin من Vascu الشبكيةlature

  1. إزالة بعناية / صب قبالة الميثانول وشطف بلطف شبكية العين لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني (في هذه المرحلة شبكية العين لا يزال في نفس أنبوب 2 مل من الخطوة 11 أعلاه).
  2. إزالة برنامج تلفزيوني وتغطية شبكية العين مع 100 ميكرولتر من بيرم / كتلة الحل (PBS + 0.3٪ تريتون + 0.2٪ BSA) + 5٪ من المصل المناسب (انظر الجدول 1) ويهز بلطف لمدة 1 ساعة.
  3. إزالة بيرم / كتلة واحتضان شبكية العين مع لطيف تهتز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المحددة (انظر الجدول 1) و / أو IsolectinB4، جميع عن طريق تمييع في بيرم / كتلة استعداد.
  4. إزالة الأجسام المضادة / isolectin وغسل شبكية العين 4 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني + 0.3٪ تريتون (PBSTX).
  5. في بعض الحالات، على سبيل المثال تلطيخ التالية مع IsolectinB4-Alexa488 أو الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة، غير مطلوب الأجسام المضادة الثانوية، ويمكن تركيبه شبكية العين مباشرة (الخطوة 7). عندما تم استخدام الأجسام المضادة الأولية اللامقترن في الخطوة 3، ثم 100 ميكرولتر من فلور المناسبةيتم إضافة الأجسام المضادة الثانوية escent (مخفف 1/200 في PBSTX) وتترك لاحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل شبكية العين 4 × 15 دقيقة في 2 مل PBSTX.
  7. نقل شبكية العين على الشرائح باستخدام البلاستيك تتحمل واسعة باستور ماصة وإزالة الأنسجة الزائدة مع PBSTX ماصة لل. جبل شبكية العين عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من إطالة مرس على ساترة والموقف برفق فوق الشبكية.
  8. نقل الشرائح إلى الثلاجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وضمان أن تكون مسطحة ومحمية من الضوء، للسماح للإطالة مرس لتعيين.
  9. شبكية العين صورة باستخدام مجهر متحد البؤر المجهر أو epifluorescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد تشريح الشبكية يجب أن تبدو وكأنها زهرة شقة (الشكل 1). باستخدام بروتوكول، المشار إليها أعلاه، يمكن اعتبار الخلايا البطانية باستخدام isolectin تلطيخ B4-Alexa488 ودعم خلايا العضلات الوعائية هي تصور استخدام الألغام المضادة للأكتين العضلات الملساء ألفا (الشكل 2). وجهة النظر الطاقة المنخفضة باستخدام الهدف 5X في الشكل 2 يسمح لمحة عامة عن المنظمة الأوعية الدموية في شبكية العين. أيضا، باستخدام مجموعة مختلفة من الأجسام المضادة الواردة في البروتوكول أعلاه، يمكن اعتبار الخلايا البطانية استخدام الألغام المضادة للCD31 المناعية وينظر pericytes دعم باستخدام الأجسام المضادة ضد NG2 (الشكل 3) أو desmin (الشكل 4). تلطيخ المضادة للdesmin مفيد لتصور الاصبع مثل العمليات من pericytes وتحديد ما إذا كانت ترتبط بشكل وثيق مع الخلايا البطانية. في المقابل، تلطيخ المضادة للNG2 يحدد نوى كل خلية حوطية، وهو أمر مفيد عندماتحديد عدد الخلايا خلية حوطية على الأوعية الدموية. وسوف يتم ذلك من خلال إحصاء عدد الخلايا في مجال الرؤية باستخدام الطاقة العالية (مثل 60X) هدف. إذا لزم الأمر، تركيبات بديلة من الأجسام المضادة يمكن أن تستخدم أيضا (انظر الجدول 1)، على سبيل المثال، ومكافحة الكولاجين الرابع هو مفيد لتصور الغشاء القاعدي الأوعية الدموية. شبكية العين التي تم ملطخة عن الخلايا البطانية ويمكن تحليلها عن الملامح الرئيسية الأوعية الدموية مثل تطور الأوعية الدموية من مركز نحو حافة الشبكية، وكثافة الأوعية الدموية والأوعية تردد المتفرعة.

الشكل 1
الشكل 1. مظهر الشبكية حديثي الولادة مباشرة بعد تشريح وبالإضافة إلى ذلك من الميثانول. يتم أخذ هذه الصورة باستخدام زايس STEMI SV6 وAxiocam HR كاميرا ج.

الشكل 2
الشكل 2. المناعية من جبل بأكمله شبكية العين (العمر P7) مع Isolectin B4-Alexa488 (الأخضر) (A)، وتؤخذ مكافحة ألفا أكتين العضلات الملساء-CY3 (أحمر) (B) أو المدمجة (C). هذه الصور مع axioimager زايس و الكاميرا إدارة الموارد البشرية Axiocam باستخدام الهدف 5X. لاحظ نمط بالتناوب من الشرايين والأوردة. يتم التعرف على الشرايين عن طريق المنطقة الحرة الشعرية التي تحيط بهم على الفور، والمغلفة مع خلايا العضلات الملساء التي وصمة عار إيجابية (الحمراء) لسلسة ألفا أكتين العضلات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

load/50546/50546fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
الشكل 3 المناعية مزدوجة من جبل بأكمله شبكية العين (العمر P6) مع الأجسام المضادة الأولية مكافحة CD31 (الكشف مع مكافحة الفئران مفتش مترافق إلى Alexa488، أخضر، A)؛. والأجسام المضادة الأولية المضادة للNG2، الكشف مع المضادة للأرنب مفتش مترافق إلى اليكسا 594 (أحمر، B). وقد أخذت هذه الصور متحد البؤر باستخدام الهدف 60X الجمع بين المسح الصور ليزر من 13 Z شرائح، كل من سماكة 0.47 ميكرون. تراكب الصور في C تظهر الخلايا البطانية إيجابية CD31 (الخضراء) وpericytes إيجابية NG2 (الحمراء). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 4
الشكل 4 المناعية مزدوجة من جبل بأكمله شبكية العين (العمر P6) مع الأجسام المضادة الأولية مكافحة CD31 (الكشف مع مكافحة الفئران مفتش مترافق إلى Alexa488، أخضر، A)؛. والأجسام المضادة الأولية المضادة للdesmin، الكشف مع المضادة للأرنب مفتش مترافق إلى اليكسا 594 (أحمر، B). وقد أخذت هذه الصور متحد البؤر باستخدام الهدف 60X الجمع بين المسح الصور ليزر من 21 شرائح Z، كل من سماكة 0.24 ميكرون. تراكب الصور في C تظهر الخلايا البطانية إيجابية CD31 (الخضراء) وpericytes إيجابية desmin (الحمراء). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

<TD> بلوك بيرم فقط
الأجسام المضادة الأولية تخفيف العمل عرقلة الحل (المصل + بيرم / بلوك) الأجسام المضادة الثانوية
مكافحة NG2 (شوندرويتين كبريتات بروتيوغليكان) 1:250 مصل الماعز 5٪ الماعز المضادة أرنب اليكسا 594
مكافحة GFAP 1:500 مصل الماعز 5٪ الماعز المضادة الماوس اليكسا 488
مكافحة Desmin 1:500 مصل الماعز 5٪ الماعز المضادة أرنب اليكسا 594
مكافحة الكولاجين IV 1:200 مصل الماعز 5٪ الماعز المضادة أرنب اليكسا 594
مكافحة الإندوجلين الموجود 1:100 مصل الماعز 5٪ الماعز المضادة الفئران اليكسا 594
مكافحة CD31 1:500 مصل الماعز 5٪ الماعز المضادة الفئران اليكسا 488
مكافحة VE كادهيرين 01:10 مصل الماعز 5٪ الماعز المضادة الفئران اليكسا 594
مكافحة Alk1 01:25 5٪ المصل حمار حمار المضادة الماعز اليكسا 594
مكافحة ASMA-Cy5 1:100 N / A

الجدول 1. أمثلة على الأجسام المضادة الأولية لتلطيخ مناعي من شبكية العين كلها جبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا يوفر وسيلة بسيطة وفعالة للحصول على صور من التحضيرات الملون جبل بأكمله من شبكية العين الماوس حديثي الولادة، مما يجعلها نموذجا للقياس الكمي بسهولة وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من الأوعية الدموية. في البداية، يمكن للعين الماوس يكون من الصعب جدا لتشريح نظرا لصغر حجم وشكل العالم، لذلك هناك حاجة لبعض الممارسات وأدوات تشريح جيد للنتائج موثوقة. تشريح عيون أعدت في تركيز 2X من برنامج تلفزيوني مهم لأن هذا يؤدي إلى كمية صغيرة من فقدان الماء من العين ويقلل من الضغط داخل المداري، مما يسهل تشريح. التحضير الجيد للشبكية مهم لعدة أسباب. لأول مرة يحافظ على سلامة الأوعية الدموية. ثانيا، إذا لم يتم إزالة الجسم الزجاجي الأوعية الدموية جيدا أنه يقلل من كفاءة تلوين الأجسام المضادة، مما يؤدي إلى مستويات عالية من خلفية وانخفضت القرار. قد تحدث هذه المشكلة أيضا إذا كان الوقت تثبيت PFA من شبكية العين طويل جدا. ومع ذلك،قبل تلطيخ والتخزين على المدى الطويل تصل إلى عدة شهور في الميثانول في الفريزر -20 درجة مئوية مناسبة قبل تلطيخ isolectin وبالنسبة لمعظم الأجسام المضادة في الجدول 1. على الرغم من تلطيخ isolectin نادرا ما يكون مشكلة، فإنه لا الضامة وصمة عار بالإضافة إلى الخلايا البطانية. لالمناعية جيدة من جبل بأكمله شبكية العين، واختيار من الأجسام المضادة أمر بالغ الأهمية، ويجب أن تتكيف بروتوكول تلطيخ وفقا لخصوصية الأجسام المضادة وتركيز، والتي قد تختلف بين دفعات عندما تستخدم الأجسام المضادة. وعادة ما يمكن أن تخفض خلفية عالية عن طريق خفض تركيز الأجسام المضادة، وزيادة وقت غسل أو إضافة المزيد من المنظفات لغسل الخطوات. يتم aliquoted الأجسام المضادة لدى وصوله وتخزينها على النحو المشار إليه من قبل الشركة المصنعة. لتلك التي يتم تخزينها في -20 درجة مئوية، ويتم الاحتفاظ قسامة العمل في الثلاجة لتجنب دورات متكررة من تجميد ذوبان الجليد. إذا تظهر بقع الفلورسنت الساطع على عينة الملون، خاصة إذا كان هذا موجود أيضافي المنطقة المحيطة الأنسجة، وهذا يشير إلى المجاميع عجلت من الأجسام المضادة موجودة التي ينبغي إزالتها في جميع التجارب اللاحقة بواسطة الطرد المركزي الأجسام المضادة ل 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام. بعض الأجسام المضادة المستخدمة حاليا من قبل مختبرات لدينا هي في لائحة المواد مع التخفيف المناسبة (الجدول 1). اختيار مزيج من الأجسام المضادة متوافقة مهم جدا لتجنب رد فعل غير مرغوب فيها عبر بين الأجسام المضادة الأولية والثانوية. انتشار الخلايا يمكن رصدها عن طريق حقن الفئران بمحلول مكون من BrdU ما يقرب من ساعتين قبل حصاد الأنسجة. يتم دمج هذه التماثلية الثايمين إلى تكاثر الحمض النووي ويمكن الكشف باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة BrdU محددة، كما هو موضح سابقا 8.

كل شبكية العين هي هشة للغاية، ولكن يمكن أن تكون ملطخة عن علامات الأوعية الدموية المختلفة عن طريق معالجة الأنسجة بلطف بينما تعمل من خلال بروتوكول. وهناك عدد من الضوابط فيكل تجربة لإظهار خصوصية تلطيخ. سوف شبكية العين دون علاج تكشف عن درجة من تألق ذاتي في الأنسجة، والتي ينبغي أن تكون ضئيلة. وسوف أي سيطرة الأجسام المضادة الأولية تسمح تحديد غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة الثانوية للأنسجة. يمكن شبكية العين التي تمزقت بطريق الخطأ أثناء تشريح الأنسجة مفيدة لتوفير الضوابط. بعد تصاعد مستمر، ويتم الاحتفاظ تلطيخ الفلورسنت لعدة أيام طالما يتم تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية في الظلام. تم تحسين التصوير بواسطة المجهر epifluorescent عن طريق استخدام لapotome، الذي يزيل من ضوء التركيز. بدلا من ذلك، الفحص المجهري متحد البؤر يوفر دقة التصوير خلية محددة (الشكلان 3 و 4).

هذه الطريقة لها العديد من التطبيقات الممكنة. ويمكن تطبيقه على الفئران التي تنضب الجينات الرئيسية التي تنظم الأوعية الدموية، بما في ذلك العمل الذي يستخدم محرض جنة المساواة العرقية، loxP الوراثة 8-10. وبدلا من الأوعية الدموية في شبكية العين يمكن أن تكونتسليم علاجات دوائية التالية استجوابه إما بشكل منتظم أو داخل ocularly للتحقيق الموالية أو المعارضة عائية آثارها 11. ومن الممكن أيضا للاستفادة من الأدوات المتاحة المعدلة وراثيا واستخدام GFP أو طلب تقديم العروض الفئران المعدلة وراثيا لتصور العناصر الرئيسية في الأوعية الدموية في شبكية العين 11،12. (لاحظ أن تثبيت باستخدام PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ويستخدم في مكان من الميثانول للخطوة 2.12 من البروتوكول قبل التصوير الذاتية GFP أو طلب تقديم العروض في شبكية العين من الفئران المعدلة وراثيا.) وعلاوة على ذلك، من أجل دراسة الإشارات الجزيئية آليات، فمن المفيد أن تصور التعبير مرنا من جينات معينة في الضفيرة شبكية العين باستخدام التهجين في الموقع 13 في.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست ومؤسسة القلب البريطانية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics