혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색

Neuroscience

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Summary

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을 제공합니다

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Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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Abstract

혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 발아에 의해 정의 된 새로운 혈관 형성의 복잡한 과정이다. 혈관 신생은 암, 실명 및 허혈성 질환 등의 혈관 형성 dysregulated되는 많은 질병, 또한뿐만 아니라 장기 및 조직의 정상적인 발달에 중요한 역할을하지만. 혈관 질병에 특히 새로운 혈관 형성을 시도하고 조절하는 새로운 약물 개발을위한 중요한 목표 그래서 성인 생활에, 혈관은 일반적으로 정지합니다. 더 나은 혈관을 이해하고이를 조절하는 적절한 전략을 개발하기 위해 모델은 정확하게 관련된 다른 생물학적 단계를 반영해야합니다. 동맥, 정맥 및 모세 혈관이 출생 후 첫 주 동안 혈관 신경 얼기를 형성하기 위해 개발 때문에 마우스 신생아 망막 혈관의 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한이 모델은 두 디를 갖는 장점이있다mensional (2D) 구조는 다른 혈관 네트워크의 복잡한 3D 해부학에 비해 간단하게 분석을하고. 출생 후 다른 시간에 망막 혈관 신경 얼기를 분석하여, 그것은 현미경으로 혈관의 여러 단계를 관찰 할 수 있습니다. 이 문서 isolectin 혈관 특정 항체와 형광 염색법을 사용하여 마우스 망막의 혈관을 분석 간단한 절차를 보여줍니다.

Introduction

혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 형성에 의해 정의 된 여러 신호 전달 경로에 의해 조절되는 복잡한 발달 과정입니다. 이들 중 가장 눈에 띄는 VEGF 경로입니다. VEGF는 주변 혈관의 싹이 혈관의 개시에 허혈성 세포와 리드에 의해 발표된다. 새싹 새 혈관에서 선도적 인 내피 세포는 VEGF의 근원을 향해 밖으로 도달하는 filopodia를 생산하는 '팁'세포이며, '줄기'내피 세포 증식옵니다. 이러한 방법으로, 활성화 된 내피 세포는 마이그레이션하고 새로운 혈관 튜브를 형성하는 곳 무혈성 지역으로 확산. 혈액의 흐름을 지원하기 위해 이러한 튜브를 안정화하기 위해, 내피 세포는 혈관 주위 세포와 새로운 혈관 1 서라운드 평활근 세포와 상호 작용합니다. 혈관은 태아 성장 조직의 혈관을 위해 필수적이다. 그러나, 그것은 또한 많은 pathologi에 기여암과 같은 칼 장애, 혈관의 결함은 허혈성 질환과 관련된 반면. 질병을 치료하는 수단으로 혈관 신생을 조절하는 효과적인 약물 치료의 개발은 큰 관심을 따라서이다. 예를 들어, 효과적인 안티 - 혈관 요인은 암의 성장을 줄일 프로 혈관 전략 허혈성 질환을 치료하는 데 사용할 수있는 반면됩니다. 따라서, 혈관의 모델은 더 나은 새로운 혈관 형성과 혈관 성장을 강화하거나 줄일 수있는 새로운 치료 전략을 개발하기위한 규정을 이해하는 것이 필수적입니다.

혈관 연구의 기본적인 요소는 적절한 혈관 모델의 선택입니다. 체외 모델의 대부분은 이러한 내피 세포의 이동, 증식과 생존 2,3 등 혈관의 기본 단계를 재현하기 위해 설계되었습니다. 자주 생체 분석에 사용되는이 있지만 t, 리겔 행렬에 내피 세포의 분기 네트워크의 형성이다자신은 내피 세포의 특정 아니며, 일반적으로 혈관 주위 세포 나 평활근 세포의 지원을 통합 않습니다. 이러한 배아 신체 분석, 대동맥 링 분석 및 태아 중족골 분석으로 마우스 오르간 문화를 사용하여 전직 생체 돋아 혈관의 평가는 추가 지원 세포의 맥락에서 내피 세포의 혈관 신생의 분석을 할 수 있습니다. 그러나 이러한 분석의 주요 한계 분석을 위해 제한된 창을주고, 혈액 흐름의 부족으로 시간이 지남에 혈관의 회귀 (가) 있습니다. 따라서, 더 정확하게 혈관 신생의 조절을 이해하고, 생체 내 모델뿐만 아니라 뒷다리 허혈 모델로, 같은 피하 이식 스폰지 또는 Matrigel의 플러그를 사용하여 마우스를 개발 한 것과 필요합니다. 그러나 이러한 모델은 neovessels의 복잡한 3 차원 구조에 의한 분석하기 위해 도전하고 있습니다. 반면에, 제브라 피쉬 배아 전체에 시각화 혈관을위한 훌륭한 모델을 입증했다생물 4. 그러나 마우스는 마우스 많은 경우에 선호하는 모델을 만들고, 진화 훨씬 더 밀접하게 제브라보다 인간에 관한 것입니다. 따라서 출생 후 마우스 망막의 혈관은 혈관 연구를위한 선택의 잘 특성화 방법을 나타냅니다. 그것은 생리적 설정뿐만 아니라 쉽게 적절한 형광 얼룩을 사용하여 시각화 할 수있는 2D 혈관 얼기도 제공한다. 혈관 네트워크 내피 세포 증식, 발아​​, 혈관 주위 세포의 모집 및 혈관 리모델링의 구조는이 모든 기술을 사용하여 조사 할 수 있습니다.

신생아 마우스 망막, 망막 혈관의 발달은 출생 인생의 첫 주에 발생합니다. 마우스는 인간과는 달리, 블라인드 태어나 망막은 출생 후 혈관됩니다. 망막 혈관이 출생 후의 일 0 (P0)에서 시신경 망막 주변의 중앙에서 발생하고, 매우 조직 형성하는 혈관에 의해 개발약 P8 5에 의해 망막 주변부에 도달 D 혈관 신경 얼기. 혈관은 모세 혈관 따위가 점차 개입 모세관 네트워크 동맥과 정맥의 정기 교류 패턴을 생성하는 주변을 향해 광학 디스크에서 바깥쪽으로 성장 특성 방식으로 개발할 수 있습니다. 망막 혈관 따라서 비교적 쉽게 평면 마운트 준비 5 망막 혈관을 검사하고, 그들은 본질적으로 2D 평면 무엇에 성장 혈관이 쉽게 식별 할 수있는 혈관을 연구하는 이상적인 모델을 제공합니다. 몇 시간 전 생체에 내피 팁 세포 반응의 분석을 위해 마우스 신생아 망막을 분리하는 방법은 6보고되었습니다. 또한, 전체 망막 혈관과 관련 혈관 마커에 대한 자세한 조사 개발의 다른 단계에서 고정 망막 표본의 면역 염색이 필요합니다.

여기에 우리가 제공하는우리는 현미경으로 최종 이미지에 얼룩 프로토콜을 통해 (도 7 참조) 출생 후 아이의 초기 적출술에서 쥐 망막 혈관 신경 얼기의 전체 마운트 염색에 사용하는 신뢰할 수 있고 기술적으로 곧장 앞으로 방법에 대한 자세한 설명.

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Protocol

달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 상온에서 수행됩니다.

1. 출생 후의 눈의 안구 적출술 및 고정

  1. 옆에 강아지 인도적 사망 마우스를 놓고 가위로 눈을 덮고있는 피부를 제거합니다.
  2. 눈을 명백히 가위와 집게를 사용합니다.
  3. 탈핵 눈 아래 장소 가위는 시신경과 주변 조직을 잘라 눈을 밖으로 들어 올립니다. 실온에서 2 배 PBS에서 만든 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 전송할 수 있습니다.
  4. 각각의 눈은 10 수정 할 수 있습니다 - 10 분 - 15 분 후, 5 얼음 차가운 배 PBS로 전송할 수 있습니다. 그것은 고정의 정도가 각각의 눈에 대한 동일한지 확인 enucleations 및 후속 고정을 엇갈리게하는 것이 좋습니다.

2. 출생 쥐과 망막의 해부

  1. 2X PBS를 포함하는 페트리 접시에 전송 눈들이 상자 아래에 구멍과 장소를 넓혀 절단 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여현미경을 cting.
  2. 집게와 가위를 사용하여 눈 주위 모든 지방을 제거합니다.
  3. 피어스 날카로운 가위로 각막의 가장자리와 각막과 홍채 및 폐기 주위를 잘라.
  4. 망막과 공막 사이에 집게를 삽입하고 망막을 찢어지지 않도록주의하면서 공막를 제거합니다. 맥락막 층도 제거 할 수 있지만,이 단계에서 발생하는 망막 손상의 위험이있을 경우, 맥락막 층은 크게 면역 염색의 품질에 영향을 미치지 않아야로에 남아있을 수 있습니다.
  5. 렌즈와 집게를 사용하여 유리체 유머를 제거합니다.
  6. 미세 집게로 눈의 중앙에 그들을 함께 수집하여 hyaloids 혈관을 제거 후 신속하게 망막의 중심 (또는 미세 가위로 유리체 혈관의 기지에서 싹둑)에서 멀리 당기십시오.
  7. 깨끗한 페트리 접시에서 PBS와 컵 모양의 망막을 씻어.
  8. 봄 scisso를 사용하여 망막의 반지름의 약 2 / 3에 도달 4 ~ 5 방사상 절개를 만들기RS는 '꽃잎'모양을 만들 수 있습니다.
  9. PBS는 망막을 평평하게 파스퇴르 피펫을 사용하고 흡수성 종이의 작은 조각으로 초과 PBS를 제거 꺼립니다.
  10. 천천히 피펫 추위 (-20 ° C) 망막의 표면에 놓기로 메탄올 드롭 완전히 추가 메탄올로 다음 홍수 덮여 때까지. 이 망막을 고정하고 permeabilization을 용이하게하는 데 도움이됩니다. 망막은 흰색으로 바뀝니다.
  11. 구멍을 넓혀 절단 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 2 ㎖ 튜브에 옮긴다.
  12. 면역 염색을 진행하기 전에 적어도 20 분 동안 차가운 메탄올 망막을 남겨주세요. 여기에 사용 된 항체의 단지 VE-cadherin의 메탄올 고정 망막에서 성공적으로 사용할 수 없습니다. 이 경우 망막 9 단계 후 면역 염색으로 바로 진행해야합니다.
  13. 필요한 경우 최대 전에 염색을 몇 개월에 대해, 망막은 -20 ° C에서 메탄올에 저장할 수 있습니다.

3. 면역 / 망막 Vascu의 isolectin 염색lature

  1. 조심스럽게 제거 / 메탄올을 넣어 부드럽게 (이 단계에서 망막 위의 단계 11에서 동일한 2 ㎖ 튜브에 아직도있다) PBS에서 간단히 망막을 씻어.
  2. 파마 / 차단 솔루션을 100 μL와 PBS와 커버 망막을 제거 (PBS + 0.3 % 트리톤 + 0.2 % BSA) + 5 적절한 혈청 % (표 1 참조), 1 시간 동안 가볍게 흔 듭니다.
  3. 부드러운 4에서 하룻밤 흔들어 ° C 100 선택한 기본 항체의 μL (표 1 참조) 및 / 또는 IsolectinB4, 파마 / 블록에 희석하여 준비 모두와 함께와 망막을 차단하고 배양 / 파마 제거합니다.
  4. 항체 / isolectin를 제거하고 망막 4 씻어 PBS에서 x 10 분 + 0.3 % 트리톤 (PBSTX).
  5. 어떤 경우에는, IsolectinB4-Alexa488 또는 직접 복합 일차 항체로 예를 들면 다음과 염색, 이차 항체는 필요하지 않습니다 및 망막 (7 단계)에 직접 장착 할 수 있습니다. 접합 일차 항체은 해당 플 루어 100 μL 다음 3 단계에서 사용되었을 때escent 이차 항체 (PBSTX에서 1 / 200 희석)을 첨가하고 4 ℃ 실온에서 4 시간 동안 밤새 품어 남아 있습니다.
  6. 이차 항체를 제거하고 2 ㎖ PBSTX에서 망막 4 X 15 분 씻으십시오.
  7. 넓은 구멍 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드에 망막을 전송하고 흡수성 티슈로 여분의 PBSTX를 제거합니다. 50 μl를 추가하여 마운트 망막은 망막에 coverslip을 부드럽게 위치에 mountant을 연장.
  8. 전송 그들은 연장 mountant 설정 할 수 있도록 평평하고 빛으로부터 보호 될 수 있도록, 4 ° C에서 하룻밤 냉장고에 슬라이드.
  9. 이미지 망막 공 촛점 현미경 또는 epifluorescence에 현미경을 사용.

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Representative Results

절개 후 망막 평면 꽃 (그림 1)과 같다. 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 내피 세포는 안티 - 알파 평활근 액틴 (그림 2)를 사용하여 시각화하는 isolectin B4-Alexa488 염색을 사용하여 혈관 근육 세포를 지원 볼 수 있습니다. 그림 2에서 5 배 목표를 사용하여 저전력보기는 망막의 혈관 조직의 개요를 할 수 있습니다. 또한, 위의 프로토콜에 주어진 항체의 다른 조합을 사용하여, 내피 세포는 항-CD31 면역 염색 및 지원 혈관 주위 세포가 NG2 (그림 3) 또는 최근 desmin (그림 4)에 대한 항체를 사용하여 볼 수를 사용하여 볼 수 있습니다. 반대로 최근 desmin 염색은 혈관 주위 세포의 과정처럼 손가락을 시각화하고 밀접 내피 세포와 연결되어 있는지 여부를 확인하는 데 유용합니다. 반면에, 반대로 NG2 염색 할 때 유용합니다, 각 혈관 주위 세포의 핵을 설명혈관에 혈관 주위 세포의 수를 정량화. 이것은 높은 전력 (예 : 60X) 목표를 사용하여 시야 당 세포의 수를 계산하여 수행 할 수있다. 필요한 경우, 항체의 다른 조합은 (표 1 참조)를 사용할 수 있습니다, 예를 들어, 안티 - 콜라겐 IV는 혈관 기저막을 시각화하는 데 유용합니다. 내피 세포에 대한 염색 된 망막은 이러한 망막의 가장자리쪽으로 센터, 혈관 밀도와 혈관 분기 주파수에서 혈관의 진행으로 혈관의 주요 기능을 분석 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 즉시 절개와 메탄올을 첨가 한 후 신생아 망막의 외관.이 이미지는 자이스 STEMI SV6 및 Axiocam HR을 사용하여 촬영합니다 C 카메라.

그림 2
그림 2. Isolectin B4-Alexa488 (녹색) (A)와 전체 마운트 망막 (나이 P7)의 면역 염색, 안티 - 알파 평활근 액틴 CY3 (빨강) (B) 또는 병합 (C). 이러한 이미지는 자이스 axioimager로 촬영하고 있습니다 배 목표를 사용하여 Axiocam HRM 카메라. 동맥과 정맥의 교류 패턴을합니다. 동맥은 즉시 그들을 둘러싸고있는 모세 혈관 자유 지역으로 인식되고, 알파 평활근 액틴을 위해 (적색) 긍정적 인 얼룩 평활근 세포로 코팅되어 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 3 항 CD31 일차 항체 (Alexa488에 복합 백신 쥐 IgG의, 녹색,로 발견)와 함께 전체 마운트 망막 (P6 나이)의 이중 면역 염색;.에 안티 - 토끼 IgG의 결합으로 탐지 및 방지 NG2 일차 항체 알렉사 594 (빨강, B). 이 공 촛점 이미지는 13 Z 슬라이스, 0.47 μm의 두께에서 각각 레이저 스캔 이미지를 결합 60X 목표를 사용하여 촬영 하였다. C에서 이미지의 오버레이는 CD31 양성 내피 세포 (녹색)와 NG2 양성 혈관 주위 세포 (적색)를 보여줍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4
그림 4 항 CD31 일차 항체 (Alexa488에 복합 백신 쥐 IgG의, 녹색,로 발견)와 함께 전체 마운트 망막 (P6 나이)의 이중 면역 염색;.에 안티 - 토끼 IgG의 결합으로 감지 및 안티 - 최근 desmin 일차 항체 알렉사 594 (빨강, B). 이 공 촛점 이미지는 21 Z 슬라이스, 0.24 μm의 두께에서 각각 레이저 스캔 이미지를 결합 60X 목표를 사용하여 촬영 하였다. C에서 이미지의 오버레이는 CD31 양성 내피 세포 (녹색)와 최근 desmin 양성 혈관 주위 세포 (적색)를 보여줍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

<TD는> 파마 블록 만
일차 항체 희석 작업 차단 용액 (세럼 + 파마 / 블록) 이차 항체
안티 - NG2 (콘드로이틴 황산 프로테오글리칸) 1:250 5 % 염소 혈청 염소 항 토끼 알렉사 594
안티 GFAP 1:500 5 % 염소 혈청 염소 항 마우스 알렉사 488
안티 - 최근 desmin 1:500 5 % 염소 혈청 염소 항 토끼 알렉사 594
안티 - 콜라겐 IV 1:200 5 % 염소 혈청 염소 항 토끼 알렉사 594
안티 - Endoglin 1:100 5 % 염소 혈청 염소 안티 쥐 알렉사 594
안티 CD31 1:500 5 % 염소 혈청 염소 안티 쥐 알렉사 488
안티 - VE-cadherin의 1시 10분 5 % 염소 혈청 염소 안티 쥐 알렉사 594
안티 - Alk1 1시 25분 5 % 당나귀 혈청 당나귀 방지 염소 알렉사 594
안티 ASMA-Cy5에 1:100 N / A

표 1. 전체 마운트 망막의 면역 형광 염색을위한 일차 항체의 예.

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Discussion

여기에 제시된 방법은 혈관의 쉽게 정량화 및 생리학 관련 모델을 만들고, 신생아 마우스 망막의 스테인드 전체 마운트 준비의 이미지를 얻을 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 처음에는 마우스 아이는 작은 크기와 지구본 모양으로 인해 해부하는 것은 매우 어려울 수 있습니다, 연습과 좋은 해부 도구는 신뢰할 수있는 결과를 위해 필요하므로. 이 눈에서 물 손실 소량의 원인과 절개를 용이하게 내부 궤도 압력을 줄일 수 있기 때문에 PBS의 2 배 농도에서 제조 된 눈의 해부 중요하다. 망막의 좋은 준비는 여러 가지 이유로 중요합니다. 첫째는 혈관의 무결성을 유지합니다. 유리체의 혈관이 잘 제거되지 않은 경우 둘째, 배경의 높은 수준에 이르는, 항체 염색법의 효율성을 줄이고 해상도를 감소. 망막의 PFA 고정 시간이 너무 긴 경우이 문제가 발생할 수 있습니다. 하지만,이전의 염색에, -20 ° C의 냉동고에 메탄올 몇 개월 장기 저장을 위로 이전 isolectin 염색을 표 1에 항체 가장 적합합니다. isolectin 염색이 거의 문제가 있지만, 그것은 내피 세포 외에 얼룩 식세포 않습니다. 전체 마운트 망막의 좋은 면역 염색에 대한 항체의 선택은 중요하며, 염색 프로토콜은 클론 항체를 사용할 때 일괄 처리 사이에 차이가있을 수 있습니다 항체 특이성과 농도에 따라 적응해야합니다. 높은 배경은 일반적으로 항체 농도를 낮추는 세척 시간을 늘리거나 세척 단계에 더 많은 세제를 추가로 줄일 수 있습니다. 제조자에 의해 표시된 항체는 도착 분주 및 저장됩니다. -20 ° C에서 보관되는 사람들을 위해, 작업 나누어지는이 해동 동결의 반복주기를 방지하기 위해 냉장고에 보관됩니다. 밝은 형광 반점, 염색 시료에 특히 나타나면이 또한 존재조직 주변 지역에서,이 항체 침전 집계 사용하기 전에 5 분 동안 10,000 RPM에 대한 항체를 원심 분리하여 이후의 모든 실험에서 제거되어야 할 존재 좋습니다. 현재 우리 실험실에서 사용되는 항체의 일부는 적절한 희석 (표 1) 자료 목록에 있습니다. 항체의 호환 조합을 선택하면 기본 및 보조 항체 사이의 불필요한 교차 반응을 방지하기 위해 매우 중요합니다. 세포 증식 전에 조직을 수확하는 BrdU의 약 2 시간의 솔루션으로 쥐를 주입하여 모니터링 할 수 있습니다. 이 티민의 아날로그는 DNA 증식에 포함되어 있으며 이전 8 설명한대로 특정 항 BrdU의 항체를 사용하여 검색 할 수 있습니다.

각각의 망막은 매우 취약하지만, 프로토콜을 통해 작업하는 동안 부드럽게 조직을 처리하여 다른 혈관 마커 물들 일 수 있습니다. 컨트롤의 번호가 포함되어 있습니다각 실험은 염색의 특이성을 보여줍니다. 치료 망막 최소화해야 조직의자가 형광의 정도를 보여줄 것입니다. 일차 항체 제어 아무 조직에 이차 항체의 비 특정 바인딩의 결정을 허용하지 않습니다. 실수로 해부하는 동안 찢어진 된 망막 컨트롤에 유용하게 조직을 제공 할 수 있습니다. 슬라이드 어둠 속에서 4 ° C에 저장되므로 설치 후, 형광 염색만큼 며칠 동안 유지됩니다. epifluorescent 현미경으로 이미지 초점이 빛을 밖으로 제거 apotome의 사용에 의해 향상됩니다. 또는 공 촛점 현미경 정확한 세포 특정 이미징 (그림 3, 4)를 제공합니다.

이 방법은 여러 가지 응용 프로그램을하고 있습니다. 그것은 혈관을 조절 키 유전자 크레-loxP 유전자 8-10 유도를 사용하는 작업을 포함 고갈 된 마우스에 적용 할 수 있습니다. 또는 망막 혈관 신생이 될 수 있습니다심문 다음과 같은 약물 치료는 직업 또는 항 혈관 신생 효과 11를 조사하기 위해 하나 체계적으로 또는 내부 ocularly 전달했다. 그것은 가능한 유전자 변형 도구를 활용하고 망막 혈관 11,12의 핵심 요소를 시각화하는 GFP 또는 RFP 형질 전환 마우스를 사용하는 것도 가능하다. (실온에서 1 시간 동안 PBS에 4 % PFA를 사용하여 고정은 사전에 형질 전환 생쥐에서 이미지 내생 GFP 또는 망막 RFP에 대한 프로토콜의 단계 2.12 메탄올 대신 사용합니다.) 또한, 분자 신호를 연구하기 위해 메커니즘, 그것은 현장 하이브리드 화 13를 사용하여 망막 신경 얼기에있는 특정 유전자의 발현을 시각화하는 데 유용합니다.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 Wellcome 트러스트와 영국 심장 재단에 의해 후원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
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Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

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